全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 052461205
影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析
秦永华1 ,2 　张上隆1
(11 浙江大学园艺系 ,浙江 杭州　310029 ;21 清华大学生物系 ,北京　100084)
摘 　要 :将构建的携带 N PT Ⅱ和 A P2D 基因的植物表达载体 pBI121 导入根癌农杆菌 EH105 中后 ,用其对
草莓主栽品种丰香叶盘进行遗传转化 , 探讨了卡那霉素 ( Kan) 的浓度、菌液浓度、侵染时间、预培养时
间、共培养时间和筛选方式等因素对转化率的影响。结果表明 :丰香草莓适宜的转化条件是 Kan 筛选浓
度为 20 mgΠL ,预培养时间为 2～3 d ,菌液浓度 OD600 013～015 ,侵染时间 10～20 min ;共培养 2～3 d 后将
外植体接到含有 5 mgΠL Kan 和 500 mgΠL Carb 的诱导培养基上进行培养 ,以后每次继代逐步提高 Kan 选
择压力至终浓度 20 mgΠL (每次增加 5 mgΠL) ;或共培养 2～3 d 后将外植体接到含有 500 mgΠL Carb 的诱
导培养基上 ,培养 2 周后继代到含 20 mgΠL Kan 和 400 mgΠL Carb 的培养基上进行选择培养。根据 PCR
检测结果 ,抗性愈伤组织转化率高达 1815 %。抗性愈伤组织经进一步诱导 ,最后获得了 17 株抗性植株。
本文探讨了影响丰香草莓转化的多个因素 ,以期建立高效的遗传转化体系 ,为草莓属植物种质的遗传转
化奠定基础。
关键词 :草莓 ;抗菌肽 D 基因 ;载体构建 ;遗传转化
FACTORS INFLUENCING THE EFFICIENCY OF AGROBACTERIUM2MEDIATED
TRANSFORMATION IN STRAWBERRY CULTIVAR TOYONOKA
QIN Yong2hua1 , 2 　ZHANG Shang2long1
(11 Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
21 Department of Biological Sciences and Biotechnology , Tsinghua University , Beijing 　100084)
Abstract :Various aspects of transformation were examined in efforts to improve the transformation frequency of strawberry
( Fragaria ananassa Duch. ) using Agrobacterium2mediated method based on constructing a plant expression vector pBI121
containing the N PT Ⅱgene and the antibacterial peptide2D gene ( A PD) . The results indicated that 20 mgΠL kanamycin
( Kan) was suitable for selection of transformation. The optimal pre2culture time was 2 - 3 d and then inoculated 10 - 20 min
with OD600 013 - 015 Agrobacterium , and co2cultured for 2 - 3 d in succession. The co2cultured leaf disks were transferred to
the inducing medium containing 5 mgΠL Kan plus 500 mgΠL Carbenicillin ( Carb) and Kan concentration was gradually
increased to 20 mgΠL (5 mgΠL Kan at a time) , or to the inducing medium containing 500 mgΠL Carb for two weeks and
transferred to the inducing medium supplemented with 20 mgΠL Kan plus 400 mgΠL Carb. Inoculated leaf explants produced
transgenic calli at a frequency of 1815 % according to PCR analysis. Seventeen transgenic lines were obtained and propagated
in the greenhouse for further analysis.
