全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062461204
香石竹 ACC 氧化酶基因克隆及其反义
表达载体构建
刘会超1 　李永春2 　巨关升3 　孙振元3 　柴德勇4
(11 河南科技学院 ,河南 新乡　453003 ;2 河南农业大学 ,河南 郑州　450002 ;
31 中国林业科学研究院林业研究所/ 国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091 ;41 河南北方花卉集团公司 ,河南 鄢陵　461200)
摘 　要 :据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸 (ACC)氧化酶基因的 cDNA 序列设计特异引物 ,以香
石竹品种“Master”基因组 DNA 为模板 ,用 PCR 方法克隆出香石竹 ACO 基因的部分序列。测序
结果显示 ,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹 ACO 片段反向连接到植物表
达载体 pCAMBIA 1301 中 CaMV 35S 启动子的下游 ,构建了香石竹 ACO 基因的反义表达载体
pCAM2ACO2 ,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。
关键词 :香石竹 ;ACC氧化酶基因 ;反义表达载体
CLONING OF ACC OXIDASE GENE OF CARNATION AND CONSTRUCTION
OF ITS PLANT ANTISENSE EXPRESSION VECTORS
LIU Hui2chao 　LI Yong2chun 　JU Guan2sheng 　SUN Zhen2yuan 　CHAI De2yong
(11 Henan Science Technology College , Xinxiang , Henan , 453003 ; 21 Henan Agricultural University , Zhengzhou , Henan ,45002 ;
31 Research Institute of Forestry , Chinese Academy of Forestry/ Key Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing ,100091 ;
41 Henan Northern Flower Corporation , Yanling , Henan , 461200)
Abstract :A pair of specific primers was designed according to the reported cDNA sequence of the DC2ACO
( Dianthus caryophyllus L. ACC Oxidase) , and a partial sequence of the gene was amplified from genomic DNA of
a carnation variety ’Master’by PCR. Sequence analysis showed that the cloned and the reported sequences were
basically coincident . An antisense expression vector , named pCAM2ACO2 , of the DC2ACO gene was constructed ,
in which the antisense sequence was controlled by the CaMV 35S promoter. The work laid the foundations of the
future transgenic research for prolonging the flowering period of the transgenic carnation via antisense technology.
Key words : Dianthus caryophyllus L. ; ACC oxidase gene ; antisense expression vector
收稿日期 :2005205220
基金项目 :国家科技部转基因专项 :香石竹抗衰老转基因株系的创建及其产业化 (J Y042B202)
作者简介 :刘会超 (1964 - ) ,男 ,河南南阳人 ,副教授 ,博士 ,主要从事园林植物分子育种与逆境生理研究。孙振元为通讯作者 ,Email :
sunzy @caf . ac. cn
香石竹 ( Dianthus Caryophyllus L. )是世界四大切花之一 ,也是典型的乙烯致衰植物 ,控制香石竹体内
乙烯的生物合成 ,是延缓其衰老、延长保鲜期的主要途径[1 ] 。ACC氧化酶 (ACO) 是植物乙烯合成的关键
酶[2 ] 。本研究克隆了香石竹的 ACC氧化酶基因 ,并构建了该基因的反义表达载体 ,为通过反义技术抑
制转基因香石竹中乙烯的生成、从而延迟其花瓣的衰老奠定了基础。
1 　材料与方法
