全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062544204
Bt 晶体蛋白 Cry1Ac 放射免疫检测技术研究
潘家荣1 　乔艳红　张　维2 　林　敏2 　张　杰2
(11 农业部农业核技术与农产品加工重点实验室 ,中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京　100094 ;21 中国农业科学院生物技术
研究所 ,北京　100094 ;31 中国农业科学院植物保护研究所 ,北京　100094)
摘 　要 :通过苏云金芽孢杆菌 (Bt) HD273 培养 ,提取 Bt 晶体蛋白 Cry1Ac ,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。
免疫新西兰白兔得到高纯度的 Bt 晶体蛋白 1Ac 抗体 ,用125 I 标记抗原 ,研究和建立了 Bt 晶体蛋白 Cry
1Ac 的放射免疫检测技术 ,该试剂盒用磁性微粒作分离剂 ,不需离心即可分离 ,简化了测定步骤 ,检测结
果达到国外同类产品 (酶联免疫试剂盒)的水平。
关键词 :Bt Cry 1Ac 蛋白 ;放射免疫 ;转基因检测
STUDY ON RADIOIMMUNOASSAY OF Bt Cry1Ac PROTEIN
PAN Jia2rong1 　QIAO Yan2hong 　ZHANG Wei2 　LIN Min2 　ZHANGJie3
(11 Key Laboratory of Agricultural Nuclear Technology and Agro2food Processing , MOA , Institute of Agro2Food Science & Technology , Chinese Academy
of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 ;21 Institute of Biotechnology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 ;
31 Institute of Plant Protection , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094)
Abstract :Bt Cry1Ac protein was extracted from incubation of Bacillus thuringiensis HD273 , and cutting into more specific
protein segment with high insect2resistance. High2affinity multi2colonial antibodies of Bt Cry1Ac protein were obtained after
injected it into New Zealand rabbits. By 125 I labeling of Bt Cry1Ac protein , a RIA kit was established. In this method ,
centrifuge for separation was not necessary due to the use of magnetic micro2particle and the specifications of the kit were found
equal to those of imported ELISA.
Key words :Bt Cry1Ac protein ; radioimmunoassay ; detection of GMOs
收稿日期 :2006208225
基金项目 :国家食物攻关课题 (2001BA707B03)
