全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032232205
番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆及
LeNCED1 p : GUS 融合基因构建
万小荣1 　李　玲2
(11 仲恺农业技术学院生命科学学院 ,广东 广州　510225 ; 21 华南师范大学生命科学学院 ,广东 广州　510631)
摘 　要 :从番茄基因组中克隆 LeNCED1 基因 5′2侧翼 1456 bp 调控序列 ,经生物信息学分析表明 ,LeNCED1
基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件
(TC2rich repeats) 、ABA 响应元件 ABRE等 ,构建了 LeNCED1 基因上游调控序列与报告基因 GUS 融合的
植物双元表达载体 pLeNCED1p : GUS。
关键词 :番茄 ; NCED 基因 ;5′2侧翼序列克隆 ;融合基因构建
5′2FLANKING SEQUENCE CLONING OF LeNCED1 GENE IN TOMATO
AND ITS FUSION WITHβ2GLUCURONIDASE GENE
WAN Xiao2rong1 　LI Ling2
(1. College of Life Sciences , Zhongkai University of Agriculture and Technology , Guangzhou , Guangdong 　510225 ;
2. College of Life Science , South China Normal University , Guangzhou , Guangdong 　510631)
Abstract :The cloning of 14562bp 5′2flanking sequence of LeNCED1 gene from tomato and its fusion withβ2glucuronidase gene
( GUS ) were reported. The flanking sequence was bioinformatically analyzed in the database of plant cis2acting regulatory
element (PlantCARE) . The result showed that there were several important cis2acting elements , including Circadian (response
to circadian rhythm) , Box I (response to light) , TC2rich repeats (response to stress) and ABRE (response to ABA) , in the
upstream regulatory region of LeNCED1 gene. The binary vector harboring 5′2flanking sequence of LeNCED1 gene fused with
GUS gene originated from pCAMBIA1301 was constructed to be used in coming plant transgene.
Key words :tomato ; 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase ( NCED) gene ; 5′2flanking sequence cloning ; fusion gene construction
收稿日期 :2006212203
基金项目 :广东省自然科学基金博士科研启动基金 (06301202) 、仲恺农业技术学院博士启动基金 ( G2360225)和广东省自然科学基金 (06025049)
作者简介 :万小荣 (1977 - ) ,男 ,江西南昌人 ,博士 ,讲师 ,现从事植物分子生物学及植物基因工程研究。Tel :020231595809 ; E2mail :biowxr @126. com　　脱落酸 (abscisic acid , ABA)是一种植物激素 ,对植物生长发育起着重要作用 ,在植物胚胎发育、种子萌发、成熟与休眠、果实成熟以及植物对逆境胁迫的响应等许多方面具有广泛的生理效应[1 ] ,在细胞工程与农业生产中具有潜在的应用价值。近年来已经明确 ,在高等植物中 ABA 生物合成途径可分为 3 个阶段 : (1)在质体内形成胡萝卜素 ; (2) 在质体内形成玉米黄质 ,玉米黄质环化形成环氧类胡萝卜素 (92顺式紫黄质及92顺式新黄质) ,然后 92顺式紫黄质或 92顺式新黄质裂解形成黄质醛 ; (3) 黄质醛在细胞溶胶内转变形成ABA[2 ,3 ] 。生物化学和遗传学实验结果证明 ,92顺式紫黄质或 92顺式新黄质裂解形成黄质醛是高等植物ABA 生物合成的限速步骤 ,催化该反应的 92顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 ( nine2cis2epoxycarotenoid dioxygenase ,NCED)则是调控 ABA 生物合成的关键酶[4 ,5 ] 。自从玉米突变体 vp14[6 ]中克隆 ZmV P14 ( NCED) 基因以来 ,已相继在番茄[7 ] 、菜豆[8 ] 、豇豆[9 ] 、美国鳄梨[10 ] 、拟南芥[11 ] 、葡萄[12 ] 、柑橘[13 ] 和花生[14 ,15 ] 中克隆了 NCED 基因。Thompson 等[16 ] 研究发现番茄叶片中 LeNCED1 基因表达受水分胁迫诱导 ,且其表达有昼夜节律性变化(光期结束时达到顶峰) ,LeNCED1 mRNA 水平昼夜节律性波动对 ABA 生物合成速率的影响有待进一步研究。本文报道了从番茄基因组中克隆 LeNCED1 基因
232　 核 农 学 报　2007 ,21 (3) :232～236Journal of Nuclear Agricultural Sciences
5′2侧翼 1456 bp 序列 ,将此序列在国际植物顺式作用
元件数据库中进行生物信息学分析 ,并构建 LeNCED1
基因上游调控序列与报告基因 GUS 的融合基因 ,为进
一步研究 LeNCED1 基因响应昼夜节律、水分胁迫等各
种环境刺激的分子机制奠定实验基础。
