全 文 ：文章编号 :100028551 (2000) 0220099205
侧孢霉利用玉米秸秆固体
发酵产生木质纤维素酶的研究
李 信1 刘 云1 计林贞2
(11 中国农业科学院研究生院生化与分子生物学教研室 北京 100081
21 中国农业科学院原子能利用研究所 北京 100094)
摘 要 :以农作物秸秆为主要原料 ,采用微生物固体发酵方式对侧孢霉 ( S porot richum
sp) . 产生木质纤维素酶进行了探讨。研究发现侧孢霉可降解作物秸秆的木质纤维 ,
降解作用强 ,同时提高了发酵底物的蛋白含量。玉米秸秆、稻草、麦草及甜菜渣是发
酵木质纤维素酶和单细胞蛋白的最适合发酵底物。在以玉米秸秆为原料的发酵过程
中 ,发酵到第 4 天菌体生长量达到最高值 ,比发酵初期的菌体生长量增加了 8 倍 ;发
酵第 6 天培养物的粗蛋白含量由起初的 10 %提高到 1715 % ,对底物纤维降解率达到
1316 %。侧孢霉在发酵过程中产生大量的木质纤维素酶 ,其中羧甲基纤维素酶 (CM2
Case) 、β2葡聚糖苷酶 (β2Gase) 、滤纸酶 ( FPase) 、木质素过氧化物酶 (LiP) 和赖锰木质
素过氧化物酶 (MnP)在本实验中进行了检测。结果表明 ,最大酶活性的产生时间是
在发酵的第 4 到第 6 天之间 ,其酶活性分别为 :羧甲基纤维素酶 240131 U/ g ,β2葡聚
糖苷酶 8617 U/ g ,滤纸酶 13418 U/ g ,木质素过氧化物酶 1414 U/ g ,赖锰木质素过氧
化物酶 17167 U/ g。
关键词 :侧孢霉 ( S porot richum sp . ) 玉米秸秆 固体发酵 木质纤维素酶
收稿日期 :1999209201
作者简介 :李信 (1949 —) ,男 ,黑龙江哈尔滨人 ,中国农业科学院研究生院副研究员。从事生化工程研究。
天然纤维素有机质是地球上最重要的可再生资源 ,世界上大约 50 %的生物量来自于天然
纤维素 ,估计年产量在 100～500 亿吨左右[1 ] 。我国是农作物秸秆及废弃物产量较大的国家之
一 ,年产量大约在 7 亿吨左右。如果使这些天然纤维素材料能充分而有效地利用 ,将成为缓解
当今人类面临的粮食、能源、环保三大危机以及实现农业可持续发展战略的重要途径之一。纤
维素材料的降解是自然界碳素循环的中心环节 ,人类可从中获得足够的能源、食物和化工原
料。目前这一自然过程的中间产物和绝大部分能量还没有被充分利用 ,而且大量纤维素废物
还导致了严重的环境污染[2 ] 。
目前 ,有关生物再生资源的利用研究已在世界各地展开 ,以未经处理的农作物秸秆及废弃
物作为主要原料的生物转化研究正在发展之中。直接利用农作物秸秆及废弃物通过微生物转
化生产纤维素酶和蛋白饲料引起了广大的关注[3 ,4 ] 。本研究以未经处理的农作物秸秆及废弃
物为主要原料 ,采用微生物固体发酵方式 ,对侧孢霉 ( S porot richum sp . ) 发酵产生木质纤维素
酶 ,对秸秆中纤维的降解及提高培养物中的蛋白含量进行了研究探讨。
99 核 农 学 报 2000 ,14 (2) :99～103Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1 材料与方法
111 微生物和培养条件
侧孢霉 ( S porot richum sp . )由中国农业科学院原子能利用研究所提供。菌株 PDA 斜面在
4 ℃冰箱条件下保存 ,用于本项研究。
11111 液体种子培养基 (g/ L) 纤维素 10 ;酵母粉 1 ;无机盐溶液 1 ml。
11112 固体发酵培养基 麸皮 :玉米秆粉 = 1∶9 ;无机盐溶液 1 % ;固液比 1∶315。培养基在
121 ℃,111 kg/ cm2 条件下灭菌 20min。
11113 种液的制备 :在 45 ℃条件下 ,培养 5d 的 PDA 斜面菌种挖块接入含有 50ml 液体种子
培养基的 250ml 摇瓶中 ,在 45 ℃、200rpm 旋转摇床条件下 ,培养 4～5d。以 4ml 的种液接种到
含有 20g 固体发酵培养基的 500ml 摇瓶中 (3 次重复处理)进行发酵试验。发酵温度 45 ℃条件
