全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 052349204
高产多糖钝顶螺旋藻新品系的选育及
蛋白质 SDS2PAGE 鉴定
汪志平　刘艳辉
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :研究了 10 株钝顶螺旋藻对60 Coγ射线的辐射抗性及其与多糖含量的关系 ,表明各株系
的半致死剂量 (LD50 )与多糖含量间的相关系数高达 019873。进而以多糖含量较高的钝顶螺旋
藻 Sp208 为出发品系、用 016 %的 EMS 和 214 kGy 的60 Coγ射线处理 Sp208 单细胞或原生质球 ,
并用 710 kGy 左右的γ射线为筛选压力 ,得到了 4 株多糖含量分别比 Sp208 的高 3218 %、
1713 %、2314 %和 4213 %的形态突变体 : Sp208A、Sp208B、Sp208C 和 Sp208D。蛋白质 SDS2PAGE
分析确定 ,Sp208A、Sp208C和 Sp208D 为在分子遗传水平发生变异的突变体。综合上述突变体
的形态特征和生长速率等生产性状 ,确立 Sp208A 为高产多糖的钝项螺旋藻新品系 ,目前已用
于大规模养殖与产业化开发。
关键词 :螺旋藻 ;多糖 ;突变体 ;育种 ;抗辐射
SELECTION AND PROTEIN SDS2PAGE IDENTIFICATION OF A NEW HIGH2PRODUCING
POLYSACCHARIDE STRAIN OF Spirulina platensis
WANG Zhi2ping 　LIU Yan2hui
( Zhejiang University , Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang , 　310029)
Abstract :The relationship between anti2radiation capacity and polysaccharide contents of ten Spirulina platensis
strains were studied. The results showed that the correlation coefficient between 60 Coγ2ray half2lethal dose (LD50 )
and polysaccharide contents of the 10 strains was 019873. After the single cells or spheroplasts of Sp208 were
treated by 016 %EMS and 214 kGy 60 Coγ2ray irradiation , four morphological mutant named Sp208A ,Sp208B ,Sp2
08C and Sp208D , which could endure about 710 kGyγ2ray irradiation , were obtained , The polysaccharide contents
of Sp208A , Sp208B , Sp208C and Sp208D , were 3218 % , 1713 % , 314 % and 4213 % higher than that of their
parent Sp208 , respectively. The results of protein SDS2PAGE analysis showed that the heredity of Sp208A , Sp208C
and Sp208D were mutated. Therefore , Sp208A was a perfect high2producing polysaccharide strain with excellent
characteristics of morphology and growth. Now , Sp208A is applied in mass cultivation and industrialization.
Key words : Spirulina ; polysaccharide ; mutant ; breeding ; anti2radiation
收稿日期 :2003201206
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30000010)
作者简介 :汪志平 (1968～) ,男 ,浙江建德人 ,博士、副研究员 ,主要从事核农学及海洋生物技术研究 , E2mail :zhpwang @zju. edu. cn多糖不仅是所有生物有机体的重要组成成分 ,而且具有重要而独特的生物学活性 ,如它可作为一种信息受体分子参与分子识别、细胞粘着及细胞防御等多种生命活动[1 ] 。螺旋藻 ( Spirulina)是一种古老的原核丝状放氧蓝藻 ,也是当前全球开发规模最大的经济微藻[2 ] 。众多研究与临床实践表明 ,螺旋藻多糖的分子结构独特 ,并具有高效的抗肿瘤、抗辐射及抗病毒等生理活性功效 ,近年来已成为国内外研究与
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开发的热点[3～6 ] 。但值得注意的是 ,目前有关螺旋藻多糖的研究 ,大多侧重其分离纯化及结构与功能方