1 　材料与方法
111 　植物材料
番茄 (Lycopersicon esculentum L. , 樱红 1 号品种)种
子播种在泥炭土中 ,生长条件为 16h 光照光下Π8h 黑暗
20 ℃。萌发生长约 40d 后取番茄叶片备用。
112 　LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆
采用 SDS 法提取番茄叶片基因组 DNA[15 ] ;根据
Thompson 等[17 ]报道番茄的一个基因组克隆 ( GenBank
Accession No. AJ439079) 设计一对特异引物 (Lep1 : 5′2
CTG CAG AAT TCA CAA TAA AGG ATG A23′和 Lep2 :
5′2AGA TCT ACC ATA GCT ACC TAT TTT CT23′) ,用于
PCR扩增 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列 ,将 PCR 产物克
隆到 pMD 182T载体 (TaKaRa)上 ,通过 PCR 和酶切检测
获得阳性克隆 (含 pMD 182LeNCED1p 载体) 后 ,挑阳性
克隆送上海生工生物技术有限公司测序 , 获得
LeNCED1 基因 5′2上游调控序列 (命名为LeNCED1p) 。
113 　融合基因构建
选用 pCAMBIA1301 为基本双元载体。以引入的
Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ两个限制性内切酶酶切 pMD 182
LeNCED1p 载 体 , 获 取 LeNCED1p 片 段 替 代
pCAMBIA1301 上 T2DNA 左右边界内驱动 GUS 基因的
CaMV 35S 启动子 ,构建成含有 LeNCED1 p : GUS 融合
基因的植物双元表达载体 pLeNCED1 p : GUS (图 2) 。
2 　结果与分析
211 　番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆与生物信
息学分析
根据 Thompson 等[17 ] 报道番茄的基因组克隆
( GenBank Accession No. AJ439079)设计一对特异引物 ,
以番茄基因组DNA 为模板进行 PCR 扩增 ,结果扩增出
约 1500 bp 的DNA 片段 (图 1) ,将此片段回收后克隆到
pMD 182T 载体上 ,通过 PCR (以 Lep1 和 Lep2 为引物)
和酶切 (Pst I和 Bgl II双酶切)检测、筛选 ,获取含 pMD
182LeNCED1p 载体的阳性克隆 (图 1) 。挑阳性克隆送
上海生工生物技术有限公司测序 ,测序结果表明 PCR
产物为一 1456 bp 的 DNA 序列 ,经 BLAST分析 (http :ΠΠ
www. ncbi . nlm. nih. govΠBLASTΠ) 表明与 Thompson 等[17 ]
报道的基因组克隆序列完 全 吻 合。至 此 获 得
LeNCED1 基因 5′2侧翼 1456 bp 序列 (即上游调控序列
LeNCED1p) 。
图 1 　番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆
Fig. 1 　5′2flanking sequence cloning of
LeNCED1 gene from tomato
M:DL2000 DNA marker ;1 :以番茄基因组 DNA 为模板 PCR 扩增
LeNCED1 基因 5′2侧翼序列 ;2 :PCR 检测 pMD 182LeNCED1p
载体 ;3 :Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切检测 pMD 182LeNCED1p 载体 ;
4 :pMD 182LeNCED1p 质粒 (酶切负对照)
1 :PCR amplification of 5′2flanking sequence of LeNCED1 gene with
tomato genomic DNA as template ; 2 :PCR check of the pMD 182LeNCED1p
vector ; 3 :Double digestion check of the pMD 182LeNCED1p vector
by Pst Ⅰand Bgl Ⅱ; 4 :pMD 182LeNCED1p plasmid as a negative
control of double digestion
将LeNCED1p 序列在国际植物顺式作用元件数据
库 PlantCARE[18 ]中进行生物信息学分析 ,搜寻结果表
明 (图 2) ,在该 5′2侧翼序列 - 85～ - 79 和 - 148～ -
145 (LeNCED1 基因起始密码子 ATG上游) 处有典型的
TATA2box ; - 236～ - 231 处有 ABA 响应元件 (ABA
response element , ABRE) ,核心序列为 CACGTG[19 ] ;在 -
262～ - 258、- 378～ - 374 和 - 446～ - 442 处有推测
的 CAAT - box ; - 440～ - 431 处有典型的响应昼夜节
律 的 顺 式 作 用 元 件 Circadian , 核 心 序 列 为
CAAATTAATC[20 ] ;在 - 471～ - 465 和 - 956～ - 950 处
有光响应元件 Box Ⅰ,保守序列为 TTTCAAA[21 ] ;在 -
925～ - 916 处有逆境胁迫响应元件 (富含 TC 重复序
列 , TC2rich repeats) ,核心序列为 ATTTTCTTCT[22 ] ;在 -
1362～ - 1353 和 - 1413～ - 1404 处有热激响应元件
HSE ,核心序列为 AAAAAATTC[23 ] 。由此表明 ,所克隆
的 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列已包含各种重要顺式作
用元件。
332　3 期 番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆及 LeNCED1 p : GUS 融合基因构建
图 2 　番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列在 PlantCARE数据库中的搜寻结果