下发酵 6d。每天取样进行菌体生长量 (Biomass) 、培养物的粗蛋白含量和纤维降解量以及发酵
过程滤纸酶 ( FPase) 、羧甲基纤维素酶 (CMCase) 、β2葡聚糖苷酶 (β2Gase) 、木质纤维素过氧化物
酶 (Lip)和赖锰木质纤维素过氧化物酶 (MnP)活性变化的测定。
112 分析方法
11211 纤维素酶活性 滤纸酶活 ( FPase) [5 ] 、羧甲基纤维素酶 (CMCase) 和β2葡聚糖苷酶 (β2
Gase) [6 ]按前述方法测定。
11212 木质素酶活性 木质过氧化物酶 (LiP) 的活性采用 Tiem M. 等[7 ] 、赖锰木质素过氧化
物酶 (MnP)的活性采用 Michael H. G. 等[8 ]的方法测定。
11213 菌体生长量 含固物的菌体生长量 (Biomass) 测定采用葡萄糖胺方法[9 ,10 ] ,以 mg 葡
萄糖胺/ g 培养物干重来表示。
11214 粗蛋白含量 粗蛋白含量采用微量凯氏定氮法 ,经 N ×6125 计算获得。
11215 粗纤维含量 粗纤维含量测定方法见饲料分析及饲料质量检测技术[11 ] 。
11216 发酵 p H 发酵过程 p H 值变化采用 p H2HJ90 酸度计检测。
2 结果与讨论
211 不同农作物秸秆为底物的固体发酵
以不同农作物秸秆 (玉米秸秆、玉米芯、麦秆、稻草、甜菜渣、树枝、草粉)及废弃物 (棉籽饼、
豆渣、酒糟)作为发酵底物对侧孢霉 ( S porot richum sp . )固体发酵的菌体生长、增加底物的蛋白
含量和分解纤维的作用进行了研究。研究结果表明 ,侧孢霉对这些发酵底物具有很强的分解
作用和利用能力 (表 1) ,其中对玉米秆粉的菌体生长量增加最大 ,达 477 % ;对以甜菜渣为发酵
底物时的蛋白含量增加幅度及对其纤维的降解能力作用最大 ,分别达 138 %和 56 %。表 1 还
表明 ,侧孢霉具有降解棉籽饼棉酚的作用 ,降解率达 28 %。由实验结果可以看出 ,玉米秸秆、
稻草、麦草及甜菜渣粉是发酵木质纤维素酶的最适合发酵底物。从侧孢霉增加菌体生长量和
提高蛋白含量 ,特别是对纤维的降解作用的综合实验结果考虑 ,本研究选择玉米秆粉为下一步
木质纤维素酶发酵过程试验的发酵原料。
001 核 农 学 报 14 卷
表 1 农作物秸秆及废弃物作为发酵底物的侧孢霉( Sporotrichum sp. )固体发酵
Table 1 The solid state fermentation by Sporotrichum sp . using agricultural stalks
发酵底物
substrates
菌体生长量※
biomass
0day 6day
粗蛋白含量
grude protein ( %)
0day 6day
粗纤维含量
crude fibre ( %)
0day 6day
棉酚含量
gossypol (mg/ kg)
0day 6day
玉米秆 corn stalks 0156 3125 811 1613 2714 2317
玉米芯 corn cobs 0166 2148 610 1319 2710 2510
小麦秆 wheat straw 0170 2176 814 1218 3315 2911
稻秆 rice straw 0180 2122 611 1311 3010 2519
甜菜渣 beet residures 0196 3107 1113 2619 1810 7186
树枝 tree branch 0178 2104 910 1511 3115 3018
棉籽饼 cottonseed cake 0182 3178 4414 4818 24410 17610
酒糟 distillers 0184 3146 2510 2715
籽粒 grains
豆渣 bean dregs 0179 4103 2913 2918
草粉 grass powder 0171 2119 1510 2318 2610 2510
3 45 ℃,发酵 6d。菌体生长量由葡萄糖胺含量 (mg/ g 干重)表示。3 45 ℃,6 days fermentation. Biomass is showed in glucosamine (mg/ g dry weight) .