面 ,而在高产技术方面则较少涉及[2～6 ] 。由于目前生产上所用的普通钝顶螺旋藻 ( Spirulina platensis) 或
极大螺旋藻 ( Spirulina maxima)的多糖含量普遍较低 ,且品种 (系)间的差异较大 ,加之多糖分离纯化时要
反复多次除去大量的蛋白质 ,致使螺旋藻多糖的提取率很低、制备成本昂贵 ,严重制约着螺旋藻多糖的
产业化进程[3 ,5 ,6 ] 。本文以多糖含量较高的钝顶螺旋藻为出发品系 ,利用诱变遗传育种技术育出 1 株高
产多糖的钝顶螺旋藻优良新品系 ,为加速螺旋藻多糖的产业化开发及其它生物高产多糖品种 (系) 的选
育 ,提供理论依据和技术支持。
1 　材料与方法
111 　供试材料
钝顶螺旋藻种 Sp201、Sp202、Sp204、Sp205、Sp207、Sp208、Sp210、Sp211、Sp212 和 Sp214 取自保存于本所
生物资源与分子工程实验室的菌种 ,它们均可用于工厂化生产。
112 　培养条件及生长速率测定
采用 Zarrouk’s 培养液培养[7 ] 。实验室培养在全自动温控光照培养箱中进行 ,光照强度为 4000lx ,光
照时间为 12hΠd ,光照时为 28 ℃,黑暗时为 20 ℃;工厂化培养试验在面积为 25 m2 的跑道式养殖池中进
行。生长速率测定参照文献[8 ]进行。
113 　诱变处理及突变体筛选
参照文献[9 ,10 ]的方法进行。
114 　多糖含量的测定
将被测材料放入烧杯 ,加 30 倍蒸馏水 ,80 ℃水浴保温 4h ,不时搅拌 ,离心 ,残渣同上操作 ,合并两次
上清液 ,加 3 倍无水乙醇沉淀多糖 ,离心分离 ,加水溶解 ,并定容。用硫酸 - 苯酚法[11 ] 测定多糖含量 ,以
葡萄糖溶液为标准 ,在 Ultrospec 2000 紫外 - 可见分光光度计 (瑞典) 上于 490nm 比色。除葡萄糖和苯酚
购自美国 Sigma 公司外 ,其它试剂均为国产。
115 　蛋白质 SDS2PAGE分析及藻丝体形态观察
参照文献[12 ]的方法进行。
2 　结果与讨论
211 　出发品系与突变体筛选条件的确立
表 1 分别为 10 株应用于工厂化生产的钝顶螺旋藻优良品系的多糖含量及在60 Coγ射线辐照下的半
致死剂量 (LD50 )和致死剂量 (LD) 。它们的多糖含量在 5185～8132 %之间 ,Sp208 的最高 ,Sp201 的最低 ;
它们对60 Coγ射线均有很强的抗性 ,但它们的抗辐射能力不尽相同 ,并与各自的多糖含量呈显著正相
关 ,各株系的LD50与多糖含量间的相关系数达 019873。
表 1 　钝顶螺旋藻的多糖含量与抗辐射能力的关系
Table 1 　The relationship between polysaccharide content and anti2radiation
capacity in Spirulina platensis
株系 strains 多糖 polysaccharide ( %) LD 350 (kGy) LD 3 (kGy) 株系 strains 多糖 polysaccharide ( %) LD 350 (kGy) LD 3 (kGy)
Sp201 5185 212 515 Sp208 8132 312 616
Sp202 8102 310 615 Sp210 7163 219 614
Sp204 6162 216 517 Sp211 6113 214 515
Sp205 7123 217 519 Sp212 8115 311 615
Sp207 7141 218 612 Sp214 7128 217 5193 LD50 :半致死剂量 (half2lethal dose) ;LD :致死剂量 (lethal dose) 。
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　　已有众多研究表明 ,螺旋藻对γ射线和紫外线等电离辐射具很强的抗性 ,其完整藻丝体在单一的电
离辐射作用下难以发生突变 ,只有将其制备成单细胞或原生质球后才有较好的诱变效果 ,并可望获得目
标突变体[8 ,9 ,13 ] 。上述结果不仅进一步表明螺旋藻的超强抗电离辐射能力 ,而且通过不同品系钝顶螺旋
藻间辐射抗性与多糖含量的比较 ,进一步显示了它们的抗辐射能力确与多糖含量密切相关 ,即多糖含量
越高 ,辐射抗性越强[8 ] 。因此 ,根据螺旋藻多糖含量与辐射抗性的正相关性 ,以及完整藻丝体在电离辐
射作用下的遗传稳定性 ,也许可用较高剂量的60 Coγ射线作为选育高产多糖螺旋藻突变体的筛选条件。
同时 ,本实验将上述 10 株钝顶螺旋藻中多糖含量最高的 Sp208 为出发品系 ,进行高产多糖钝顶螺旋藻
突变体的选育。
212 　高产多糖钝顶螺旋藻新品系的选育
将处于对数生长期的 Sp208 藻丝体用组织匀浆法制备成单细胞或原生质球 ,经 016 %的 ( EMS) 和
214 kGy 的60 Coγ射线复合诱变处理 ,培养成藻丝体后再逐步以高剂量的γ射线为选择压力 ,并对不同
形态的藻丝单体分离培养后 ,得到了 4 株对γ射线致死剂量高达 710 kGy 的株系 ,分别记为 Sp208A、Sp2
08B、Sp208C和 Sp208D (图 1) 。与出发品系 Sp208 相比 ,Sp208A 的螺旋度稍有增加 ;Sp208B 的长度几乎短
了一半 ; Sp208C 的长度约增加了一倍 ; Sp208D 的螺旋度明显增加 ,呈致密的弹簧形。同时 ,Sp208A、Sp2