作者简介 :潘家荣 (19642) ,男 ,博士 ,从事食品安全和生物物理研究。Email :panjr @263. net　　把苏云金芽孢杆菌 ( Bacillus thuringiensis , 简称Bt)中的一种或几种杀虫晶体蛋白 ( Insecticidal crystalprotein)基因转入植物中 ,能够赋予植物抗虫能力。迄今为止 ,国际上已命名的 cry 和 cyt 杀虫蛋白基因有130 多个[1 ,2 ] 。其中部分被转入棉花、玉米等农作物中并得到应用[3 ,4 ] 。据不完全统计 ,在美国已商品化的转Bt 棉花和玉米占所有种植品种的 20 %～40 % ;在我国转 Bt 棉花已通过安全性评价并进入商品化生产。Bt 晶体蛋白是转 Bt 基因生物的 Bt 基因表达产物 ,是鉴定抗虫性的重要指标 ,其快速、准确测定 ,将为育种、转基因植物的虫害管理和基因标识提供技术支撑。现在通用的检测方法是酶联免疫法[5～7 ] 。利用准 确、灵敏和简便的放射免疫检测技术检测 Bt 晶体蛋白目前还未见有报道。本研究利用放射免疫分析原理 ,结合磁性微粒技术 ,探索建立其中 Bt Cry 1Ac 的放射免疫检测技术 ,以期为转基因检测提供新的途径。1 　材料与方法111 　材料LB 液 体 培 养 基 : Tryptone 110 % , Yeast extract015 % ,NaCl 1 % ,pH710 , 10816 Pa 和 20min 下灭菌[6 ] ;Z氏液体培养基 :蛋白胨 110 % ,酵母粉 012 % ,可溶性淀粉 013 % ,葡萄糖 012 % , K2 HPO4 011 % , KH2 PO4 1 % ,
445　 核 农 学 报　2006 ,20 (6) :544～547Journal of Nuclear Agricultural Sciences
CaCO3 012 % ,pH710 ,11034 (105 Pa 和 20min 下灭菌[7 ] ;
苏云金芽孢杆菌 (Bt) HD273 , 由中国农业科学院植物
保护研究所提供 ;Aerosol 气溶胶购自重庆科瑞制药有
限责任公司 ;纯品Bt Cry 1Ac 与Bt Cry 1Ac 酶联免疫试
剂盒从美国 BIOCHEM 公司进口。
112 　方法
11211 　Bt 晶体蛋白的提取 　挑取单菌落 ( HD273) 于
LB 液体培养基中 ,37 ℃,200rpm ,摇瓶培养 20～24h 进
行菌液活化。按 1 %的接菌量将活化的菌液转接 Z氏
液体培养基中 ,37 ℃摇瓶培养 36～48h。5000rpm ,室温
离心 5min ,收集菌体。用无菌预冷的 1molΠL NaCl 溶
液和无离子水洗涤 , 溶于 150ml 的裂解溶液中
(50mmolΠL EDTA、50mmolΠL Na2 CO3 和 3 %硫基乙醇)
pH10 ,4 ℃下裂解 5～6h ,12000rpm 离心 10min ,取上清
液 ,用 4molΠL 乙酸钠 - 乙酸溶液 (pH415)中和达 pH510
左右 ,4 ℃沉淀 4h。12000rpm 离心 10min ,收取沉淀物 ,
用无菌预冷的无离子水洗涤数次 ,最后溶于 30ml 的溶
解液 (50molΠL Na2 CO3 ,1molΠL EPTA) 中 ,pH10 ,获得蛋
白 I溶液 ,在扫描电镜下观察蛋白 I形态。
取 1ml 蛋白 I 液 ,按蛋白∶Trypsin = 50∶1 的比例加
入 Trypsin ,37 ℃酶解 8h ,酶解产物用蒸馏水透析 48h ,
得蛋白 II ,SDS2PAGE电泳检测其分子量。直接用蛋白
II饲喂 2 周龄的小菜蛾、棉铃虫幼虫 (各 150 头一组 ,
共 6 组) ,记录死亡时间和死亡个数[8 ,9 ] 。
11212 　抗血清制备 　把蛋白 II 配制成 115mgΠml 溶
液 ,加等量福氏完全试剂乳化 ,在新西兰白兔背部皮内
多点注射 ,每隔两周加强免疫 1 次 ,免疫剂量减半 ,两
个月后静脉取血 ,用放射免疫法测定抗血清。当抗血
清效价达到 1∶5000 以上时 ,取兔全血 ,血清离心后用
硫酸铵进行纯化。
11213 　标准系列配置 　取纯品 Bt Cry1Ac , 用缓冲液
(PBS , 0101molΠL , pH 714) 配成标准系列分别为 0、5、
10、50、100、500 和 1000ngΠml。
11214 　磁分离剂的研制[10 ] 　用戊二醛将 Aerosol 配成
110 %溶液 ,加入铁粉成 310 %的铁液 ,置于带盖的容器
中 ,滴加 10molΠL NaOH调至 pH11。用氮气使其脱氧后
盖紧容器 ,放到振荡器中。在室温下振荡 24h ,每隔一
定时间调节 pH ,使维持在 pH11。兑水充分透析混合
物 ,以 2000 ×g 离心 30min ,使微球沉淀 ,并将微球悬在