Fig. 1 　Search result of the 14452bp 5′2flanking sequence of tomato LeNCED1 gene submitted to the database of
plant cis2acting regulatory element (PlantCARE)
下划线序列表示推测的顺式作用元件 (包括 TATA 盒、CAAT盒、Circadian 盒、Box Ⅰ、ABA 响应元件、
热激元件、富含 TC重复序列) ;LeNCED1 基因的起始密码子以下划箭头表示。
The putative cis2acting elements , including TATA2box , CAAT2box , Circadian , Box Ⅰ, ABRE , DRE , HSE and
TC2rich repeats , were underlined ; the arrow indicated the start codon of LeNCED1 gene.
212 　LeNCED1 p : GUS 融合基因构建
用 Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切 pMD 182LeNCED1p 载体 ,
回收酶切得到的 LeNCED1p 片段 ,连接于同样经 Pst Ⅰ
和Bgl Ⅱ双酶切的植物双元表达载体 pCAMBIA1301
上 ,替换 pCAMBIA1301 载体上驱动 GUS 基因的 CaMV
35S启动子 ,得到含 LeNCED1 p : GUS 融合基因的植物
双元表达载体 pLeNCED1p : GUS ,具体构建流程如图 2。
将 pLeNCED1p : GUS 载体 LeNCED1p 与 GUS 基因结合
区 (junction area)测序 ,确保序列准确性。
对构建的 pLeNCED1p : GUS 载体进行 PCR 和酶切
检测 ,结果以 Lep1 和 Lep2 为引物可特异地扩增出
1456bp 的 LeNCED1p 片段 ; Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切
pLeNCED1p : GUS 载体可切下相应大小的DNA 片段 (图
4) 。说明已构建了番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼调控序
列驱动报告基因 GUS 的植物双元表达载体。
3 　讨论
92顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED) 催化 92
顺式紫黄质或 92顺式新黄质裂解成为黄质醛是高等植
物 ABA 生物合成的关键步骤。LeNCED1 是番茄中调
控 ABA 生物合成的关键基因[17 ] ,水分胁迫能诱导番茄
叶片和根中 LeNCED1 基因表达[16 ] ,在烟草和番茄中过
量表达 LeNCED1 能提高转基因植物 ABA 含量[24 ] 。出
乎意料的是 ,Thompson 等[16 ]研究发现 LeNCED1 基因表
达有昼夜节律性变化 , LeNCED1 mRNA 水平总是在光
432 核　农　学　报 21 卷
　　　　
图 3 　LeNCED1 基因 5′2侧翼序列与 GUS 融合基因构建
Fig. 3 　Construction of binary vector harboring 5′2flanking sequence of LeNCED1 gene
fusioned with GUS gene originated from pCAMBIA1301
图 4 　pLeNCED1p : GUS载体的 PCR 及酶切检测
Fig. 4 　PCR and double digestion check of the binary
　　　 vector of pLeNCED1p : GUS
M:DL2000 DNA marker ;1 :Pst Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切检测 pLeNCED1 p : GUS
载体 ; 2 : pLeNCED1p : GUS 质 粒 ( 酶 切 负 对 照 ) ; 3 : PCR 检 测
　　　　　　　　　　pLeNCED1p : GUS载体
1 :Double digestion check of the pLeNCED1 p : GUS vector by Pst Ⅰ and
　　　 Bgl Ⅱ;
2 :pLeNCED1p : GUS plasmid as a negative control of double digestion ;
　　　 3 :PCR check of the pLeNCED1p : GUS vector
期 (light period)结束时达到最大 ,暗下基因表达较弱 ,
似乎 LeNCED1 基因的表达受光调控。但番茄叶片和
根中 ABA 水平并无昼夜节律性波动[25 ] ,仅是 ABA 在
叶绿体和细胞质之间的重新分布有昼行性[26 ] 。
LeNCED1 mRNA 水平昼夜节律性波动对 ABA 生物合
成速率的影响有待进一步研究。NCED mRNA 水平的
昼行性对 NCED 蛋白装配到叶绿体也许是必需的。
植物基因表达在时间和空间上具有特异性和发育
诱导性 ,受该基因启动子区域内的各种顺式作用元件
(cis2acting elements) 与细胞内的不同反式作用因子
(trans2acting factors)之间相互作用的协调控制。本研
究从番茄基因组中克隆了 LeNCED1 基因 5′2侧翼 1456
bp 调控序列 (图 1) ,对该序列进行生物信息学分析 ,发
现 LeNCED1 基因上游调控序列中存在响应昼夜节律
的顺式作用元件 Circadian、光响应元件 Box Ⅰ、ABA 响
应元件 ABRE、逆境胁迫响应元件 ( TC2rich repeats) 等
(图 2) ,这些顺式作用元件可能在 LeNCED1 基因响应
昼夜节律、光、ABA、逆境胁迫等各种环境刺激时发挥
了重要调控作用 (结果待发表) 。我们进一步构建了
532　3 期 番茄 LeNCED1 基因 5′2侧翼序列克隆及 LeNCED1 p : GUS 融合基因构建
LeNCED1 基因 5′2侧翼序列与报告基因 GUS 的融合基
因 (图 3、4) ,为将来鉴定 LeNCED1 基因启动子区域内
响应昼夜节律、光信号、逆境胁迫等的重用顺式作用元