Key words : Fragaria ananassa Duch. ; antibacterial peptide2D gene ; construction of plant expression vector ; genetic
transformation
收稿日期 :2006211221
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30170648)
作者简介 :秦永华 (19762) ,男 ,河南南阳人 ,博士 ,研究方向为植物生理生化与分子生物学。E2mail : qyh6k @1631com
通讯作者 : 张上隆 (19332) ,男 ,福建古田人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为果树生理与分子生物学。E2mail : shlzhang @zju. edu. cn
164　核 农 学 报　2007 ,21 (5) :461～465Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　植物抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制
或杀灭作用的小分子多肽 ,其杀、抑菌谱广泛 ,能被细
菌、真菌或物理的、化学的刺激所诱导 ,有些抗菌肽甚
至可在植物体内组成性表达[1 ,2 ] 。有关植物与微生物
相互作用的分子生物学研究表明 ,小分子的抗菌肽基
因转入植物将大大提高农作物的抗性[3～5 ] 。抗菌肽 D
基因 (antibacterial peptide2D , A P2D) 是根据柞蚕抗菌肽
D 的序列合成的 ,是由 122 个碱基组成的双链 DNA ,其
结构已有较为详尽的研究[6 ,7 ] 。该抗菌肽抗菌能力强 ,
抗菌机制独特 ,有较强耐热性 ,在农业、医药及食品等
领域有着广泛的应用前景。
草莓是世界上重要的经济浆果之一。长期以来草
莓新品种选育的主要途径是杂交育种 ,但由于草莓本
身遗传性状的高度杂合和多倍性 ,使得常规育种费时
费力 ,育种效率低 ,严重制约了草莓生产的发展。现代
生物技术的飞速发展为草莓育种提供了新途径。用根
癌农杆菌介导法对草莓进行遗传转化是获得草莓新品
种的重要方法 ,它能够获得转基因植株 ,但转化频率
低 ,重复性差[8～11 ] 。另外 ,该方法受多种因素的影响 ,
如菌株类型、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养
时间、筛选方式等。本试验以丰香草莓叶片为外植体 ,
在建立高效再生体系的基础上[12～14 ] ,探讨了影响草莓
遗传转化的多个因素 ,以期建立高效、稳定的草莓遗传
转化体系 ,为草莓属植物种质的基因工程改良提供了
理论依据和技术参考。
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　供试材料　草莓品种“丰香”( Fragaria ananassa
Duch. cv Toyonoka) 组培苗、大肠杆菌 DH5α、农杆菌菌
株 EH105 和植物表达载体 pBI121 由本实验室保存 ,含
柞蚕抗菌肽 D 基因重组质粒 pUCm2APD 由华南农业大
学园艺系胡桂兵博士提供。
11112 　培养基　愈伤组织诱导、分化和外植体直接成
芽的 培 养 基 为 MS + 115 mgΠL TDZ + 014 mgΠL
IBA[12～14 ] 。培养基附加蔗糖 30 gΠL ,琼脂粉 615 gΠL ,调
节 pH 518。培养条件 :25 ℃±2 ℃,14 h 光照 (2000 lx) 。
112 　方法
11211 　植物表达载体 pBI1212APD 的构建 　用限制性
内切酶 BamH I 和 Sac I 双酶消化重组质粒 pUCm2
APD ,回收小片段 A P2D (约 120bp) ;同时回收 BamH I
和 Sac I双酶消化的植物表达载体 pBI121 大片段 (约
11 kb) 。回收的 A P2D 片段与载体 pBI121 用 T4 DNA 连
接酶连接 ,采用热击法将连接产物导入到大肠杆菌
DH5α感受态细胞 ,用 Kan 平板进行阳性克隆筛选。酶
切、连接、转化及回收等参照萨姆布鲁克的方法[15 ] 。
植物表达载体 pBI1212APD 构建如图 1 所示。
