全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 062411205
苹果单倍体原生质体培养再生植株
何道一1 　孙　山2
(11 淮北煤炭师范学院生物系 ,安徽 淮北　235000 ;21 山东省果树研究所 ,山东 泰安　271000)
摘 　要 :以富士单倍体试管苗幼叶和幼叶诱导的愈伤组织为材料制备原生质体 ,采用不同培养
方法获得原生质体愈伤组织 ,在分化培养基上成功地诱导原生质体来源的愈伤组织再生不定
芽。试验结果显示试管苗幼叶诱导的愈伤组织是制备高质量原生质体的良好材料 ,每 g 愈伤
组织可制备原生质体 413 ×106 个 ;海藻酸钠球培养法是苹果原生质体培养的适宜方法 ,最终
植板率达 115 % ;在分化培养基中添加精氨酸能有效提高愈伤组织不定芽分化能力 ,原生质体
来源的愈伤组织分化频率高达 818 %。
关键词 :苹果 ;单倍体 ;原生质体 ;植株再生
PLANT REGENERATION FROM PROTOPLASTS OF HAPLOID INDUCED BY IRRADIATION IN APPLE
HE Dao2yi1 　SUN Shan2
(1. Department of Biology , Huaibei Coal Teacher College , Huaibei ,Anhui , 235000 ;
2. Shandong Institute of Pomology , Tai’an , Shandong , 271000)
Abstract :Protoplasts were prepared from young leaves and callus derived from young leaves of Fuji haploid shoots in
vitro. Protoplast callus was recovered under different culture protocols and bud regeneration was accomplished from
the protoplast callus. The results suggested that callus derived from the young leaves was suitable materials for prep2
aration of protoplasts and 413 ×106 protoplasts were obtained from 1 g callus. Among 3 different culture protocols ,
protoplasts embedded in sodium alginate bead have the highest FPE of 115 % , regeneration rate was up to 818 %.
The regeneration rate was significantly increased when Arg was added in the differentiation medium.
Key words :apple ; haploid ; protoplast ; plant regeneration
收稿日期 :2004204215
作者简介 :何道一 (1963～) ,男 ,安徽芜湖人 ,教授 ,博士 ,从事植物细胞与分子生物学研究。
植物的原生质体不仅是植物细胞学研究的良好材料 ,它在植物细胞壁再生、离子跨膜运输等基础研
究中具有其它材料难以替代的作用 ,特别是在 Carlson[1 ]利用原生质体融合创建第一个无性杂种植株后 ,
这一技术在作物特别是无性繁殖植物遗传改良上的应用前景更加诱人 ;同时随着更多功能基因的克隆
分离 ,原生质体又成为基因转化的良好受体[2 ] 。
苹果和其它多年生木本果树一样 ,遗传背景十分复杂 ,常规有性杂交育种周期长、效率低 ,植物原生
质体技术的发展为苹果的遗传改良增添一条新途径。
Niizeki [3 ]首次分离培养苹果花药愈伤组织原生质体并获得愈伤组织。1988 年 Patat2Ochatt[4 ] 首次获
苹果叶肉原生质体再生植株。但诱导苹果原生质体来源的愈伤组织分化再生不定芽一直非常困难 ,主
要在苹果砧木和实生苗上取得一些进展[5 ] 。
单倍体材料制备的原生质体在无性繁殖植物细胞工程技术中极具价值。Patat2Ochatt 等[6 ] 从品种金
帅自发单倍体试管苗叶和茎段分离制备原生质体 ,获得愈伤组织并再生植株 ,但不能生根。本文报道通
过辐射花粉诱发的单倍体植株幼叶诱导愈伤组织制备的原生质体培养和再生植株。