件 ,以及分别和这些元件相互作用的反式作用因子 ,奠
定实验基础。
参考文献 :
[ 1 ] 　Zeevaart J A D. Abscisic acid metabolism and its regulation. In
Hooykaas PJJ , Hall MA and Libbenga KR. (eds) . Biochemistry and
Molecular Biology of Plant Hormones . Elsevier Science , Amsterdam ,
1999 , 189～207
[ 2 ] 　Seo M , Koshiba T. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants.
Trends Plant Sci , 2002 7 (1) :41～48.
[ 3 ] 　Schwartz S H , Qin X , Zeevaart J A D. Elucidation of the indirect
pathway of abscisic acid biosynthesis by mutants , genes , and enzymes.
Plant Physiol , 2003 , 131 : 1591～1601.
[ 4 ] 　Nambara E , Marion2Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism.
Annu Rev Plant Biol , 2005 , 56 :165～185
[ 5 ] 　Taylor I B , Sonneveld T , et al . Regulation and manipulation of the
biosynthesis of abscisic acid , including the supply of xanthophyll
precursors. J Plant Growth Regul , 2005 , 24 :1～21
[ 6 ] 　Tan B C , Schwartz S H , et al . Genetic control of abscisic acid
biosynthesis in maize. Proc Nalt Acad Sci USA , 1997 , 94 : 12235～
12240
[ 7 ] 　Burbidge A , Grieve T , et al . Structure and expression of a cDNA
encoding a putative neoxanthin cleavage enzyme (NCE) , isolated from
a wilt2related tomato ( Lycopersicon esculentum Mill . ) library. J Exp
Bot , 1997 , 47 : 211122112
[ 8 ] 　Qin X , Zeevaart J A D. The 92cis2epoxycarotenoid cleavage reaction is
the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water2stressed
bean. Proc Nalt Acad Sci USA , 1999 , 96 : 15354～1536
[ 9 ] 　Iuchi S , Kobayashi M , et al . A stress2inducible gene for 92cis2
epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acid biosynthesis under
water stress in drought2tolerant cowpea. Plant Physiol , 2000 , 123 : 553
～562
[ 10 ] 　Chernys J T , Zeevaart J A D. Characterization of the 92cis
epoxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of abscisic
acid biosynthesis in avocado. Plant Physiol , 2000 , 124 : 343～353
[11 ] 　Iuchi S , Kobayashi M , Taji T , et al . Regulation of drought tolerance by
gene manipulation of 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase , a key enzyme
in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant J , 2001 , 27 : 325～
333
[ 12 ] 　Soar C J , Speirs J , Maffei S M , et al . Gradients in stomatal
conductance , xylem sap ABA and bulk leaf ABA along canes of Vitis
vinifera cv Shiraz : biochemical and molecular biological evidence
indicating their source. Funct Plant Biol , 2004 , 31 : 659～669
[13 ] 　Rodrigo M J , Alquezar B , Zacarias L. Cloning and characterization of
two 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase genes , differentially regulated
during fruit maturation and under stress conditions , from orange ( Citrus
sinensis L. Osbeck) . J Exp Bot , 2006 , 57 (3) : 633～643
[14 ] 　Wan X R , Li L. Molecular cloning and characterization of a dehydration2
