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RESEARCH ON THE MECHANISM OF PENICILLIN INDUCTION OF α AMYLASE BIOSYNTHESIS IN WHEAT ENDOSPERM

青霉素促进小麦胚乳α-淀粉酶合成机理初探



全 文 :青霉素促进小麦胚乳α2淀粉酶
合成机理初探  
白先权
(中国热带农业科学院农业部热带作物栽培生理学重点实验室 儋州 571737)
王楚桃 刘大永
(西南农业大学农学系 重庆 400716)
用青霉素处理小麦无胚半粒种子 ,能提高α2淀粉酶活性 ,较适浓度在 500mg/ L
左右 ,提高率为 4617 %~7513 %。α2淀粉酶活性的提高与可溶性蛋白质含量的提高
率 (27166 %~111159 %)呈显著的正相关 ,且处理比对照增加了 1 条同工酶特征性谱
带。经3 H2L2Leu 掺入α2淀粉酶酶蛋白的示踪试验显示 ,青霉素处理的放射性强度比
对照提高 3910 % ,表明青霉素可能诱导无胚半粒种子合成α2淀粉酶。经转录抑制剂
(AMD)和翻译抑制剂 (CHI) 的抑制实验表明 ,青霉素的诱导作用可为 AMD 和 CHI
消除 ,说明青霉素对α2淀粉酶的作用可在转录和翻译两个水平上起作用。进一步用
高效液相色谱分析内源赤霉素含量 ,结果表明 ,经青霉素处理的全粒或半粒无胚种子
比对照的赤霉素含量分别提高 8414 %和 180122 % ,说明青霉素的作用可能是诱导赤
霉素的形成以此调节基因的开放和转录 ,使小麦无胚半粒种子合成α2淀粉酶 ,从而使
酶活性大为提高。
关键词 :青霉素  α2淀粉酶  促进  机理  小麦胚乳
此文于 1997 年 11 月 20 日收到
禾谷类种子中α2淀粉酶是一种诱导酶 ,在种子开始萌发时才出现 ,因此 ,α2淀粉酶又有萌
发淀粉酶之称[1 ] 。1960 年 ,Paley[15 ,16 ]发现了贮藏组织和萌发种子中的α2淀粉酶活性 ,以后的
实验陆续揭示启动α2淀粉酶合成的化学信使是赤霉素。
青霉素是医药上广泛应用的低毒高效抗菌药物 ,而它作为一种新的、作用强的生长促进型
植物生长调节剂[2 ,3 ] ,虽已有学者对此进行研究 ,但远不如对动物和微生物上的研究深入。有
报道认为 ,青霉素可提高玉米、水稻、黄瓜等作物种子的发芽率、发芽指数、幼苗长度及干
重[4 ] 。Biswas 和 Mukherji [17 ,18 ]曾用青霉素处理水稻种子胚乳 ,发现能提高其中的α2淀粉酶和
核糖核酸酶的活性 ,胚乳蛋白质合成速率及总可溶性蛋白质的含量都有增加 ,并对其作用机理
进行了推测。但青霉素对小麦胚乳 (无胚半粒种子)中α2淀粉酶的影响尚未见报道。本文用青
霉素处理小麦胚乳 ,通过对α2淀粉酶活性、可溶性蛋白质含量和内源赤霉素含量的测定 ,以及
3 H2Leu 的示踪试验和转录、翻译抑制剂的抑制试验 ,探讨青霉素对小麦无胚半粒种子中α2淀
粉酶活性的影响 ,为青霉素对高等植物种子萌发过程和代谢活动中的影响 ,以及工业生产中应
用淀粉酶的研究提供理论及实践依据。
93 核 农 学 报 1999 ,13 (1) :39~46Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1  材料与方法
111  材料  小麦品种940780由西南农业大学农学系生统组提供。
青霉素 ( Penicillin)采用青霉素 G ,四川省医药股份有限公司生产 ;放线菌 D (Actinomycin
D) 为上海化学试剂厂生产 (分析纯) ;环已亚胺 (Cycloheximide) 为分析纯 ,美国 Sigma 公司生
产。
种子胚乳 (无胚半粒种子)选择大小一致、饱满的小麦种子 ,横切成接近等长的两半 ,将无
胚的一半置于小烧杯中 ,用 1 %的漂白粉溶液消毒 20min ,在无菌条件下除去漂白粉溶液 ,用无
菌水冲洗干净 ,转入培养皿 (每皿 150 粒)中 ,并加入 15ml 无菌水 ,25 ℃恒温箱中吸胀备用。
112  方法  α2淀粉酶的诱导反应 :将吸胀无胚半粒种子转入由 0101mmol/ L 醋酸缓冲液 (内
含 1mg/ ml 硫酸链霉素) 、10mmol/ L Ca2 + 及含不同浓度青霉素的反应体系中 ,在 25 ℃下恒温
振荡培养。青霉素的浓度分别为 0、100、300、500、700 和 1000mg/ L ,以 0 为对照。
3 H2L2Leu 掺入小麦胚乳α2淀粉酶酶蛋白的示踪试验 :用 500mg/ L 青霉素处理小麦胚乳
24h 后 ,加入3 H2L2Leu 再处理 24h ,以使其掺入到新合成的酶蛋白中。