图 1 　pBI1212APD 表达载体结构图
Fig. 1 Plant expression vector of pBI1212APD
11212 　农杆菌的培养 　挑取含 pBI1212APD 质粒的
EH105 农杆菌单菌落接种到含 100 mgΠL Kan、75 mgΠL
利福平 (Rif) 和 75 mgΠL 硫酸链霉素 (Str) 的 YEP 液体
培养基中 ,28 ℃,180 rΠmin 培养至 OD600 0162018 ,然后
按 1 %～2 %的比例转入新配制的附加 100mgΠL Kan、
75mgΠL Rif 和 75mgΠL Str 的 YEP 培养液 (10gΠL 蛋白胨 ,
10gΠL 酵母提取物 ,5gΠL NaCl ,固体培养基 115 %琼脂)
中 ,在 28 ℃,180rΠmin 培养过夜 ,转入无菌离心管中 ,
4000rΠmin 离心 5min ,弃去上清液 ,用添加 200μmolΠL 乙
酰丁香酮 (AS)的 MS 液体培养基稀释备用。
11213 　外植体的制备　取完全伸展开的草莓叶片 ,去
掉边缘及主脉后切成 014 cm ×014 cm 的小块备用。
11214 　卡那霉素选择压的确定　将预培养 2 d 的草莓
叶盘接种在 Kan 为 0、5、10、15、20、25 mgΠL 的 MS 诱导 培养基上培养 ,1 个月后观察外植体的分化情况。11215 　不同抗菌素的抑菌效果　预培养 3 d 的外植体经含 pBI1212APD 的农杆菌 EH105 (OD600 015) 侵染 10min ,暗处共培养 2～3 d 后分别接种在含 0、200、300、400、500、600mgΠL 的羧苄青霉素 (Carb) 、头孢霉素 (Cef)和 Carb + Cef (1∶1) 分化培养基上 ,观察不同抗菌素的抑菌效果。11216 　影响农杆菌转化效果的因素1121611 　菌液浓度 　调 OD600值分别为 011、013、015、017、019 后侵染外植体 ,侵染时间 10 min ,暗处共培养3d 后进行选择培养。1121612 　侵染时间 　用 OD600 为 015 的农杆菌 EH105分别侵染外植体 5、10、20、30 min ,共培养 3d 后进行选择培养。
264 核　农　学　报 21 卷
1121613 　预培养时间 　将外植体分别预培养 0、2、3、
4、5 d 后用OD600为 015 的农杆菌 EH105 侵染 10 min ,暗
处共培养 3 d 后进行选择培养。
1121614 　共培养时间 　用 OD600 为 015 的农杆菌
EH105 将预培养 2 d 的外植体侵染 10 min ,暗处分别共
培养 1、2、3、4、5 d 后再进行选择培养。
1121615 　选择方式 　外植体被农杆菌侵染后暗处共
培养 3 d ,在抑菌培养基中加入 Kan ,采取逐步提高 Kan
筛选压 (每次增加 5 mgΠL ,至终浓度 20 mgΠL) 、保持 Kan
筛选压 (20 mgΠL)不变、延迟 2 周选择和延迟 4 周选择
等 4 种不同的方式进行选择培养。
以上所有试验处理均设 3 次重复 ,每重复 60 个外
植体 ,以未经侵染的外植体作为对照 ,每 2 周继代培养
1 次。培养 45 d 后 ,采用田长恩等合成的一对引物 ,用
PCR 检测抗性愈伤组织的转化率[16 ] 。
2 　结果与分析
211 　Kan 的抗性测定
Kan 对丰香草莓愈伤组织的诱导和不定芽的分化
有显著抑制作用 ,随着 Kan 浓度的提高 ,愈伤组织诱导
率和不定芽分化率显著降低。在含 5 mgΠL Kan 的分化
培养基上 ,愈伤组织的诱导率为 5017 % ,不定芽的分
化率为 2211 % ; Kan 浓度为 10 mgΠL 时 ,已诱导不出不
定芽 ,而愈伤组织的诱导率降为 2014 % ;当 Kan ≥20
mgΠL 时 ,愈伤组织的诱导及生长则完全受到抑制。当
Kan 浓度 ≤5 mgΠL 时 ,虽能诱导出愈伤组织和不定芽 ,
但筛选效果不明显。因此 ,适宜丰香草莓的 Kan 筛选
浓度为 20 mgΠL。
212 　抗生素对农杆菌的抑菌效果
由图 2 看出 ,相同浓度的 Cef、Carb 以及 Cef 与
Carb 等体积组合 3 种不同处理对农杆菌的抑制效果无
显著差异 ,但不同浓度对农杆菌的抑制效果有显著差
异 ,随着抗生素浓度的提高 ,外植体污染率逐渐下降。