inducible cDNA encoding a putative 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase
in Arachis hypogaea L. DNA Seq , 2005 , 16 (3) : 217～223
[15 ] 　Wan X R , Li L. Regulation of ABA level and water2stress tolerance of
Arabidopsis by ectopic expression of a peanut 92cis2epoxycarotenoid
dioxygenase gene. Biochem Biophys Res Commun , 2006 , 347 ( 4) :
1030～1038
[16 ] 　Thompson A J , Jackson A C , Parker RA , et al . Abscisic acid
biosynthesis in tomato : regulation of zeaxanthin epoxidase and 92cis2
epoxycarotenoid dioxygenase mRNA by lightΠdark cycles , water stress
and abscisic acid. Plant Mol Biol , 2000 , 42 , 833～845
[17 ] 　Thompson A J , Thorne E T , Burbidge A , et al . Complementation of
notabilis , an abscisic acid2deficient mutant of tomato : importance of
sequence context and utility of partial complementation. Plant Cell
Environ , 2004 , 27 (4) : 459～471
[18 ] 　Lescot M , Déhais P , Moreau Y, et al . PlantCARE: a database of plant
cis2acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis
of promoter sequences. Nucleic Acids Res , 2002 , Database Issue , 30
(1) : 325～327
[ 19 ] 　Baker S S , Wilhelm K S , Thomashow M F. The 5′2region of Arabidopsis
thaliana cor15 a has cis2acting elements that confer cold2 , drought2 and
ABA2regulated gene expression. Plant Mol Biol , 1994 , 24 (5) : 701～
713
[ 20 ] 　 Pichersky E , Bernatzky R , Tanksley S D , et al . Molecular
characterization and genetic mapping of two clusters of genes encoding
chlorophyll aΠb2binding proteins in Lycopersicon esculentum (tomato) .
Gene , 1985 , 40 (2) : 247～258
[21 ] 　Kuhlemeier C , Fluhr R , Green P J , et al . Sequences in the pea rbcS23A
gene have homology to constitutive mammalian enhancers but function as
negative regulatory elements. Genes Dev , 1987 , 1 (3) : 247～255
[22 ] 　Diaz2De2Leon F , Klotz KL , Lagrimini L M. Nucleotide sequence of the
tobacco (Nicotiana tabacum) anionic peroxidase gene. Plant Physiol ,
1993 , 101 (3) : 1117～1118
[23 ] 　Pastuglia M , Roby D , Dumas C , et al . Rapid induction by wounding
and bacterial infection of an S gene family receptor2like kinase gene in
Brassica oleracea . Plant Cell , 1997 , 9 (1) : 49～60
[ 24 ] 　Thompson A J , Jackson A C , Parker R A , et al . Ectopic expression of a
tomato 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase gene causes over2production
of abscisic acid. Plant J , 2000 , 23 (3) :363～374
[ 25 ] 　Corlett J E , Wilkinson S , Thompson A J . Diurnal control of the drought2
inducible putative histone H1 gene in tomato ( Lycopersicon esculentum
Mill L. ) . J Exp Bot , 1998 , 49 : 945～952
[26 ] 　Slovik S , Hartung W. Compartmental distribution and redistribution of
abscisic acid in intact leaves. II. Model analysis. Planta , 1992 , 187 :
26～36
632 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (3) :232～236