164　核 农 学 报　2005 ,19 (6) :461～464Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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111 　材料
香石竹品种“Master”由中国农业科学院提供 ,大肠杆菌 [ Escherichia coli ( migula) Castellani and
Chelmers] DH5α、根癌农杆菌 [ Agrobacterium tunef aciens ( Smith et Townsend) conn ] EHA105 及表达载体
pCAMBIA1301 为本实验室保存 ,载体 pBS 及 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天为时代生物公司 ,
其余生化试剂均购自于 Sigma 公司。
112 　香石竹基因组 DNA的提取
植物基因组 DNA 的提取 :参照王国英的方法[3 ] ,取干净的植物叶片约 20mg ,置于 115ml 离心管中剪
碎 ;缓慢加入液氮进行预冷 ,再加液氮后用研杵迅速磨碎叶片并立即加入 300μl 65 ℃预热的提取缓冲
液 ,65 ℃水浴约 1h ,温浴时摇动 3 次 ;用等体积酚Π氯仿Π异戊醇、氯仿Π异戊醇各抽提一次 ,12000 rpm 离
心 ,转移水相到另一离心管中 ;加入 1Π10 体积的 NaAc (3molΠL) 混匀 ,再加入 2 倍体积预冷的无水乙醇 ,
混匀后静置 2min ,14000rpm 离心 10min 沉淀DNA ;用 70 %冰浴乙醇 200μl 清洗DNA 沉淀 ,小心吸去乙醇 ,
自然风干 DNA ;最后溶于 50μl 重蒸水中 , - 20 ℃保存备用。
113 　香石竹 ACO 基因片段的克隆
参照 Wang 等报道[4 ]的香石竹 ACO(ACC氧化酶)基因 cDNA 序列 ,设计一对引物 , (由上海生工公司
合成) :ACO21 :5’2GCA AAC ATT GTC AAC TTC CC23’;ACO22 :5’2TCA AGC AGT TGG AAT GGG AC23’。
PCR 反应按标准体系进行 ,反应参数为 :94 ℃预变性 5min ;94 ℃1min ,56 ℃1min ,72 ℃1min ,循环 30 次 ;
72 ℃后延伸 10min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后用北京天为时代公司的 DNA 凝胶回收试剂盒回收 ,
并用连接试剂盒连接到 pBS2T载体中得到 pBS2ACO ,送上海生工公司测序。
114 　香石竹 ACO 基因反义表达载体的构建及其转化农杆菌
依据克隆的香石竹2ACO(DC2ACO)序列设计一条引物 (ACO23 :5’2AGA GCA CCG GTT ACC TTC GT2
3’) ,以 pBS2T为模板 ,通过引物 ACO23 和 ACO22 的扩增将 Bst EII酶切位点引入到 ACO 序列中。PCR 反
应条件及参数同 113 中所述 ,扩增片段应为 817bp , PCR 产物克隆到 pBS2T 载体中得到 pBS2ACO2 。将
pBS2ACO2 和 pCAMBIA1301 分别用 Bst EII和 Nco I双酶切 ,然后将得到的 ACO 片段定向克隆到植物表达
载体。
pCAMBIA1301 中获得 DC2ACO 的反义表达载体 pCAM2ACO2 (图 1) 。参照王国英等[3 ] 的冻溶法将表
达载体导入农杆菌 ,用引物 35S1 (5’2ACT ATC CTT CGC AAGACC CT23’)和ACO24 (5’2TCA AGGATG GTC
图 1 　香石竹 ACO 基因反义表达载体的构建示意图
Fig. 1 　Constructing diagram of plant
expression vector for antisense DC2ACO 图 2 　香石竹 ACO 片段的 PCR 扩增Fig. 2 　Fragment of DC2ACO amplification1、2、4 泳道为以香石竹叶片基因组 DNA 为模板的扩增产物 ,第 3 泳道为以水为模板的阴性对照Lane 1 , lane 2 and lane 4 were the products amplifiedfrom genomic DNA of carnation ; Lane 3 was CK
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图 3 　克隆 ACO 序列与报道序列的比较
Fig. 3 　Alignment of ACO cloned and reported ACO sequences
克隆序列在上 ,报道序列在下 ;不一致位点用 3 标出 ,内含子用背景标出。引物设计区用下划线标出
The upper line is cloned sequence of DC2ACO and the lower line is the reported sequence of DC2ACO ,
the unmatched bases were marked with 3 and the introns were backgrounded , regions corresponding to primers were underlined.