当 3 种处理的浓度都为 600 mgΠL 时 ,几乎能完全抑制
农杆菌的生长。由于 Cef 对草莓外植体的正常分化和
生长有抑制作用 ,而 Carb 对草莓叶片不定芽分化影响
较小 ,当 Carb 浓度为 500 mgΠL 时 ,其再生率仍达到
4418 % ,因而在草莓遗传转化中 ,在选用 Carb 去除农
杆菌时 ,应在抑制住农杆菌的前提下尽量降低浓度。
213 　菌液浓度对转化率的影响
农杆菌菌液浓度直接影响丰香草莓的转化率 ,随
着农杆菌菌液浓度的增加 ,转化率显著提高 (图 3) 。
当OD600 值为 013～015 时 ,转化率无显著差异 ,均在
15 %以上 ,且选择培养时无农杆菌污染 ; OD600 ≥017
时 ,转化率明显降低 ,选择培养时出现大量农杆菌覆盖
在外植体上 ,致使部分外植体褐化、死亡 ,从而导致转
化率下降。因此 ,在草莓遗传转化时 ,适宜的菌液浓度
OD600为 013～015。
图 2 　头孢霉素及羧苄青霉素的抑菌效果
Fig. 2 　Effects of antibiotics concentration
on killing Agrobacterium
图 3 　菌液浓度对丰香草莓转化率的影响
Fig. 3 　Effects of Agrobacterium concentrations
on transformation frequency
214 　侵染时间对转化率的影响
侵染时间对丰香草莓的转化率有显著影响 ,随着
侵染时间的增加 ,转化率明显提高 (图 4) 。侵染时间
为 10 和 20min 时转化率最高 ,两者均在 15 %以上。当
侵染时间为 30min ,转化率明显下降 (812 %) ,且外植体
易褐化死亡。因此 ,在丰香草莓遗传转化时 ,侵染时间
以 10～20min 为宜。本试验农杆菌侵染草莓时间统一
为 10min。
215 　预培养时间对转化率的影响
预培养可以使细胞处于一种易于接受外来信息的
感受态 ,有利于根癌农杆菌的转化 ,同时可以减轻根癌
农杆菌对外植体的伤害 ,提高转化率。试验表明 ,适当
时间的预培养能提高转化率 (图 5) 。未预培养时 ,抗
性愈伤组织的转化率为 318 % ,预培养 2 d 时为 15 % ,3
364　5 期 影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析
d 时为 1617 %。但随着预培养天数的增加 ,转化率开
始下降 ,预培养 5 d ,转化率降至 412 %。不同时间的
预培养表明 ,预培养 2～3 d 时 ,转化率均在 15 %以上 ,
效果较好。
图 4 　侵染时间对丰香草莓转化率的影响
Fig. 4 　Effects of infection time on
transformation frequency
图 5 　预培养时间对丰香草莓转化率的影响
Fig. 5 　Effects of pre2culture time on
transformation frequency
216 　共培养时间对转化率的影响
共培养时间对丰香草莓的转化率有很大影响 ,随
着共培养时间的增加 ,转化率显著提高 (图 6) 。共培
养 1 d ,转化率仅为 115 % ;而共培养 2～3 d ,转化率达
16 %以上。随着共培养天数的增加 ,由于农杆菌在外
植体周围过度繁殖 ,部分外植体褐化、死亡 ,导致转化
率下降。共培养 5 d 时 ,转化率降低至 5 %。因此 ,在
丰香草莓遗传转化时 ,共培养时间以 2～3 d 为宜。
217 　筛选方式对转化率的影响
由图 7 可知 ,以逐步提高 Kan 筛选压为筛选方式
(每次增加 5 mgΠL , 至终浓度 20 mgΠL ) 转化率为
1815 % ,明显比保持 Kan 筛选压不变 (20 mgΠL) 的转化
率 (415 %)高 ;而延迟 2 周筛选的转化率 (1418 %) 则显
著比延迟 4 周 (615 %)筛选高。另外 ,共培养后立即筛
选 ,外植体切口褐化严重。因此 ,在丰香草莓遗传转化
时 ,以逐步提高 Kan 筛选压或延迟 2 周选择为宜。
图 6 　共培养时间对丰香草莓转化率的影响
Fig. 6 　Effects of the co2culture time on
transformation frequency
图 7 　筛选方式对丰香草莓转化率的影响
Fig. 7 　Effects of selection method on