转录抑制剂 (AMD)和翻译抑制剂 (CHI)的抑制反应 :在α2淀粉酶的诱导反应体系中加入
0、5、10、20、30 和 40mg/ L 的 AMD 或 0、1、5、10、15 和 20mg/ L 的 CHI 后 ,加入吸胀无胚半粒
种子 ,于 25 ℃下振荡培养 ,以了解青霉素对酶蛋白合成的调控水平。
α2淀粉酶提取 :参照 Biswas 和 Mukherji [17 ,18 ]的方法 ,将处理好的半粒种子的试管取出 ,倒
去处理液 ,用去离子水冲洗数次 ,以冲净种子表面的化学物质 ,吸干后用 01001 mol/ L p H418
醋酸缓冲液 8ml 进行研磨 ,300rpm 离心 15min ,上清液即为待测液。
α2淀粉酶活性的测定 :按 3 ,52二硝基水杨酸法[5 ] 。反应时间为 30min ,酶活性以每 h、每 5
粒种子所分解淀粉产生的麦芽糖量表示 ,即 mg 麦芽糖/ 5 粒种子·h。
可溶性蛋白质含量的测定 :根据 Lowry[19 ]的方法 ,以牛血清蛋白为标准。
MDA 含量测定 :参照王爱国[7 ]以及张宪政[8 ]的方法进行。
高效液相色谱法测定赤霉素的含量 :参照刘贤明[9 ] 、谈峰[10 ]的方法进行。
α2淀粉酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性显示 :酶液提取按杨煜峰[13 ]的方法 ,取 20 粒无胚
半粒种子 (经青霉素和水处理) 加入 p H813 Tris2甘氨酸缓冲液 4ml 研磨匀浆 ,8000rpm 离心
30min ,上清液为粗酶液 ,于垂直平板 (厚 115mm) 电泳 (点样量为 50μl) ,电泳时浓缩胶为 3 % ,
分离胶为 7 % ,凝胶中淀粉浓度为 5 % ,电压为 200V ,约 4h 电泳毕 ,活性染色参照胡能书[14 ]的
方法。
放射性α2淀粉酶分离提纯及放射强度的测定 :按照王康等[11 ]的方法 ,进行两次聚丙烯酰
胺圆盘电泳 ,分离纯化蛋白 ,第 1 次电泳分离胶浓度为 7 % ,第 2 次电泳分离胶浓度为 10 %。
将第 1 次电泳的酶带放在第 2 次的分离胶柱上 ,直接进行第 2 次电泳分离 ,经活性染色后 ,将
酶带切下 ,加高氯酸和 H2O2 加热溶解为溶液 ,用贝克曼 L S29800 自动闪烁仪测定放射性强
度。
以上各处理均重复 3 次。
04 核 农 学 报 13 卷
2  结果与分析
211  不同浓度青霉素对小麦α2淀粉酶活性的影响
用不同浓度 (0、100、300、500、700 和 1000mg/ L) 青霉素溶液处理小麦胚乳 ,在 25 ℃下培
养 24h ,分别于 12、15、18、21 和 24h 取样测定α2淀粉酶活性。从表 1 可以看出 ,用低于
500mg/ L (含 500mg/ L)青霉素处理的小麦胚乳 ,其α2淀粉酶活性随着青霉素浓度的增加而提
高 ,且在 12~24h 内 ,随处理时间的延长而增加 ,提高率为 819 %~7513 %。经方差分析表明 ,
处理与对照之间达到显著和极显著水平 ,其中 500mg/ L 左右浓度的青霉素对α2淀粉酶活性提
高最快 ,提高率为 4617 %~7513 % ,而当青霉素浓度超过 500mg/ L 后 ,则使α2淀粉酶活性的
提高有所回落 ,但仍高于对照。说明青霉素对α2淀粉酶的诱导有浓度效应 ,以下试验均采用
500mg/ L 的青霉素浓度。
表 1  青霉素对小麦胚乳α2淀粉酶活性的影响
Table 1  The effect of penicillin ofα2amylase in wheat endosperm
处理时间
Treatment
time
(h)
青霉素浓度
Concentration of penicillin
(mg/ L)
0 100 300 500 700 1000 F
12 415 ±012 419 ±014 516 ±011 616 ±014 610 ±011 513 ±013 8133 3
(819 %) (2414 %) (4617 %) (3313 %) (1718 %)
15 514 ±013 612 ±012 615 ±013 817 ±015 618 ±014 614 ±014 9153 3
(1418 %) (2014 %) (6111 %) (2519 %) (1815 %)
18 516 ±011 615 ±012 710 ±011 910 ±012 813 ±013 710 ±012 38165 3 3
(1611 %) (2510 %) (6017 %) (4812 %) (2510 %)
21 716 ±012 1016 ±014 1018 ±014 1113 ±015 1010 ±012 913 ±014 14103 3 3