212 侧孢霉 ( S porot richum sp . )固体发酵产生的木质纤维素酶
本实验采用玉米秆粉作为发酵底物对侧孢霉 ( S porot richum sp . )固体发酵过程菌体生长、
培养物的粗蛋白含量、底物消耗 (纤维的降解)以及产生木质纤维素酶进行了研究。
21211 菌体生长、培养物粗蛋白含量和底物消耗 (纤维的降解)在发酵过程中的变化 图 1 显
示了侧孢霉 ( S porot richum sp . )固体发酵过程中 ,菌体生长、培养物粗蛋白含量和底物消耗 (纤
维降解)随发酵时间的变化进程。从图 1 可以看出 ,菌体生长在发酵前期生长缓慢 ,1d 之后逐
图 1 侧孢霉 ( S porot richum sp . )固体发酵进程
Fig. 1 Time course of the solid state fermentation by S porot richum sp .
步达到了指数生长阶段 ,发酵到第 3 天以后 ,菌体生长趋于生长稳定期 ,发酵第 4 天菌体生长
达到了最高峰 ,菌体生长量 (葡萄糖胺含量) 为 312mg/ g 培养物左右 ,为发酵 0 时的 80 倍 ;发
酵第 6 天培养物的粗蛋白含量增加了 43 % ;底物消耗 (纤维降解)率达到 1316 %。实验结果表
明 ,侧孢霉 ( S porot richum sp . )对发酵底物玉米秆粉具有较强的纤维降解作用和利用能力。
21212 发酵过程产生的木质纤维素酶 图 2 描述了纤维素酶 (滤纸酶、羧甲基纤维素酶和β2
101 2 期 侧孢霉利用玉米秸秆固体发酵产生木质纤维素酶的研究
图 2 固体发酵过程纤维素酶的活性变化
Fig. 2 Variations of cellulase activity during the solid state fermentation
图 3 固体发酵过程木质素酶的活性变化
Fig. 3 Variations of ligninase activity during the solid state fermentation
葡聚糖苷酶)在发酵过程中的酶活变化。实验结果显示 ,发酵第 4 天产酶均达到最大值 ,这与
产纤维素酶代表性菌株里氏木霉和绿色木霉的产酶时间类似。表明侧孢霉具有菌体生长速度
较快 ,产酶周期短的特点。
在发酵过程中侧孢霉不但能产生纤维素酶 ,同时还可产生木质素酶 ,在本实验中检测了木
质素过氧化物酶和赖锰木质素过氧化物酶。从图 3 的结果可以看出 ,最高的产酶时间是在发
酵的第 4 天和第 6 天之间 ,最大酶活分别为 LiP 1414U/ g 培养物和 MnP17167 U/ g 培养物。
3 结 论
侧孢霉 ( S porot richum sp . )对农作物秸秆及废弃物具有较强的纤维降解作用和利用能力 ;
其生长速度快 ,产酶周期短 ,活力较高 ;在发酵过程中 ,其不但能产生纤维素酶 ,而且还能产生
201 核 农 学 报 14 卷
木质素酶 ,并提高培养物的粗蛋白含量 ;该菌可作为木质纤维素酶的生产菌 ,而且也可作为单
细胞蛋白 (SCP)和蛋白饲料的生产用菌株。
参考文献 :
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PROD UCTION OF L IGNOCELL ULOLYTIC ENZYMES IN THE
SOL ID STATE FERMENTATION BY sporot richum SP.
USING CORN STAL KS AS A SUBSTRATE
L I Xin1 L IU Yun1 J I Lin2zhen2
(11 Graduate School , CA A S , Beiji ng , 100081 ;
21 Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , CA A S , Beiji ng 100094)
ABSTRACT :The research results showed that this f ungal strain of Sporot richum sp. was found
to have potential in fermenting corn stalks to l ignocellulolytic enzymes in a one2step process. The
corn stalks chosen as a substrate could be degraded and util ized directly by Sporot richum sp. to
make cell growth and produce l ignocellulolytic enzymes. Ra w matrials of corn stalks are suited
to produce l ignocellulolytic enzymes by Sporoti rchum sp. as a fermentation substrate. The re2
sults also showed that maximum enzyme activity was reached bet ween 4 and 6 days during the
sol id state fermentation. The f ive kinds of the l ignocellulolytic enzymes ( Fpase 13418 U/ g ,CM2
Case 240131 U/ g , β2Gase 40186173 U/ g , LiP 1414 U/ g and MnP 17167 U/ g) were determined
during the sol id state fermentation.
Key words :S porot richum sp . , corn stalks , solid state fermentation , lignocellulolytic enzymes
301Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (2) :99～103