全 文 ：　文章编号 :100028551 (2001) 0120026206
纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究
董志扬1 　祝令香1 　于　巍1 　林　敏2 　平淑珍2
(11 中国科学院微生物研究所酶室　北京　100080 ; 21 中国农业科学院原子能利用研究所　北京　100091)
摘　要 :本研究通过γ射线照射和亚硝基胍交替处理 ,诱变出一株纤维素酶高产菌株
T801 ,与出发菌株相比 ,其产酶能力提高 1177 倍。通过对诱变菌株产纤维素酶条件
研究发现 ,以稻草粉为碳源、蛋白胨为氮源时 ,菌株产酶最高。该菌株产酶最适培养
温度为 28 ℃～30 ℃,最适培养 p H 为 418～510 ,在此条件下发酵五天达到产酶高峰。
该诱变株产酶能力高于国内外一些已知的纤维素酶高产菌株如 QM9414 等 ,具有重
大的实用价值。
关键词 :纤维酶 ;诱变 ;康宁木霉
收稿日期 :2000208207
基金项目 :微生物资源前期开发国家重点实验室资助课题 ,课题号 :1018
作者简介 :董志扬 (1963～) ,男 ,四川自贡人 ,博士 ,中国科学院微生物研究所副研究员 ,主要从事微生物酶学研究。
纤维素是由葡萄糖通过β21 ,6 糖苷键连接而成的线性大分子 ,它是自然界中最丰富的能
源物质 ,约占地球全部植物总量的三分之一 ,全世界每年产生数以百亿吨的木质纤维素 ,除部
分用于纺织、造纸、饲料和燃料加工外 ,绝大部分被微生物利用掉[1 ] 。微生物主要通过纤维素
酶将纤维素降解为葡萄糖而加以利用 ,因此加强对纤维素酶的研究对开发利用纤维素这一巨
大资源具有积极深远的意义。
丝状真菌 T richoderm a 是公认产纤维素酶最高的菌种之一[2 ,3 ] ,也是目前纤维素酶工业
化生产的主要菌种。长期以来 ,国内纤维素酶生产多采用固体培养方法。液体培养方法虽深
受重视 ,但缺乏高活力菌种 ,因此选育诱变高活力产酶菌株是关键问题之一。γ射线和亚硝基
胍诱变都是非常有效的菌株诱变技术 ,已广泛用于微生物菌种诱变选育[4 ] 。
我们曾报道选育出 1 株纤维素酶高产菌株木霉[5 ] ,将其应用于工业化生产 ,取得良好效
果。我们在此基础上通过物理和化学因素的复合处理 ,诱变选育出 1 株纤维素酶产量更高的
菌株并对其产酶条件进行了研究。
1 　材料和方法
111 　菌种
试验所用出发菌种康宁木霉 T205 ,由微生物研究所酶室保存。
112 　培养基和培养方法
11211 　试管斜面种子 　将菌种接种于麦芽汁斜面培养基上 ,29 ±1 ℃培养 4d 后使用或 4 ℃下
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保存。
11212 　产酶基本培养基和培养方法 　250ml 三角瓶装稻草粉 (40 目、0145cm 孔径) 115g ,麦麸
019g ,015 %牛肉蛋白胨溶液 (自来水配制) 30ml ,起始 p H418 ,105 Pa 灭菌 30min ,接种斜面孢子
1 环 ,29 ℃旋转式摇床上振荡 (280r/ min)培养 5d ,离心上清液即为纤维素酶溶液。
113 　诱变方法
纤维素酶产生菌康宁木霉 T215 突变体的选育程序见图 1。
诱变处理过程
mutation course
FP 酶活力
FP activity (U/ ml)
诱变效率 (相对产酶能力)
mutation efficiency ( relative cellulase
production capability)
康宁木霉 T205 Tri2
choderma kÊningii
T205
　
亚硝基胍 0102 %、
p H26、30 ℃、30min
nitrousguanidine
22 100 %
康宁木霉 G418 Tri2
choderma kÊningii
G418
　
60Co 650 Gy、
48min
28 127 %
康宁木霉 D221 Tri2
choderma kÊningii
D221
　
亚硝基胍 0102 %、
p H6、30 ℃、40min
nitrousguanidine
34 155 %
康宁木霉 T801 Tri2
choderma kÊningii
T801
39 177 %
图 1 　纤维素酶产生菌康宁木霉 T215 突变体的选育程序
Fig. 1 　Screening procedure of the cellulase2producing mutant st rains
11311 　亚硝基胍处理 　在木霉分生孢子悬液中加入亚硝基胍至 0102 % ,p H610、30 ℃处理
30min。
11312 　γ射线 (60Co)照射 　在 115ml 试管中加入 015ml 分生孢子悬液 ,并加入一定量放线菌
素 D 溶液 ,在 30 ℃作用 1h ,然后用 650 Gy 60Co 照射 48min (致死率为 95 %) 。
114 　酶活力测定方法
利用 3 ,52二硝基水杨酸试剂比色法测定酶水解底物产生的还原糖[6 ] ,每小时水解底物
