全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 032195203
木霉的空间诱变效应
田兴山1 　张玲华1 ,2 　郭勇2 　周风珍1 　黄小光1
邝哲师1 　潘木水1 　李国立1
(11 广东省农科院农业生物技术研究所 , 广东 广州　510640 ;21 华南理工大学生物工程学院 , 广东 广州　510640)
摘 　要 :本文对产纤维素酶的木霉菌孢子和斜面培养菌体搭载中国第 18 颗返回式卫星后 ,菌落
形态和产酶能力的变化进行了研究。实验结果表明 ,搭载菌株的菌落形态发生变异 ,菌株的生
长周期出现了缩短或延长的现象。对搭载的木霉菌株进行筛选 ,获得 3 株产酶能力大幅度提
高的优良突变菌株 ,产酶能力提高了 50 %以上 ,且性状遗传稳定。
关键词 :纤维素酶 ;木霉菌 ;空间诱变
SPACE MUTAGENIC EFFECT OF Trichoderma Reesei
TIAN Xing2shan1 　ZHANGLing2hua1 ,2 　GUO Yong2 　ZHOU Feng2zheng1
HUANG Xiao2guang1 　KUANG Zhe2shi1 　PAN Mu2shui1 　LI Guo2li1
(11Bio2Tech Research Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou , Guangdong , 510640 ;
21South China University of Technology , Biological Engineering Institute , Guangzhou , Guangdong , 510640)
Abstract :The slant mycelia cultured with or without mutagenic agent diethyl sulfate (DS) and spores of Trichoderma
reesei were loaded in the 18th returning satellite. Systematical screening showed that the life cycle and morphology of
some strains had changed after space flight . After selection and domestication , 3 mutant strains with high cellulose
enzyme activity were isolated. The cellulose enzyme productivities of the mutants were significantly increased more
than 50 % , and the mutant were generically stable.
Key words :cellulose enzyme ; Trichoderma reesei ; space2induced mutant
收稿日期 :2004206228
作者简介 :田兴山 (1964 - ) ,男 ,河南新县人 ,研究员 ,博士 ,从事农业生物技术方面的研究。Email :xstian @163. net
太空环境具有强辐射、微重力、高真空度等特点 ,为微生物育种提供了地球表面无法比拟的诱变环
境。近年来我国航天育种科学发展迅速 ,产超氧化物歧化酶的芽孢杆菌、产邻苯二酚 1 ,2 - 双加氧酶的
假单胞菌、产谷氨酰胺转胺酶链霉菌、甘露聚糖酶产生菌等在空间诱变条件下 ,都发生了一定程度的正
突变[1～3 ] 。本研究将产纤维素的木霉菌种搭载返回式卫星 ,开展空间诱变育种技术研究 ,试图获得一些
生理生化性能和遗传性状稳定、产酶能力高的突变株。
1 　材料与方法
111 　材料
所用菌种为本研究室保藏的木霉菌 ( Trichoderma reesei)纤维素酶生产菌株 ,产酶能力为 2530UΠg。实
验所用培养基为斜面培养基 :麦芽汁斜面培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( PDA) ;固体培养基由稻草
粉 40g ,麸皮 60g , (NH4 ) 2 SO4 2g ,微量元素母液 10ml 组成。
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112 　搭载分组情况
对照组 (CK) :菌株以麦芽汁培养基斜面培养 72h 后 ,用无菌生理盐水清洗 ,过滤制成含约 1 ×107 个Πml 个的孢子悬液 ,不搭载 ;孢子悬液组 (Tr1) :上述孢子悬液 ,搭载 ;斜面培养组 ( Tr2) : 用孢子悬液转接
麦芽汁培养基 ,30 ℃培养 72h 后 ,搭载 ; 硫酸二乙酯 (DS)诱变组 (Tr3) :以麦芽汁培养基培养菌体 72h 后 ,
转接含有 1 %质量浓度 DS 的麦芽汁斜面 ,搭载 (2 个重复) 。
113 　搭载过程
搭载试验样品的返回式技术卫星 18 于 2003 年 11 月 3 日在中国酒泉卫星发射中心由“长征”二号丁
运载火箭发射升空 ,经过 18d 的轨道运行 ,卫星返回舱于 2003 年 11 月 21 日在四川省中部着陆回收。
2003 年 11 月 22 日样品被送至航天城 ,随即送回至广东省农业科学院。
114 　空间诱变菌株的菌落培养
将各搭载试管中的孢子用无菌生理盐水轻轻洗出 ,离心洗涤 2 次。适当稀释后 ,以麦芽汁培养基活
菌计数 ,培养 72～96h ,观察菌落形态 ,并计算存活率和形态突变率 ,其中 :
存活率 = (空间诱变菌株的生长菌落数Π未经空间诱变菌株的生长菌落数) ×100 %
形态突变率 = (空间诱变菌株平板的形态突变菌落Π经空间诱变菌株平板的总菌落) ×100 %
115 　高产酶突变株的筛选
采用刚果红透明圈法[4 ]初步淘汰低产酶菌株 ,并在麦芽汁培养基上将初步筛选出的高产空间诱变
菌株进行 3、4 代传代培养 ,以初步确保菌株性状稳定性。将初步筛选出的菌株 ,转接至麦芽汁培养基
上 ,培养 72h 后 ,制成孢子悬液 ,接种到固体培养基培养 72h ,测定酶活。纤维素产酶活力的检测采用改
良的 DNS 法[5 ] 。
酶活提高率 :经不同空间诱变处理后筛选出的菌株产酶活力为 A ,对照菌株经固体发酵后测定的产
酶活力为 B ,则 :酶活提高率 = (A - B)ΠB ×100 %