114　核 农 学 报　2004 ,18 (6) :411～415Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1 　材料与方法
111 　植物材料
苹果单倍体是我们利用辐射花粉授粉并结合幼胚培养技术获得的富士单倍体株系[7 ] 。用于制备原
生质体的幼叶取自置于弱光下培养的单倍体试管苗 ;用于制备原生质体的松散型愈伤组织是由试管苗
幼叶切碎后置于愈伤组织诱导培养基上 25 ℃黑暗条件下诱导 ,愈伤组织诱导培养基为 MS 基本培养基
附加 011mg·L - 1 2 ,42D 和 015mg·L - 1 BA。
112 　原生质体制备
11211 　酶液准备 :制备原生质体的酶液组成为 :10g·L - 1纤维素酶 (Onozuka R210) ,5g·L - 1果胶酶 (Macer2
ozyme R210) ,976mg·L - 1 MES ,10g·L - 1 PVP ,1g·L - 1牛血清蛋白或 1g·L - 1葡聚糖硫酸钾 ,溶解于 CPW 溶液
中。加入 100g·L - 1甘露醇调节其渗透压 ,酶液的 pH值调至 518。酶液分别经 0145μm 和 0120μm 孔径滤
膜两次过滤灭菌后备用。制备原生质体时材料与酶液的重量体积比为 1∶10。
11212 　幼叶原生体制备 :在 28 ℃黑暗条件下 ,幼叶和酶液一起在 30 转·min- 1的摇床上保育 14h。酶解
结束酶解液经 80μm 孔径的尼龙滤膜过滤 ,滤液 100g 离心 3min ,收集离心管底部原生质体 ,原生质体经
CPW溶液离心洗涤 2 次 ,液体培养基离心洗涤 1 次。原生质体置于 20 %蔗糖溶液的顶部 ,100g 离心
3min ,收集界面上的原生质体。原生质体的活力用 1g·L - 1 Evans Blue 染色观察 ,计算 10 个视野的平均
值。
11213 　愈伤组织原生质体制备 :愈伤组织和酶液在 28 ℃黑暗条件下静置保育 8h ,其间轻轻摇动 2～3
次。原生质体制备和观测方法同上。愈伤组织制备的原生质体不经纯化也可培养 ,能观察到原生质体
的分裂 ,但由于存在少量细胞碎片 ,影响后期原生质体分裂的调查。
113 　原生质体培养
11311 　液体浅层静置培养 :液体浅层静置培养是用液体培养基将原生质体稀释成每毫升 2 ×105 个 ,每
个培养皿接种 1ml 原生质体溶液 ,置 25 ℃、黑暗条件下静置培养。原生质体培养基以 Km8p 为基本培养
基再添加 30g·L - 1蔗糖、015mg·L - 1 NAA、015mg·L - 1 BA 和 015mg·L - 1 2 ,42D ,pH 为 518。以 55g·L - 1苷露
醇和 36g·L - 1葡萄糖保持培养基渗透压。培养前期每 10d 滴加无苷露醇和葡萄糖的新鲜培养基 ,培养后
期每 7d 更换一半培养基。初始植板率 ( IPE)在培养后 15d 进行观察 ,最终植板率 ( FPE) 在培养 60d 进行
观察。IPE和 FPE是以每个培养皿为统计单位。
11312 　琼脂糖固体培养 :将含有 112g·L - 1低熔点琼脂糖培养基预热并与每毫升 4 ×105 个原生质体等量
混合于培养皿中静置培养。培养基和观察时间同上 ,整个培养过程培养基不更换。
11313 　海藻酸钠球包埋培养是将 21g·L - 1海藻酸钠与每毫升 4 ×105 个原生质体等量混合滴于 212g·
L - 1 CaCl2 溶液中固化约 1h ,再接种到含有 2ml 液体培养基中于 25 ℃、黑暗条件下静置培养。所用培养
基同上 , IPE为每球中发生第一次分裂的原生质体数与每球接种原生质体数之比的平均值 ,FPE 为每球
肉眼可见的愈伤组织数与每球接种原生质体数之比的平均值。
114 　原生质体愈伤组织继代培养与分化的诱导
原生质体经 60d 左右培养 ,产生肉眼可见的愈伤组织 ,将这些愈伤组织分离出来接种到愈伤组织增
殖培养基上扩增培养 ,增殖培养基为 MS 基本培养基附加 011mg·L - 1NAA 和 011mg·L - 1BA。愈伤组织经
2 次继代扩增便可用于诱导分化 ,分化培养基为 MS 基本培养基附加 011mg·L - 1 NAA、510mg·L - 1 BA 或
210mg·L - 1 TDZ及其它有机物质。生根培养基为半量 MS 基本培养基附加 011mg·L - 1 NAA。继代、诱导
分化和生根培养都在 25 ℃、每天 16h 光照条件下进行。
2 　结果与分析
211 　不同材料制备原生质体的产量与活力
214 核　农　学　报 18 卷
试管苗幼叶和幼叶诱导产生的愈伤组织及其继代产物都可用于制备分离原生质体 ,但不同材料的
原生质体产量和活力差异较大。用试管苗幼叶制备的原生质体不如愈伤组织的纯净 ,原生质体大小也