(在 p H418、0105mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液中)生成相当于 1mg 葡萄糖的还原糖所需酶量
定义为 1 个酶活力单位 (U) 。
11411 　CMC2Na 活力 　114ml 1 %CMC2Na 溶液与 011ml 酶溶液于 50 ℃反应 24h。
11412 　脱脂棉活力 　50mg 脱脂棉于 1ml 缓冲液中 ,加 015ml 酶液于 50 ℃反应 30min。
11413 　水杨苷活力 　1ml 1 %水杨苷溶液与 015ml 酶液 50 ℃反应 30min。
11414 　滤纸活力 　1cm 宽、50mg 重的新华 1 号滤纸条于 1ml 缓冲液中 ,加 015ml 酶液 ,于
50 ℃反应 1h。
72　1 期 纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究
2 　结果和讨论
211 　变异菌株的获得
采用化学方法 (亚硝基胍)和物理方法 (60 Co 照射) 交替复合处理 (表 1) ,先利用亚硝基胍
处理出发菌株 T205 ,分离得到菌株 G418 ,再用γ射线和放线菌素 D 处理菌株 G418 ,得 D221 ,
再用亚硝基胍处理 D221 ,最后分离得到变异菌株 T801。其产酶能力提高 1177 倍 (图 1) 。
表 1 　不同植物残体碳源对产酶的影响
Table 1 　Effect of carbon sourse on production of cellulase
碳源 carbon source FP 酶活力 FP activity (U/ ml)
玉米轴粉 corn powder 20
玉米秸粉 corn straw powder 32
稻草粉 straw powder 38
麦秸粉 wheat straw powder 12
高梁秸粉 broomcorn straw powder 12
谷壳 chaff 9
麦麸 wheat bran 10
212 　变异菌株产酶条件
21211 　碳源对产酶的影响 　固定麦麸量 (3 %) ,比较不同农作物残体碳源 (5 %)对产酶的影响
可以看出 ,稻草粉效果最佳 ,FP 酶活力达 38U/ ml (表 1) 。试验了一些常用的单糖和二糖对产
酶的影响 ,结果表明所试糖的效果低于稻草粉。
变动稻草粉和麦麸用量 ,进行产酶试验结果表明 ,当稻草粉与麦麸用量之比为 5∶3 时酶活
力最高 (表 2) 。
表 2 　稻草粉和麦麸用量对产酶的影响
Table 2 　Effect of wheat st raw and straw powder on production of cellulase
稻草粉 straw powder (g) 0 0. 6 1. 2 1. 5 1. 8 2. 1 2. 4
麦麸 wheat bran (g) 2. 4 1. 8 1. 2 0. 9 0. 6 0. 3 0
FP 酶活力 FP activity (U/ ml) 10 19 34 39 32 24 19
21212 　氮源对产酶的影响 　改变产酶基本培养基氮源种类 ,进行产酶试验结果说明 ,有机氮
优于无机氮 ,其中以牛肉蛋白胨为最佳 (表 3) ,本研究选择牛肉蛋白胨为氮源。
表 3 　不同氮源对产酶的影响
Table 3 　Effect of nit rogen source on production of cellulase
氮源 nitrogen source 用量 concentration ( %) FP 酶活力 FP activity (U/ ml)
(NH4) 2SO4 0. 4 21
(NH4) 2HPO4 0. 5 18
NH4Cl 0. 4 15
NH4NO3 0. 4 20
NaNO3 0. 4 23
(NH4) 2CO3 0. 2 12
酵母膏 yeast extract 0. 5 34
牛肉蛋白胨 peptone 0. 5 38
对照 control 0 17
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　　表 4 比较了牛肉蛋白胨浓度对产酶的影响 ,可以看出 ,当牛肉蛋白胨浓度等于或大于
015 %时 ,都可以得到满意的结果。考虑到大规模生产酶需兼顾酶活力和酶的成本 ,故采用
015 %浓度为宜。
表 4 　牛肉蛋白胨浓度对产酶的影响
Table 4 　Effect of peptone on production of cellulase
牛肉蛋白胨浓度
peptone concentration ( %) 0 0. 25 0. 5 1 1. 5 2 2. 5
FP 酶活力 FP activity (U/ ml) 17 31 38 41 41 43 43
21213 　培养基起始 p H 对产酶的影响 　将培养基 p H 调至不同的值 ,进行培养。图 2 结果表
明 ,产酶适宜 p H 为 415～513 ,最适 p H 为 418～510。
21214 　培养温度对产酶的影响 　于不同温度下进行产酶试验结果表明 ,产酶最适培养温度为
28～30 ℃(图 3) 。