116 　数据分析
试验数据以均值( X ±SD)表示 ,统计学处理采用 SPSS1010 软件进行方差分析。
2 　结果
211 　空间条件对木霉的生长及形态的影响
木霉经空间搭载后 ,形态、生长周期及存活率均发生了一定的变化 (表 1 ,2) ,菌落形态由圆形变为
不规则形 ,菌落突起程度明显 ;培养 72h ,菌落色泽由淡绿色变为深绿或暗绿色 ,且菌落直径由 115cm 变
为 012～413cm。Tr1 生长成熟时间比对照快 24h ,形态突变率达到 22101 % ,而 Tr2 的生长周期未发生明
显变化 ,形态突变率也低 ;经核酸二乙酯 DS 处理过的 Tr3 则生长比对照慢 ,形态突变率高达 49184 %。
搭载后的菌株存活率以 Tr1 最高 ,其次是 Tr2 ,经 DS 处理过的 Tr3 的存活率很低 ,只有 4181 %。
表 1 　卫星搭载对木霉生长周期及形态变化情况
Table 1 　The life cycle and morphology changes of Trichoderma reesei loaded in satellite
组别
treatment
培养时间 culture time (h)
12 24 48 72 96
CK 无菌落 no colony 菌 落 可 见 , 灰 白 色
visible ,hoary colony
菌落清晰 ,孢子可见 ,
浅 绿 色 clear , aqua
colony , visible spore
孢子丰富 ,松散 ,浅绿
色 rich , incompact , aqua
spore
生 长 成 熟 , 绿 色
mature , green colony
Tr1
菌落可见 ,灰白色
visible , hoary
colony
菌落清晰 ,孢子可见 ,
浅黄白色 clear , buff
colony , visible spore
孢子丰富 ,松散 ,浅黄
绿 色 rich , incompact
spore , buff2jade2green 生 长 成 熟 , 黄 绿 色mature , buff2jade2greencolony 生 长 成 熟 , 绿 色mature , green colony
Tr2 无菌落 no colony 菌 落 可 见 , 灰 白 色
visible , hoary colony
菌落清晰 ,孢子可见 ,
浅 绿 色 clear , aqua
colony , visible spore
孢子丰富 ,松散 ,绿色
rich , incompact , green
spore
生 长 成 熟 , 黄 绿 色
mature , buff2jade2green
colony
Tr3 无菌落 no colony 无菌落 no colony 菌 落 可 见 , 灰 白 色
visible , hoary colony
菌落清晰 ,孢子可见 ,
深绿 色 clear , bottle2
green colony , visible
spore
孢子丰富 ,松散深绿色
rich , incompact , bottle2
green spore
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表 2 　卫星搭载的木霉存活率及
形态突变率情况
Table 2 　The survival rate and morphology
mutation ratio of Trichoderma reesei loaded
in satellite ( %)
组别
treatment
存活率
survival
rate
形态突变率
morphological
mutation ratio
CK 100 0
Tr1 62102 22101
Tr2 47132 2112
Tr3 4181 49184212 　空间诱变后产酶木霉菌突变株的筛选利用产酶菌株能在红色平板上形成透明圈 ,且透明圈Π菌落直径比值大小大致反映产酶的高低[4 ] 这一特性 ,采用刚果红纤维素粉琼脂培养从分离的 1000 余株产酶菌中初筛到酶活较高的 12 株纤维分解菌。其中 ,从 Tr1 组中筛选出 1株 ;从 Tr2 组中筛选出 3 株 ,从 Tr3 组中筛选出 8 株。为从初筛菌株中再筛选到高产菌株 ,需要对每一株菌用接近于生产的培养条件进行复筛。复筛时可用几种有代表性的培养基 ,分别对每种菌作测定以避免优良菌株的遗漏 ,
但此方法工作量较大。考虑本研究是筛选降解纤维素的菌
株 ,因此选用稻草粉和麸皮作为复筛培养基。将初筛得到的 12 株菌制成孢子悬液 (107 个Πml) ,以 5 %浓度
接种于稻草粉和麸皮复筛固体培养基中 ,混匀于 30 ℃培养 72h ,50 ℃烘干后测酶活力。根据各菌株在固体
培养基上的产酶能力 ,得到酶活较高的 Tr3201、Tr3202、Tr2201 3 株菌株。
213 　高产菌株的遗传稳定性
对复筛选出的 3 株高产酶搭载菌株进行了突变菌株的遗传稳定性试验 ,每星期转接一次斜面 ,将斜
面菌体分别活化并进行固体发酵产酶实验 ,结果见表 3。结果表明 ,经过不同传代次数 ,酶的活性都较
稳定 ,未存在显著性差异 ( P > 0105) ,说明这 3 株高产突变株的遗传性状都相对稳定。
表 3 　高产酶菌株的酶活稳定性分析
Table 3 　Stability analysis of high cellulose enzyme productivity strains (UΠg)
高产酶菌株
high enzyme
productivity strains
传代次数 generations
1 2 3 4 5 6 7
CK 2530a 2420a 2500a 2440a 2550a 2210a 2100a
Tr2201 3500a 3200a 3250a 3650a 3450a 3300a 3600a
Tr3201 4010a 3870a 3970a 4000a 4100a 3800a 3970a
Tr3202 4560a 4300a 4800a 4500a 4340a 4600a 4430a
　　注 :不同传代次数的菌株酶活进行比较 ,带相同字母表示在 0105 水平差异不显著。
Note :The same letters after data mean no significont difference of enzyme activity at 0105 level betwee2n different generations.