(3915 %) (4211 %) (4817 %) (3116 %) (2214 %)
24 815 ±011 1218 ±012 1313 ±013 1419 ±013 1113 ±012 919 ±013 94134 3 3
(5016 %) (5615 %) (7513 %) (3219 %) (1615 %)
  注 : (  )内数据为酶活性提高率 , 3 表示显著 , 3 3 表示极显著
α2淀粉酶活性 :mg 麦芽糖/ 5 粒种子·h
Note :Data in (  ) are increase percentage of enzyme activity. 3 Significant . 3 3 Highly significant ;
α2amylase activity :mg maltose/ 5 half2seeds·h
212  青霉素对小麦胚乳α2淀粉酶酶蛋白合成的效应
21211  青霉素对小麦胚乳可溶性蛋白质含量的效应与α2淀粉酶活性的相关性 :将吸胀 24h 的
胚乳 ,用 500mg/ L 青霉素处理 24h (其间振荡培养) ,分别于 12、15、18、21 和 24h 取样测定可溶
性蛋白质含量和α2淀粉酶活性 ,以了解青霉素提高α2淀粉酶活性和可溶性蛋白质含量之间的
关系。结果 (表 2)表明 :青霉素不仅提高了小麦胚乳的α2淀粉酶活性 ,而且提高了它的可溶性
蛋白质含量 ,其含量比对照提高 27166 %~111159 % (达显著和极显著水平) ,由此证明 ,青霉
素具有促进蛋白质生物合成的作用。通过相关分析表明 ,无论是对照还是处理 ,α2淀粉酶活性
均与可溶性蛋白质含量呈正相关 ,其相关系数分别为 018099 和 019682 ,这似乎暗示青霉素促
进小麦胚乳α2淀粉酶活性的提高可能是促进α2淀粉酶的生物合成。
14 1 期 青霉素促进小麦胚乳α2淀粉酶合成机理初探
表 2  500mg/ L 青霉素对小麦胚乳α2淀粉酶活性和可溶性蛋白质含量的影响
Table 2  Effect of 500mg/ L penicillin onα2amylase activity and the content of
protein in wheat endosperm
处理时间
Treatment
time
(h)
可溶性蛋白质含量
Content of soluble protein
(mg/ 5 half2seeds)
CK
处理
Treatment
t
α2淀粉酶活性
α2amylase activity
(mg maltose/ 5 half seeds·h)
CK
处理
Treatment
t
12 1164 ±0113 3147 ±0107 35166 3 3 415 ±012 616 ±014 5120 3
15 2182 ±0110 3160 ±0105 17132 3 3 514 ±013 817 ±015 6154 3
18 2188 ±0106 3172 ±0113 8126 3 516 ±011 910 ±012 19163 3 3
21 3115 ±0119 4103 ±0112 7199 3 716 ±012 1113 ±015 7154 3
24 3126 ±0121 4119 ±0109 9178 3 3 815 ±011 1419 ±013 22117 3 3
  3 表示显著 3 3 表示极显著3 Significant  3 3 Highly significant
21212  青霉素对小麦胚乳α2淀粉同工酶的影响 :用 500mg/ L 青霉素处理小麦胚乳 (以水作对
照) 24h ,提取胚乳的α2淀粉酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,活性染色后的同工酶谱如图 1 所
示。
图 1  α2淀粉酶同工酶谱
Fig. 1  Isoenzymogram ofα2amylase
21213  青霉素促进放射性氨基酸掺入α2淀粉酶酶蛋白的效应 :用 500mg/ L 青霉素处理小麦
胚乳 24h 后 ,加入3 H2L2Leu 再处理 24h ,以使其掺入到新合成的酶蛋白中 ,提取α2淀粉酶并经
两次电泳分离纯化 ,然后测定活性染色的α2淀粉酶酶带的放射性强度。结果表明 ,处理的放射
性强度比对照提高 3910 % ,说明青霉素处理促进了掺入酶蛋白的量。同时从同工酶谱分析得
知 ,经青霉素处理的比对照多出 1 条特征谱带 (C 带) 。以上均说明 ,青霉素处理小麦胚乳有促
进α2淀粉酶蛋白的生物合成作用 (表 3) 。
表 3  青霉素对3 H2L2Leu掺入小麦胚乳α2淀粉酶酶蛋白的影响