不均匀 ,纯化后的产量和活力都不如幼叶愈伤组织的高 (见表 1) 。用幼叶愈伤组织分离制备的原生质
体大小均匀 ,质液浓厚 ,活力较高 (图 121) 。幼叶诱导的愈伤组织是制备原生质体的良好材料。
212 　不同培养方法对原生质体分裂的影响
采用不同的培养方法 ,原生质体初始植板率与最终植板率差异很大。液体浅层静置培养时原生质
体分裂早 ,初始植板率高 ,但原生质体易形成团聚体 ,最终植板率并不高。琼脂糖固体培养时原生质体
第 1 次分裂时间较迟 ,初始植板率不高 ,最终未能得到肉眼可见的愈伤组织。采用海藻酸钠球法培养 ,
原生质体第 1 次分裂的时间要比液体浅层培养的迟 ,初始植板率也比液体浅层培养的低 ,但最终植板率
明显高。结果见表 2。
213 　不同渗透压调节物质对原生质体分裂的影响
在原生质体培养的前期 ,需要用渗透压调节物质来维持培养基中的渗透压 ,使用不同的渗透压调节
物质时 ,苹果原生质体的初始植板率和最终植板率明显不同。实验结果见表 3 ,在苷露醇、葡萄糖和山
梨醇 3 者中 ,葡萄糖的效果最差 ;以 55g·L - 1苷露醇和 36g·L - 1葡萄糖共同调节培养基渗透压时 ,初始植
板率和最终植板率都最高。
表 1 　不同材料制备原生质体的产量与活力
Table 1 　The yield and availability of protoplasts prepared from different plant materials
植物材料
plant material
纯化前原生质体产量
protoplast yield before purification
(Πg·FW) 纯化后原生质体产量protoplast yield after purification(Πg·FW) 原生质体活力protoplast availability( %)
幼叶 young leaf 615 ×106 716 ×105 90
幼叶愈伤组织
callus from young leaf 413 ×106 310 ×106 94
表 2 　不同培养方法对原生质体分裂的影响
Table 2 　The influence on division of protoplasts cultured by different method
培养方法
culture method
第 1 次分裂时间
time of the first division
(d)
初始植板率
initial planting efficiency IPE
( %)
最终植板率
final planting efficiency FPE
( %)
液体浅层 shallow liquid 10 37 016
琼脂糖固体 solid agarose 13 15 0
海藻酸钠球 sodium alginate 12 30 114
表 3 　不同渗透调节物质对原生质体分裂的影响
Table 3 　The influence on division of protoplast cultured under different osmotic regulators
渗透调节物质
osmotic regulators
苷露醇
mannitol
葡萄糖
glucose
山梨醇
sorbitol
苷露醇 + 葡萄糖
mannitol + glucose
初始植板率 IPE( %) 28 6 30 34
最终植板率 FPE( %) 011 0 0112 115
表 4 　精氨酸对的愈伤组织分化的影响
Table 4 　The influence on plant regeneration of callus from protoplasts by arginine added in medium
处理
Test
愈伤组织数
No. of callus
绿色结节愈伤组织数
No. of green callus with node
有不定芽分化愈伤组织数
No. of callus with buds
分化频率 ( %)
Regeneration frequency
加精氨酸 arginine added 125 114 11 818
对照 CK 120 62 2 117
214 　原生质体培养、愈伤组织扩增和分化的诱导
经 10～13d 培养 ,苹果原生质体开始第 1 次分裂 ,第 1 次分裂为不均等分裂 (图 122) 。经 30d 培养 ,
314　6 期 苹果单倍体原生质体培养再生植株
图 1 　苹果单倍体原生质体培养及植株再生
Fig. 1 　Haploid protoplasts culture and plant regeneration in apple