3 　讨论
自 1987 年以来 ,我国学者利用航天育种技术提高微生物产酶活性。先后搭载了 10 多种微生物材
料 ,不同试验的结果显示 :纤维素酶、果胶酶、淀粉酶的产生菌选出效价成倍提高的菌株 ;双歧杆菌发生
良好的变异 ,菌株稳定性大大提高 , 芽孢杆菌的超氧化物歧化酶的活性也得到较大提高[9～12 ] ,结果显示
空间条件有可能显著地提高微生物中某些基因的突变频率[6～8 ] 。部分突变菌株已在生产上发挥良好的
作用。本研究表明 ,卫星搭载木霉有较强的诱变效应 ,菌株突变倾向于酶活的提高 ;空间诱变后菌株的
生长周期发生了延长或缩短的改变 ;菌落的形态和颜色也发生了一定的变化。通过刚果红培养基初筛 ,
结合固体培养基复筛 ,获得 3 株产酶活性高 ,且性状稳定的菌株。
本试验增添了硫酸二乙酯诱变组 ,目的在于促使常规的化学诱变剂在多种空间因素的协同配合下 ,
起到复合诱变作用 ,效果更加集中。卫星搭载结果表明 ,各试验组菌体相对于不搭载的对照组的存活率
均在不同程度上受到了影响 ,孢子组的存活率要明显大于麦芽汁斜面组。由此可见 ,卫星搭载过程中空
间环境的特殊状态对菌体的生长影响很大 ,化学诱变剂 DS 的存在所引起的致死作用非常明显 ,存活率
明显地下降。试验结果也发现 ,利用 DS 进行综合诱变 ,菌株的正突变率明显高于单独的空间诱变组 ,
说明化学诱变剂与空间条件中复杂的物理诱变因素能起到协同作用 ,从而进一步促进突变菌株的产酶
活性的提高。
参考文献 : (下转第 213 页)
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云水库周边不同孤立山头 ,而这些山上的土壤母质、植被类型、土地利用方式、微地形地貌差异很大 ,对
密云水库周边地区多个不同的孤高山坡的采样区中各采样点的回归模拟均可用三次曲线方程来表达。
以宝山寺采样区和北石城采样区为例 ( n = 20 ,5 各采样点 ,每个采样点取 4 个样品 ,取其平均值列于图
中)的回归方程与相关系数列于表 3 ,其相关系数达到 019 左右。
4 　结论
从上述研究结果可以得出以下结论 :
(1)根据对密云水库周边地区与白河上游土壤137 Cs 和210 Pb 的监测结果 ,137 Cs 分布规律基本符合地
形地貌的变化规律 :0～20cm 土层中山坡上137 Cs 含量低于坡中、坡下 ,但是如果山顶具有缓坡或山脚下
具有陡坡则137 Cs 含量变化规律相反。
(2)根据水利部标准与土壤137 Cs 监测结果 ,密云水库周边大部分地区土壤基本属于轻度侵蚀和中度
侵蚀 ,部分地区侵蚀情况严重 ,达到了剧烈侵蚀的程度。
(3)不同土地利用方式对土壤养分分布有直接的影响 ,有机质含量从高到低依次为灌丛、林地、果
园、农田 ;上游地区有机质含量高于水库周边地区土壤 ,证明人为活动加剧土壤侵蚀与有机质的流失。
(4) 对景观单一 ,地域较小的采样区的进行数学模拟 ,相关系数高达 019 左右。因此可以在监测土
壤137 Cs、210 Pb 含量变化的基础上 ,利用小区域数学模型 ,直接预报预测土壤有机质含量的变化 ,简化土壤
侵蚀和土壤有机质监测程序与分析测试过程。
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