Table 3  Effect of penicillin on 3 H2L2Leu intoα2amylase protein of wheat endosperm
放射性强度
Radioactivity intensity
(cpm)
CK
处理
Treatment
提高率
Increase
percentage
( %)
与总放射性强度之比
Ratio to total radioactivity intensity
CK
处理
Treatment
148 ±1 206 ±4 3910 1∶1713 1∶1215
24 核 农 学 报 13 卷
213  转录抑制剂( AMD)和翻译抑制剂( CHI)对促进α2淀粉酶合成的效应
21311  AMD、CHI 与α2淀粉酶活性及丙二醛 (MDA) 含量的关系 :在含 500mg/ L 青霉素的α2
淀粉酶反应体系中加入不同浓度的 AMD 或 CHI ,于不同时间取样测定α2淀粉酶和丙二醛含
量 ,MDA 含量的高低是膜脂过氧化指标 ,MDA 高则表示膜脂破坏程度增加。从表 4 可以看
出 ,当 AMD 浓度在 20mg/ L 左右时 ,抑制α2淀粉酶合成的效率最高 ,其抑制率分别为 3619 %
和 7414 % ,若 AMD 浓度超过 20mg/ L 时 ,其抑制效率渐趋于平缓。MDA 含量在 AMD 浓度超
过 20mg/ L 时急剧上升 ,40mg/ L 处理 24h ,其含量达 3124nmol/ g. FW。为尽可能减少药品对
小麦种子的伤害 ,选择 20mg/ L 的 AMD 作为最适的使用浓度。
表 4  AMD、CHI对青霉素处理小麦胚乳α2淀粉酶活性及 MDA含量的影响
Table 4  Effect of AMD , CHI onα2amylase activity and the content
of MDA treated with penicillin in wheat endosperm
抑制剂种类
Type of
inhibitors
处理浓度
Concentration
(mg/ L)
处理时间
Treatment time
(h)
α2淀粉酶活性
α2amylase
activity
(mg maltose/ 5half2seeds·h) MDA 含量Content of MDA(nmol/ g. FW)
AMD
0 12 613 ±012 1168 ±0123
24 1510 ±013 2129 ±0116
5 12 516 ±011 1174 ±0107
24 1216 ±013 2132 ±0120
10 12 513 ±014 1165 ±0141
24 1018 ±014 2137 ±0114
20 12 416 ±013 1183 ±0121
24 816 ±016 2143 ±0136
30 12 413 ±014 2134 ±0136
24 814 ±017 2187 ±0120
40 12 412 ±012 2140 ±0111
24 811 ±013 3124 ±0106
CHI
0 12 616 ±013 1122 ±0115
24 1515 ±014 2106 ±0111
1 12 519 ±011 1131 ±0109
24 1317 ±011 2123 ±0122
5 12 510 ±014 1162 ±0123
24 911 ±012 2139 ±0114
10 12 416 ±015 2173 ±0116
24 817 ±014 3142 ±0110
15 12 414 ±013 2157 ±0129
24 816 ±012 3157 ±0117
20 12 413 ±011 2192 ±0112
24 811 ±012 4106 ±0104
34 1 期 青霉素促进小麦胚乳α2淀粉酶合成机理初探
  当 CHI 浓度超过 5mg/ L 时 ,对α2淀粉酶蛋白的抑制作用无明显变化。CHI 浓度超过
5mg/ L 后 ,MDA 含量上升幅度较快 ,且随着 CHI 浓度的增加而呈上升趋势。20mg/ L 处理
24h ,MDA 达 4106nmol/ g. FW。为了减少在试验过程中小麦种子的伤害 ,确定 5mg/ L 为 CHI
的最适作用浓度。
21312  AMD、CHI 对α2淀粉酶合成的效应 :将吸胀 24h 的小麦胚乳用 500mg/ L 的青霉素处
理 7h ,分别加入 20mg/ L AMD 或 5mg/ L CHI ,以 500mg/ L 青霉素处理作为参比 ,以未处理
图 2  青霉素和抑制剂对α2淀粉酶合成的效应
Fig. 2  Effect of penicillin and inhibitors on