08B、Sp208C和 Sp208D 的多糖含量比出发品系 Sp208 的分别提高了 3218 %、1713 %、2314 %和 4213 % ;生
长速率分别为 Sp208 的 10518 %、9817 %、8615 %和 6813 %(表 2) 。在培养过程中也发现 ,Sp208A 藻丝的
分散性和上浮性最好 ;Sp208B 的分散性和上浮性虽好 ,但因藻体小而难以采收 ;Sp208C和 Sp208D 均因藻
丝易相互缠绕、结块成团 ,而严重影响生长。
图 1 　螺旋藻形态突变体的形态特征 (显微放大倍数为 100 ×)
Fig. 1 　The morphological characteristic of the morphological mutants in Spirulina (100 ×)
表 2 　4 株螺旋藻形态突变体的多糖含量及生长速率
Table 2 　The polysaccharide contents and growth ratio of the four morphological mutants in Spirulina
株系 strains Sp208A Sp208B Sp208C Sp208D
多糖 polysaccharide ( %) 11105 9176 10127 11184
突变体生长速率ΠSp208 生长速率
mutants growth ratioΠgrowth ratio of Sp208 ( %) 10518 9817 8615 6813
　　多糖是生物体内重要的生化组成成分 ,要通过测定其多糖含量从庞大的生物群体中筛选出极个别
高产多糖的突变体是相当困难的 ,因而找出与多糖含量相关的筛选压力是选育高产多糖突变体的关键。
从上述 4 株形态突变体的多糖含量比出发品系的高 1713 %～4312 %的结果首次表明 ,高剂量γ射线可
作为选育螺旋藻高产多糖突变体的压力筛选因子。这一结论不仅对螺旋藻 ,而且对其它生物高产多糖
品种 (系)的选育与开发也具有重要的指导意义。同时 ,图 1 和表 2 显示 ,钝顶螺旋藻的辐射抗性与藻丝
体的螺旋度之间似乎存有相关性 ,即螺旋度越大 ,抗辐射能力越强。这也许是由于与辐射抗性呈正相关
的多糖是螺旋藻外鞘套和细胞壁的主要组成成分 ,而外鞘套和细胞壁则又是形成与维持藻丝体形态的
重要结构。这一结果和作者曾在研究不同品种 (系)螺旋藻多糖含量与辐射抗性关系时所得的结果相吻
合[8 ] 。当然 ,是否可依螺旋藻的螺旋度比较其多糖含量的高低 ,尚需作进一步研究。
213 　突变体的蛋白质 SDS2PAGE鉴定
153　5 期 高产多糖钝顶螺旋藻新品系的选育及蛋白质 SDS2PAGE鉴定
图 2 为 Sp208 及其 4 株形态突变体 Sp208A、Sp208B、Sp208C和 Sp208D 的蛋白质 SDS2PAGE图谱。这
5 株材料蛋白质的分子量及相对含量非常相近 ,但除 Sp208B 的蛋白质 SDS2PAGE图谱与 Sp208 的几乎完
全相同外 ,其余 3 株形态突变体之间 ,以及它们与亲本 Sp208 之间的蛋白质 SDS2PAGE 图谱则存有明显
差异。与亲本 Sp208 相比 ,Sp208 A 和 Sp208D 均缺失 122 kD 的蛋白带、Sp208 A 和 Sp208C 均多了 6217 kD
的蛋白带、Sp208A 和 Sp208D 均多了 3118 kD 的蛋白带。
图 2 　螺旋藻形态突变体的蛋白质 SDS2PAGE比较
Fig. 2 　The comparison of SDS2PAGE patterns among
the morphological mutants in Spirulina
M: protein marker ;1 :Sp208 ;2 :Sp208A ;3 :Sp208B ;4 :Sp208C;5 :Sp208D蛋白质是基因的表达产物 ,又是生物表现各种结构与功能的物质基础。汪志平曾报道 ,螺旋藻各藻株有其特征性的蛋白质谱带 ,并可作为螺旋藻分子水平分类和突变体鉴定的重要依据之一[12 ] 。上述 5 株材料的蛋白质 SDS2PAGE 图谱非常相近 ,与它们具有相同分子遗传背景的结果相吻合。同时 ,Sp208A、Sp208C 和 Sp208D 三者之间 ,以及它们与Sp208 之间蛋白质 SDS2PAGE 图谱的明显差异 ,又充分表明了 Sp208A、Sp208C 和 Sp208D 确为在分子遗传水平发生变异的 3 株高产多糖的目标突变体。蛋白质双向电泳可比上述单向电泳提供更丰富、全面的分子信息 ,Sp208B 和亲本 Sp208 之间的蛋白质
单向电泳图谱无差异 ,并不一定意味着 Sp208B 在
分子水平没有发生突变 ,而需要利用蛋白质双向电泳和 DNA 分子标记等技术进一步研究。
综上所述 ,上述 4 株形态突变体中 ,蛋白质 SDS2PAGE的结果已表明 Sp208A 、Sp208C和 Sp208D 确为
发生遗传变异的高产多糖突变体。其中 ,Sp208A 的多糖含量虽仅为 Sp208D 的 9313 % ,但它的生长速率
最快 ,为 Sp208D 的 1155 倍 ,并且最适合于工厂化养殖 ,因而是一株较理想的高产多糖钝顶螺旋藻新品
系。目前我们已实现 Sp208A 的大规模养殖与产业化开发 ,其高产多糖的分子遗传机理正在进一步研究
之中。
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