图 2 　培养基起始 p H 对产酶的影响
Fig. 2 　Effect of p H of culture medium on production of cellulase
图 3 　培养温度对产酶的影响
Fig. 3 　Effect of culture temperature on production of cellulase
21215 　培养时间对产酶的影响 　于不同培养时间取样 ,测定酶活力。图 4 结果表明 ,培养 5d
92　1 期 纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究
产酶达到高峰。
图 4 　产酶时间过程
Fig. 4 　Time course of cellulase production
■—■:不同培养时间产酶活力　Cellulase activity in different time
●—●:发酵液 p H 变化　Change of medium p H
表 5 　通气量对产酶的影响
Table 5 　Effect of aeration on
production of cellulase
培养基体积
medium volume (ml) 20 30 40 50 60
FP 酶活力
FP activity (U/ ml) 34 39 33 25 17
21216 　通气量对产酶的影响 　250ml 三角
瓶装不同量培养基 ,进行产酶试验。表 5 结
果说明 ,250ml 三角瓶装 20～40ml 培养基均
能获得最佳产酶效果 ,可见允许通气量范围
较宽。
21217 　菌种产酶能力的比较 　在上述试验
出的最佳产酶条件下 ,比较几种木霉的产酶
能力列于表 6。结果表明 ,本实验菌康宁木霉 T801 产酶能力最高。
表 6 　菌种产酶能力比较
Table 6 　Capability of cellulase production of variable st rains
菌种
strains
Cx 酶活力
Cx activity (U/ ml)
C1 酶活力
C1 activity (U/ ml)
β2葡糖苷酶活力
β2glycosidase activity (U/ ml) FP 酶活力FP activity (U/ ml)
T801 870 140 7 39
CP88329 400 69 5 18
T205 540 87 6 23
M9414 310 55 4 14
　　上述实验表明 ,通过化学和射线照射交替作用可有效地提高木霉产纤维素酶的能力 ,通过
此法诱变选育出的菌株产酶能力高于目前公认的纤维素酶高产菌种木霉 QM9414 ,同时诱变
株具有较好的稳定性 ,可利用丰富的农作物废弃物如秸秆、稻草等为主要原料 ,在常规的发酵
条件和设备生产纤维素酶 ,目前 T200 系列菌株已成功应用于纤维素酶工业化生产[5 ] ,相信该
活力更高的诱变株 T801 能很快应用于生产。
03 核　农　学　报 15 卷
参考文献 :
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MUTANT STRAIN SCREENING AND ITS ENZYME PRODUCTION
CONDITIONS OF CELL ULASE
DON G Zhi2yang 　ZHU Ling2xiang 　YU Wei
( Instit ute of Microbiology , The Chinese Academy of Sciences , Beiji ng 100080)
L IN Min 　PIN G Shu2zhen
( Instit ute of A pplication of A tomic Energy , CA A S , Beiji ng 100094)
ABSTRACT : Trichoderma kÊningii T2801 , which can produce relatively high cellulase , was iso2
lated. The abil ity of producing cellulase of mutant T2801 had increased 1177 times after treated
with nitrousguanide and γ2ray and was higher than that of Trichoderma QM94141The medium
with stra w powder as carbon source and peptone as nitrogen source is optimal and the maximum
cellulase activity is reached at 30 ℃and pH510 when cultured for 5days.
Key words :cellulase ; mutation ; T richoderm a kÊni ngii
13Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2001 ,15 (1) :26～31