α2amylase biosynthesis
—·—青霉素 Penicillin
⋯. ⋯青霉素 + AMD
Penicillin + AMD
—△—青霉素 + CHI
Peniucillin + CHI
—×—H2O    
( H2O)为对照 ,在处理过程中 ,于 12、15、18、21、
24h 取样测定α2淀粉酶活性 ,结果 (图 2) 表明 :一
直用青霉素处理的小麦胚乳 ,α2淀粉酶的活性要
高于其它处理 ,24h 后酶活达到 1516mg 麦芽糖/ 5
粒种子·h ,可见青霉素处理小麦胚乳 ,其α2淀粉酶
活性比对照增加 7913 %。经青霉素处理 7h 后加
入转录抑制剂 (AMD) 再处理至 24h ,α2淀粉酶活
性下降到 910mg 麦芽糖/ 5 粒种子·h ,与对照酶活
性 (817mg 麦芽糖/ 5 粒种子·h) 相差无几 ,这表明
青霉素对α2淀粉酶合成作用的影响与转录密切相
关。经青霉素处理 7h 后加入翻译抑制剂 ( CHI)
再处理至 24h ,α2淀粉酶活性降低到 913mg 麦芽
糖/ 5 粒种子·h (与一直青霉素处理相比) ,这与对
照 ( H2O 处理) 的酶活高低也趋一致 ,说明青霉素
对α2淀粉酶的作用亦与翻译过程有关。这与前人
在赤霉素对α2淀粉酶作用的研究相一致[12 ] 。
21313  青霉素对内源赤霉素含量的影响 :已知青
霉素对植物的作用与它调节内源生长物质的代谢
有关 ,并认为赤霉素是启动α2淀粉酶合成的化学
信使。为此 ,用青霉素处理全粒及半粒 (无胚)种子振荡 24h 后 ,提取赤霉素进行高效液相色谱
分析 ,结果见表 5。用青霉素处理全粒和半粒种子后 ,其内源赤霉素含量分别比对照提高
84140 %和 180122 % ,表明青霉素能促进小麦种子内源赤霉素的形成 ,这与 Biswas 和 Mukerhji
报道的青霉素能促进水稻种子和幼苗中赤霉素的合成相一致[17 ,18 ] 。
表 5  青霉素对小麦种子内源赤霉素含量的影响
Table 5  Effect of penicillin on endogenous gibberellin in wheat seeds
 种子类型
Type of seeds
处理
Treatment
H2O
青霉素
Penicillin
提高率
Increase percentage
( %)
全粒种子
Whole2seed 4136 ±0114 8104 ±0122 84140
半粒种子
Half2seed 0191 ±0108 2155 ±0115 180122
44 核 农 学 报 13 卷
  综上可知 ,青霉素诱导小麦胚乳α2淀粉酶的合成可能首先诱导内源赤霉素的形成 ,然后由
赤霉素诱导合成α2淀粉酶的专一性 mRNA ,最后翻译α2淀粉酶酶蛋白 ,即青霉素对α2淀粉酶
的作用方式是通过赤霉素在转录和翻译两个水平上同时起作用 ,由此表现出小麦胚乳中可溶
性蛋白质含量增加、3 H2L2Leu 掺入酶蛋白的量增加、同工酶谱带条数增加及α2淀粉酶活性的
增加。
参 考 文 献
1  浙江农业大学种子教研组 1 种子学 1 上海 :上海科技出版社 ,1980
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5  何钟佩 1 农作物化学控制实验指导 1 北京 :北京农业大学出版社 ,1993
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8  张宪政 1 种子生理研究法 1 北京 :农业出版社 ,1990
9  刘贤明等 1 用高效液相色谱分析植物内源激素和吲哚232乙酸、脱落酸和玉米素 1 色谱 ,1992 ,8 (6) :64~65
10  谈 峰 1 植物激素的高效液相色谱 1 植物生理通讯 ,1986 , (5) :15~23
11  王 康等 1H2O2 对 CAT 和 POD 活性的影响 1 西南农业大学学报 ,1988 , (1) :101~103
12  朱广廉 1 赤霉素诱导大麦糊粉层细胞内α2淀粉酶的形成 1 植物生理通讯 ,1980 , (4) :50~58
13  杨煜峰等 1 杂交水稻及其亲本三系种子萌发过程中淀粉同工酶分析 1 杂交水稻 ,1986 , (4) :32~34
14  胡能书等 1 同工酶技术及其应用 1 长沙 :湖南科学技术出版社 ,1985
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Plant Physiol. 1960 ,35 :293~299
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35 :902~906