1 :幼叶愈伤组织制备的原生质体 ;2 :培养的原生质体第一次不均等分裂 ,箭头所指 ;3 :培养的原生质体形成细胞团 ;4 :培养的原生质
体形成肉眼可见的愈伤组织 ;5 :绿色结节型愈伤组织分化不定芽 ;6 :再生芽不定根诱导 ;7 :移栽成活的植株
1 :Protoplasts prepared from callus derived from young leaves ; 2 :The first division of cultured protoplasts as arrows indicate ; 3 :Multi2celled conoly de2
rived from protoplasts ; 4 :Microcalli derived from protoplasts ; 5 :buds regeneration from green callus with node ; 6 :Root development in shoot ; 7 :Plant
in pot
　
形成多细胞团 (图 123) ;经 60d 左右培养 ,有肉眼可见的愈伤组织形成 (图 124) 。将这些愈伤组织挑出接
种到平面固体培养基上继代扩增 ,经 2 次继代约 60d 左右培养 ,将愈伤组织切割转入分化培养基上诱导
分化 ,在分化培养基上 ,愈伤组织逐渐分化产生两种不同类型的愈伤组织 ,一种是浅黄色颗粒型愈伤组
织 ,另一种是绿色结节型愈伤组织 ,前者经长时间培养也未见不定芽产生 ,后者经 60d 左右培养 ,愈伤组
织陆续分化产生不定芽 (图 125) 。
215 　精氨酸对愈伤组织分化的影响
在分化培养基中添加 10mg·L - 1精氨酸 ,绿色结节型愈伤组织比率明显提高 (见表 4) ,原为浅黄色颗
粒型的愈伤组织也可转变为绿色结节型愈伤组织 ,只有这类愈伤组织能够进一步分化不定芽。
216 　不定根诱导及植株移栽
将愈伤组织上产生的不定芽转接到芽增殖培养基上 ,经 20d 左右培养 ,1 个不定芽可产生 4～7 个芽
的芽丛。将 115cm 以上的芽转入生根培养基上诱导生根 ,10d 后开始生根 ,待不定根长至 1cm 时 (图 12
6) ,开始室外炼苗 ,经过 7d 左右炼苗 ,将试管苗移栽入细砂2珍珠岩2营养土混合基质中 (图 127) 。
3 　讨论
苹果试管苗幼叶[8 ] 、茎尖[9 ] 、茎段[6 ]以及愈伤组织[3 ] 和悬浮细胞[10 ,11 ] 都可用于制备原生质体 ,不同
的材料制备的原生质体在产量和活力存在差异。在试验中我们也发现幼叶、茎尖和茎段制备的原生质
体无论是产量还是活力都不如幼叶诱导的愈伤组织的。悬浮细胞制备的原生质产量和活力都较佳[12 ] ,
但悬浮细胞培养需多次继代 ,这对细胞的分化产生不利的影响 ,在诱导分化过程中我们也发现随继代次
数的增加愈伤组织不定芽再生能力逐渐丧失。以苹果试管苗幼叶诱导的愈伤组织制备的原生质体产量
高、活力强 ,幼叶诱导愈伤组织周期短 ,有些品种的幼叶还能产生胚性愈伤组织[13 ,14 ] ,这样的愈伤组织是
制备原生质体的理想材料。
不同的原生质体培养方法对愈伤组织的最终得率有很大影响。在我们所试的 3 种方法中 ,琼脂糖
固体培养最终不能得到愈伤组织 ;采用海藻酸钠球法 ,尽管初始植板率要低于液体浅层培养的 ,但愈伤
414 核　农　学　报 18 卷
组织得率明显较高。Perales 等[9 ]利用该方法在 7 个基因型材料上获得成功。海藻酸钠球法是较适宜的
苹果原生质体培养方法。
培养基中的渗透调节物质对原生质体培养也有较大的影响。在所试的苷露醇、山梨醇和葡萄糖 3
种物质中 ,单独使用任何一种效果都不理想 ,当苷露醇和葡萄糖结合使用愈伤组织得率明显提高 ,这和
林顺权等[15 ]在枇杷原生质体培养结果相似。
苹果原生质体来源的愈伤组织分化不定芽较为困难 ,一方面与材料基因型特性有关 ,也与诱导分化
的条件有关[14 ] 。在培养基中添加适当浓度的游离氨基酸及其衍生物可有效促进胚性愈伤组织形成[16 ] 。
我们在分化培养基中添加精氨酸 ,绿色结节型愈伤组织比率明显增加 ,不定芽分化率也显著提高。我们
在几个苹果品种原生质体愈伤组织诱导分化过程中也发现类似情况 ,其中机理有待进一步研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Carlson P S ,Smith H H ,Dearing R D. Parasexual interspecific plant hybridization. Proc. Natl . Acad. Sci . USA , 1972 ,62 :2292
[ 2 ] 　李向辉. 植物遗传工程的理想受体 :植物原生质体培养. 孙勇如 ,安锡培. 北京 :科学技术出版社 ,1991 ,p12～21