ATT GGG TT23’)通过 PCR 对重组克隆进行鉴定。其中引物 35S1 位于表达载体中的 CaMV35S 启动子
区 ,引物 ACO24 位于 ACO 反义序列区 ,扩增片段应为 527bp ,PCR 反应体系同前述 ,反应参数除了退火温
度为 58 ℃外 ,其余相同。将被转化的农杆菌 EHA105 菌落繁殖后于 - 80 ℃保存备用。
2 　结果与分析
211 　香石竹 ACC氧化酶基因的克隆及其序列分析
提取香石竹“Master”的基因组DNA 作为模板 ,用引物ACO21 和ACO22 进行的 PC 异性扩增获得了大
小约为 112kb 的特异片段 (图 2) ,将 PCR 产物用 DNA 凝胶回收试剂盒回收然后将克隆片段和 pBS2T载364　6 期 香石竹 ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建
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图 5 　DC2ACO 基因反义表达载体 PCR 鉴定
Fig. 5 　PCR analysis for expression vector of
antisense DC2ACO
1～9 : 大肠杆菌 DNA 为模板的扩增产物 ;M:Marker。
Lane 1 to 9 were the products of PCR amplified from DNA
of Ecoli DH5α; M denote the marker
图 4 　反义表达载体构建过程中的电泳图
Fig. 4 　Construction of the expression vector
for antisense DC2ACO
A :1、2、3 泳道都为以质粒 pBS2ACO 为模板的 PCR 扩增产物 ;
B :第 2 和第 4 泳道分别为载体 pCAMBIA1301 和 pBS2ACO2 的
双酶切产物 ;所有图片中的 M均为 Maker。
A : Lane 1 ,lane 2 ,and lane 3 were the products of PCR
amplified from plasmid pBS2ACO , respectively ; B : lane 2
and lane 4 were pCAMBIA1301 and pBS2ACO2 digested with
Bst EII and Nco I , respectively ; M denote the marker
体连接 ,连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 ,重组克隆经 PCR 鉴定后提取得到重组质粒
pBS2ACO。对克隆的 DC2ACO 片段进行序列分析
(图 3)表明 ,克隆片段全长约为 1205bp ,包括 2 个
内含子 ,内含子全长 242bp。克隆序列和报道序列
的同源性为 99 % ,共有 7 个碱基的不一致 ,其中外
显子部分 4 个 ,内含子部分 3 个碱基。
212 　香石竹 ACO 基因反义表达载体的构建
为了在 ACO 序列中引人 Bst EII 酶切位点 ,用
引物ACO23 和ACO22 对重组质粒 pBS2ACO 进行扩
增。结果表明 ,扩增产物的大小和预期的大小一
致 ,大约为 802bp (图 42A) ,将 PCR 产物回收后重
新克隆到 pBS2T载体中得到 pBS2ACO2 。
用 Bst EII 和 Nco I 双 酶 切 pBS2ACO2 和
pCAMBIA1301 并通过琼脂糖凝胶电泳将酶切片段
分离 (图 4B) ,回收包末端为 Bst EII 和 Nco I 酶切
位点的 ACO 小片段 (约 782bp) 及 pCAMBIA1301 载
体大片段 (约 918 kb) ,将回收片段连接并转化大
肠杆菌 DH5α菌感受态细胞 ,对抗性克隆用引物进
行的 PCR 鉴定表明 ,重组克隆都可以扩增到大小
约为 527bp 的条带。图 5 中第 1～4 泳道、第 6 泳
道及第 9 泳道对应的菌落为重组载体的转化菌
落。从阳性菌落中提取重组载体 pCAM2ACO2 ,利
用冻溶法将表达载体导入农杆菌 ,经 PCR 鉴定已
获得了含有表达载体农杆菌 EHA105 ,可用于康乃
馨的遗传转化。
3 　讨论
乙烯在高等植物中的合成途径为 :MET(蛋氨
酸) →SAM (腺苷蛋氨酸) →ACC →乙烯 ,ACC 氧化
酶催化 ACC生成乙烯 ,研究表明 ,ACC氧化酶是乙
烯合成的一个限速酶[5 ] ,目前国外已从番茄[6 ] 、苹
果[7 ] 、豌豆[8 ] 、桃[9 ] 、矮牵牛[10 ] 、香石竹[3 ] 、猕猴
桃[11 ]等植物中克隆到 ACC 氧化酶基因 cDNA。本
研究对香石竹‘Master’种基因组 DNA 进行了 PCR
扩增 ,得到了 112 kb 的特异片段 ,测序表明 ,所扩片段外显子部分与 Wang[4 ] 所报道的香石竹品种‘White
Sim’D 的 ACO 基因 cDNA 序列基本一致 ,克隆序列和报道序列的同源性为 99 % ,这说明 ACO 基因序列
在香石竹基因组中比较保守。
利用 ACC氧化酶反义基因技术 ,抑制乙烯合成已经在番茄上获得成功[1 ] ,本项研究将克隆的香石
竹ACO 片段反向连接到植物表达载体 pCAMBIA 1301 中 CaMV 35S 启动子的下游 ,构建了香石竹ACO 基
因的反义表达载体 pCAM2ACO2 ,经 PCR 鉴定已获得了含有表达载体农杆菌 EHA105 ,并用于康乃馨的遗
传转化。为进一步通过反义技术获得抗衰老转基因香石竹奠定了基础。
参考文献 : (下转第 473 页)
464 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (6) :461～464
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多的发育信息 ,进而得到更接近真实系统发育历史的研究结果[12 ] 。
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