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19  Lowry OH , et al. Protein measurement with the Folin phenl reagent . J . Bio . Chem. 1951 ,193 :265~275
54 1 期 青霉素促进小麦胚乳α2淀粉酶合成机理初探
RESEARCH ON THE MECHANISM OF PENICILL IN
IND UCTION OFα2AMYLASE BIOSYNTHESIS IN WHEAT
ENDOSPERM
Bai  Xianquan
( Key L aboratory of Minist ry of A gricult ure f or Tropical Crops Physiology , CA TA S , Danz hou , 571737)
Wang Chutao  Liu Dayong
( Depart ment of A gronomy , Southwest A gricult ural U niversity , Chongqing , 400716)
ABSTRACT
Penicill in induced the synthesis of α2amylase in wheat2endosperm ( embroyless half2seeds)
was studied. Of concentrations tried , 500mg/ L penicill in was the most effective , which in2
creased the enzyme activity by 4617~7513 %. Penicill in also stimulated the content of the solu2
ble protein ( increased by 27166 %~111159 %) , which had signif icant positive correlation with
the activity of α2amylase. The analysis of α2amylase isoenzymogram showed that a band was
added with penicill in treatment. And tracing 3 H2L2Leu showed the radioactivity of α2amylase
with penicill in was 3910 % higher than that of the control . Penicill in induction of α2amylase
could be prevented by the transcription inhibitor ( AMD) and the translation inhibitor ( CHI) ,
indicating that the biosynthesis of α2amylase promoted by penicill in occurred in the transcip2
tional and translational levels. The contents of endogenous gibberell in in whole and embryoless
half seeds were determined with high performance l iquid chromatography ( HPLC) . The results
showed that the contents of gibberell in in penicill in2treated seeds were 84140 % and 180122 %
higher than that of the control , respectively , which indicated that penicill in probably induced
gibberell in biosynthesis , which in turn regulated opening and transcription of gene.
Key words :Penicillin ,α2amylase , induction , mechanism , wheat2endosperm
64 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (1) :39~46