[ 3 ] 　Niizeki M ,Hidano Y,Saito K. Callus foremation from isolated protoplasts of apple. Jpn J Breed , 1983 , 33 :369～374
[ 4 ] 　Patat2Ochatt E M , Plant regeneration from protoplasts of apple roostocks and scion varieties.J Plant Physiol , 1988 , 153 :460～465
[ 5 ] 　潘增光 ,邓秀新 ,章文才. 苹果原生质体研究进展. 园艺学报 , 1997 , 24 (3) :239～243
[ 6 ] 　Patat2Ochatt E M ,Boccon2Gibod J ,Duron M ,Ochatt SJ . Organogenesis of stem and leaf protoplasts of a haploid golden delicious apple clone ( Malus
×domestica Borkh) . Plant Cell Reports , 1993 , 12 :118～120
[ 7 ] 　何道一 ,孙山 ,陈振光. 应用高剂量辐射花粉授粉及幼胚培养诱导苹果单倍体. 园艺学报 , 2001 ,28 (3) :194～199
[ 8 ] 　Wallin A ,Wilander M. Improved yield of apple leaf protoplasts from in vitro cultured shoots by using very young leaves and adding L2methionine to
the shoot medium. Plant Cell ,Tissue and Organ Culture , 1985 , 5 :69～72
[ 9 ] 　Perals E H ,Schieder O. Plant regeneration from leaf protoplasts of apple. Plant Cell ,Tissue and Organ Culture , 1993 , 34 :71～76
[10 ] 　Saito A ,Suzuki M. 2nd Asia2Pacific conference on plant cell and tissue culture2abstract . 1996 ,p74 Beijing
[11 ] 　丁爱萍 ,王洪范 ,曹玉芬. 苹果原生质体培养及植株再生. 植物学报 , 1994 , 36 (4) :271～277
[12 ] 　Ding A ,Wang H ,Cao Y. Plant regeneration from cotyledon and cell suspension protoplasts of apple ( Malus domestica cv. Starkrimson) . Plant Cell ,
Tissue and Organ Culture , 1995 , 400 :145～149
[13 ] 　何道一 ,李雅志 ,王其会. 不同基因型苹果的离体再生特性及对 NaN3 的反应. 核农学报 , 1997 , 11 (2) :84～88
[14 ] 　Paul H ,Belaizi M ,Sangwan2Norreel B S. Somatic embryogenesis in apple.J Plant Physiol , 1994 , 143 :78～86
[15 ] 　林顺权 ,陈振光. 山梨醇对枇杷原生质体分离和培养的效应. 福建农业大学学报 , 1997 , 26 (4) :401～406
[16 ] 　Shetty K,McKersie B D. Proline ,thioproline and potassium mediated stimulation of somatic embryogenesis in alfalfa ( Medicago sativa L. ) . Plant
Science , 1993 , 88 :185～193
更 正
在《核农学报》2004 年第 5 期中 ,由于本编辑部的工作疏忽 ,将傅俊杰先生的《辐照冻虾仁对其营养
品质影响的评价》一文标题误印为《辐照冻虾仁对其营养品质影响的影响》,在此更正 ,并向作者及读者
表示歉意 ! 希望作者及读者继续对本学报给予监督和支持。
《核农学报》编辑部
514Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2004 ,18 (6) :411～415