蒸馏水中。加入戊二醛 ,使微球活化 1h ,离心 ,弃上
清 ,加入抗 IgG(Tris - HCl 缓冲液稀释) ,在室温下作用
8h。离心后弃上清 ,用 PBS 洗涤得分离剂 ,在 4 ℃下保
存备用。
11215 　Bt Cry1Ac 的 125 I 标记 　在 100μl 的纯品 Bt
Cry1Ac (30μg) 溶液中加入 185 MBq Na 125 I ,用氯胺 T
法标记 ,经凝胶层析分离 ,收集125 I2蛋白峰。用 011molΠ
L ,pH714 PBS 稀释 ,使 200μl 内含有放射性活度 5000
Bq。
11216 　标准曲线的制定 　按表 1 加样 ,37 ℃温育 3h ,
加分离剂 1000μl ,磁场下作用 5min ,弃上清 ,用γ250 型
放免仪测定放射性活度 ,计算结合率 ,用对数作图作结
合率 - 浓度曲线 ,求相关系数。当相关系数小于
019990 时 ,调整标准浓度。选取最大结合率为 50 %～
60 %时的抗体浓度为实用浓度 ,重复上述加样和测定
过程 ,作标准曲线。
表 1 　加样参照表
Table 1 　Procedure for addition of reagents in RIA
standard establishment (unit :μl)
名称
Symbol
0ngΠml
零标准
0ngΠml
Standard
5 ,10 , 50 ,100 , 500 ,
1000ngΠml 标准品系列
5 ,10 , 50 ,100 , 500 , or
1000ngΠml Standard series 抗血清系列IgGsolution 125 I2蛋白II 溶液125 I2proteinII solution
NSB 200 100
S0 100 100 100
S12S6 100 100 100
QC 100 100 100
注 :NSB2空白管 ; S02S6 标准管 ;QC2质控 :由纯品配制 ,浓度分别为 10 ,
400 和 1000ngΠml) 。
Note: NSB2check ; S02S6 , standard series ; QC2quality control , 10 , 400 和
1000ngΠml ,prepared with pure Bt Cry 1Ac)
113 　检测性能测定
11311 　质控符合性 　以标准曲线为依据 ,用纯 Bt Cry
1Ac 调制已知浓度的质控系列 ,测定质控的结合率 ,计
算 Bt Cry 1Ac 测定值 ,分析测定值与调制值的差异。
11312 　与 ELISA 检测对比 　与Bt Cry 1Ac 酶联免疫试
剂盒 ,对质控进行比较测定。
11313 　实际测定 　选取传统或转基因玉米叶片 (新
鲜) 、玉米籽粒、棉花叶片 (新鲜) 、棉籽样品 1g , 加入蛋
白提取液 (1L 蒸馏水中含有无水碳酸纳 2166g、氯化钠
2192g 和维生素 C 1g) 2ml ,研磨成匀浆 ,转移到小试管
中 ,稍微甩一下 ,静止 5min。取上清液按 11216 方法与
标准品一起测定放射性活度 ,计算结合率和Bt Cry 1Ac
含量。
114 　结果计算
首先计算每对试管的平均放射性活度 (Bq) ,净计
数 (Bq) = 平均放射性活度 (Bq) - 放射性活度本底
(Bq)
非特异结合率 :NSBΠT(100 ,NSB = 非特异双管放
射性活度 (Bq)均值 ,T = 加入放射性活度 (Bq)
545　6 期 Bt 晶体蛋白 Cry1Ac 放射免疫检测技术研究
最大结合率分别为 : (B0 - NSB)ΠT(100 ,B0 = 零标
准 (S0 )双管放射性活度 (Bq)的均值
各标准管、样本管结合率为 : (BiΠB0 %) = Bi - NSBB0 - NSB
×100 , Bi = 标准管 (或样本管) 双管放射性活度 (Bq)
的均值
以上各标准的结合率为纵坐标 ,以标准浓度为横
坐标 ,在Logit2Log 双坐标纸上作标准曲线。根据待测
样本的结合率 ,从标准曲线上查出相应的样品 Bt Cry
1Ac 含量。
2 　结果与讨论
211 　电镜观察蛋白形态
蛋白 I晶体经扫描电镜观察 ,形状为标准的菱形 ,
与 Schnepf et al 所报道的晶体形状一致[2 ] ,证明蛋白 I
是 Bt Cry 1Ac。见图 1。
图 1 　蛋白 I的扫描电镜 ( ×2000)