transformation frequency
A :逐步提高 Kan 筛选压 ;B :保持 Kan 筛选压 (20mgΠL)不变 ;
C :延迟 2 周选择 ;D :延迟 4 周选择
A :increasing Kan concentration gradually ; B :keeping Kan at
20mgΠL ; C:postponing 2 weeks ; D :postponing 4 weeks
3 　讨论
农杆菌介导法是双子叶植物最理想的转化方法 ,
而根癌介导法受多种因素影响 ,不同植物或同一植物
的不同基因型对这些因素的要求可能不同。与其他转
化方法相比 ,农杆菌介导法具有转化率高、操作简单、
实验设备便宜、遗传稳定性好等优点。这些优点使其
成为植物遗传转化的首选转化系统 ,而大多数草莓转
化试验采用此系统。外植体经农杆菌侵染共培养后 ,
表面及浅层组织中共生大量农杆菌 ,必须进行脱菌培
养。农杆菌的有效去除对提高转化率非常重要 ,去除
不彻底会导致后期培养中外植体污染、褐化死亡。Cef
和 Carb 是杀菌和抑菌效果最好的抗生素。试验表明 ,
464 核　农　学　报 21 卷
在丰香草莓遗传转化中 ,以 500mgΠL Carb 抑菌为宜 ,在
达到抑制农杆菌目的后 ,应尽量降低其浓度。另外 ,农
杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间等都会影响转化
率。菌液浓度太低、侵染时间和共培养时间太短均不
利于农杆菌附在外植体上 ,影响转化效果 ;而菌液浓度
过高、侵染时间或共培养时间过长则会导致农杆菌增
殖过多 ,在后期培养中很难去除 ,造成外植体腐烂、死
亡。本试验表明 ,适宜丰香草莓遗传转化的条件是菌
液浓度 OD600为 013～015 ,预培养时间为 2～3d ,侵染时
间为 10～20min ,共培养时间为 2～3d。
Kan 是植物遗传转化中最常用的选择剂 ,用适当
浓度的 Kan 对转化材料进行筛选是获得抗性芽的关
键。Kan 浓度太高 ,对转化细胞造成强烈的毒害作用 ,
致使大量外植体在选择培养基上死亡 ;浓度太低 ,对抗
性芽不能进行严格筛选 ,会产生假抗性芽和大量嵌合
体。不同草莓品种对 Kan 敏感性不同 ,需通过试验来
确定适宜的浓度[17 ,18 ] 。邓馨等[17 ] 在草莓 M14转化中以
50mgΠL Kan 进行筛选 ;而张志宏等[18 ] 在草莓 Tudla 遗
传转化中发现 25mgΠL Kan 筛选效果较佳。本试验表
明 , Kan 对丰香草莓愈伤组织和不定芽的诱导有很强
的抑制作用。分化培养基中添加 10mgΠL Kan 就可完
全抑制不定芽的发生 ,添加 20mgΠL ,愈伤组织的诱导
及生长完全受到抑制。因此 ,在丰香草莓遗传转化中 ,
当以 N PT Ⅱ基因作为选择标记基因 ,在进行抗性芽的
诱导时 ,Kan 浓度以 20mgΠL 为宜。
转化细胞和非转化细胞在生长发育中存在竞争 ,
如何选择转化细胞是获得成功的重要环节。筛选方式
有逐步提高筛选压、保持较高的筛选压和延迟筛选 3
种。本试验表明 ,叶盘共培养后立即转移到含 Kan 的
筛选培养基上 ,叶盘易褐化、死亡 ,导致转化率降低 ;而
逐步提高 Kan 筛选压比一直在 20 mgΠL Kan 筛选压进
行筛选培养转化率高 ,可能是逐步提高 Kan 选择压力
可以增强转化细胞的竞争力 ,从而提高转化率 ,这与
Helena 等的研究结果一致[19 ] 。非转化细胞同样能生
长 ,同时对转化细胞有滋养作用 ,延迟选择有利于转化
细胞分化及转化细胞团或芽原基的形成 ,从而提高转
化率[20 ] 。Nehra[21 ,22 ] 在草莓 Redcoat 转化中 ,对共培养
后的外植体延迟 10d 进行选择培养 ,结果转化率从
3 %提高到 7 % ,故认为延迟选择是提高转化率的关键
因素之一。本研究表明 ,延迟 2 周筛选能显著提高丰
香草莓转化率。延迟时间太短 ,由于转化细胞尚未开
始分化 ,抗性基因没有完全表达 ,转化率较低 ;延迟时
间过长 ,非转化细胞分化过多会影响转化细胞的分化 ,
而且假转化体增多 ,工作量增大 ,费时费力。因此 ,在
丰香草莓遗传转化中 ,以逐步提高 Kan 筛选压或延迟
2 周选择为宜。
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