Fig. 2 　Structure of protein I under scanning
electronic telescope ( ×2000)
212 　蛋白 Ⅱ的纯度和生物活性
图 2 是蛋白 Ⅰ经 Trypsin 酶解后得到的蛋白 Ⅱ的
电泳图谱。结果表明其分子量为 60KD ,纯度约为
70 %。蛋白 Ⅱ的纯度符合免疫动物制备抗体的要求。
图 2 　蛋白 Ⅱ的电泳图谱
Fig. 2 　Electrophoresis diagram of protein Ⅱ
M:标记物 ,1～4 为蛋白Ⅱ的四个重复
饲喂蛋白 Ⅱ48h 后的小菜蛾、棉铃虫幼虫全部死
亡 ,该结果说明提取的 Bt Cry 1Ac 蛋白具有较强的生
物活性。
213 　多克隆抗体的效价
经放射免疫分析 ,不同兔子的免疫抗体之间效价
有明显差异 ,范围在 1∶600 到 1∶7000 之间 , 选取效价
为 1∶7000 的抗体进行纯化并用于试剂盒研制。
214 　标准曲线的建立和质控符合性
在标准曲线制定过程中 ,最大结合率为 4918 % ,
非特异结合率为 312 %。说明标准曲线符合放射免疫
分析要求。从图 3 可以看出 ,标准系列浓度 ( PgΠml) 的
对数值与结合率成直线 , 相关系数 R2 = - 0199933 。
图 3 　Bt Cry 1Ac 蛋白的放射免疫分析标准曲线
Fig. 3 　Standard curve of RIA kit for Bt Cry 1Ac protein
Bt Cry 1Ac 蛋白的实际浓度与测定值的相关性见
图 4。由图 4 可以看出 Bt Cry 1Ac 蛋白调制质控浓度
值与测定值之间的相关性达到极显著水准 ,说明本试
验建立的放谢免疫分析方法是可行的 ,同时也可看出
灵敏度约 100pgΠml ( > 95 %置信度) 。
图 4 　Bt Cry 1Ac 蛋白调制浓度值与测定值之间的相关性
Fig. 4 　Relationship between measured value and
practical values of Bt Cry 1Ac protein
215 　与酶联免疫法测定结果的比较
从表 2 中可看出 ,非转基因的普通作物样品用本
方法测定的结果为阴性 ,转基因样品用本方法测定的
结果为阳性 ,酶联免疫和本试验建立的方法得出的对
样中 Bt Cry 1Ac 测定值之间无显著性差异 ( P > 0105) 。
645 核　农　学　报 20 卷
表 2 　玉米和棉花 Bt Cry 1Ac 晶体蛋白测定结果
Table 2 　Determination of Bt Cry 1Ac protein in corn and
cotton by ELISA and RIA (ngΠml)
普通玉米
Non2transgenic
corn
转 Bt 玉米
Bt2transgenic
corn
普通棉花
Non2transgenic
cotton
转 Bt 棉花
Bt2transgenic
cotton
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
叶片
leaf
籽粒
grain
酶联免疫 ELISA - - 15Aa 67Aa - - 34Aa 102Aa
建立的方法
RIA established
- - 13Aa 75Aa - - 28Aa 96Aa
注 :表中相同字母表示无显著性差异。
Note :the same letter in table means no significant different .
　　利用磁性微粒连接 IgG制备免疫分离剂 ,在磁场
的作用下 ,抗原抗体复合物自动沉淀 ,不需离心即可分
离 ,具有使用方便 ,制样简单 ,不用离心分离等优点 ,且
种子样品不用去酚和脱脂 ,灵敏度即可达到 100pgΠml ,
说明本方法在上述方面优于酶联免疫法。Bt Cry 1Ac
放射免疫检测方法快速准确测定的特点 ,为育种、转基
因植物的虫害管理和基因标识提供了另外一种检测手
段。
参考文献 :
[ 1 ] 　Crickmore N , Zeigler D R , Feitelson J et al , 1998. Revision of the
nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.
Microbiology and Molecular Biology Review , 1998 , 62 (4) :807～813
[ 2 ] 　Schnepf H E , Crickmore N ,Van Rie J , et al . Bacillus thuringiensis and
its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology
Review , 62 (3) :775～806
[ 3 ] 　赵建周 ,卢美光. 转 Bt 基因棉花在害虫综合防治中的作用、抗性
问题及其对策. 中国植物保护研究进展. 北京 :中国科学技术出
版社 ,1996 ,447～450
[ 4 ] 　喻子牛 ,孙　明 ,陈亚华 ,等. 苏云金芽孢杆菌生物活性蛋白基因
在动植物病虫害防治中的应用. 农业生物技术学报 ,1995 ,3 (2) :
100～109
[ 5 ] 　孙 　严 ,孟庆玉. 利用 ELISA 检测新疆转基因抗虫棉组织中 Bt
杀虫蛋白. 新疆农业科学 , 2001 ,38 (01) :36～37
[ 6 ] 　刘光明 ,苏文金. 应用间接 ELISA 方法定量检测转基因抗虫玉
米. 无锡轻工大学学报 ,2003 ,22 (1) :49～52
[ 7 ] 　谢小波 , 舒庆尧. 用 Envirologix Cry1AbΠCry1Ac 试剂盒快速测定转
基因水稻 Bt 杀虫蛋白含量的研究. 中国农业科学 ,2001 ,34 (5) :
465～468
[ 8 ] 　J . 萨姆布鲁克 (金冬雁等翻译) . 分子克隆实验指南 (第二版) . 北
京 :科学出版社 ,1992
[ 9 ] 　左雅慧 ,等. 几种 Bt 培养基的筛选和晶体蛋白纯化方法初探. 植
物保护 ,1999 ,25 (3) :31
[10 ] 　吕淑珉 ,马冬梅 ,金　星. 用小菜蛾测定苏云金杆菌毒力的感染
方法. 生物防治通报 ,1990 ,增刊 :24～27
[11 ] 　农向群 ,金正俊 ,邓春生. 小菜蛾白僵菌菌株的大量培养条件. 中
国病毒学 ,2000 ,15 :130～133
[12 ] 　曾京辉. 氧化铁微粒子的合成. 化学世界 ,1995 ,7 :353～357
(上接第 476 页)
[ 4 ] 　张文杰 ,程　磊 ,张志毅. 三倍体毛白杨无性系木材两个切面密
度的可视化. 林业科学 ,2004 ,40 (4) :211～216
[ 5 ] 　平吉功. 森林植物 における人为倍数 の研究 II.  倍数体 に
おけるの观察. Reports of the Kihara Institute for Biological Research ,
1950 ,4 :17～ 21
[ 6 ] 　范国强 ,翟晓巧 ,蒋建平 ,等. 不同种泡桐叶片愈伤组织诱导及其
植株再生. 林业科学 ,2002 ,38 (1) :29～35
[ 7 ] 　范国强 ,翟晓巧 ,马新业 ,等. 两种泡桐叶片体细胞胚胎发生及植
株再生. 核农学报 ,2005 ,19 (4) :274～278
[ 8 ] 　范国强 ,翟晓巧 ,秦河锦 ,等. 泡桐丛枝病株体外植株再生系统研
究. 河南农业大学学报 ,2005 ,39 (3) :254～258
[ 9 ] 　翟晓巧 ,王政权 ,范国强. 泡桐体外器官直接发生的植株再生.
核农学报 ,2004 ,18 (5) :357～360
[10 ] 　Bergman B A and Moon H K. In vitro adventitious shoot production in
Paulownia. Plant Cell Reports , 1997 ,16 :315～319
[11 ] 　Ipekci Z and Gozukirmizi N. Direct somatic embryogenesis and synthetic
seed production from Paulownia elongata. Plant Cell Reports , 2003 ,22 :
16～24
[12 ] 　Rao C D , Goh C J , Kumar P P. High frequency adventitious shoot
regeneration from excised leaves of Paulownia spp . cultured in vitro.
Plant Cell Reports , 1996 ,16 :204～209
[13 ] 　袁志发 ,周静芋. 试验设计及统计. 北京 :高等教育出版社 , 2000
[14 ] 　舒寿兰. 四种泡桐染色体数目的初步研究. 河南农业大学学报 ,
1985 ,19 (1) :48～50
[15 ] 　张数鑫 ,谢芝馨 ,于元杰 ,等. 秋水仙素结合组织培养技术诱导大
葱多倍体的研究. 生物技术 ,2005 ,15 (4) :67～70
[16 ] 　陈　高 , 孙卫邦. 秋水仙素诱导七里香多倍体. 植物生理学通讯
2006 ,42 (2) :229～231
[17 ] 　Kheiria H , Walker D J , Bouzid S. Determination of ploidy level and
nuclear DNA content in Tunisian popurlations of Atriplex halimus L.
Genetic Resources and Crop Evolution , 2006 , 53 :1～5
[18 ] 　Ben J M ,Zonneveld ,Frank V I. Flow cytometric analysis of DNA content
in Hosta reveals ploidy chimeras. Euphytica January ,2000 ,111 (2) :105
～110
[19 ] 　Jane F C ,Carlos R C ,Wagner C O. In vitro induction of polyploidy in
annatto (Bixa orellana ) . Plant Cell ,Tissue and Organ Culture ,2005 ,80
(1) :69～75
745Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (6) :544～547