全 文 ：文章编号 :100028551(2003) 042308205
一次注射法适宜采血时间的确定
孟德连　姚军虎　吕金印　吴孝兵　刘　军
(西北农林科技大学动物科技学院 ,陕西 杨凌　712100)
摘　要 :给绝食、强饲无氮日粮 (NFD) 、分别以豆粕或棉粕为唯一氮源的 CP20 %半合成饲
粮的蛋青鸡 ,静脉一次注射 30μCi 3 H2Leu/ kg BW ,于注射后 5、30min、4、24、36、48h 翅静脉
采血 ,测定各时间点的去蛋白血浆比放射性强度及 48h 内排泄物的比放射性强度。通
过定积分分析 ,一次静脉注射法检测内源氨基酸损失量的适宜采血时间为注射3 H2Leu
后 20～24h。
关键词 : 蛋青鸡 ; 内源氨基酸 ; 同位素稀释技术 ; 一次注射法
收稿日期 :2001211219
基金项目 :国家自然科学基金项目(39970550)
作者简介 :孟德连(1975～) ,男 ,土家族 ,在职博士 ,主要从事动物营养理论研究。
内源氨基酸损失量 (EAAL)是测定饲料氨基酸消化率的基础数据 ,测定采食实际含氮饲粮时
EAAL 的根本障碍是无法准确区分排泄物中内、外源氨基酸。迄今提出的各种检测方法在一定程
度上可反映部分饲粮因子对 EAAL 的影响 ,但均以各种不同的假定为依据 ,其中有些假定尚未被
证实或被证实并不完全成立 ,因此 ,EAAL 测值的可靠性受损[1 ] 。姚军虎的研究初步证明了一次
注射法的基本原理成立 ,并评价了用该方法检测实际含氮饲粮时 EAAL 的可信度[2 ] 。本研究进
一步证明一次注射法的可行性 ,并确定该方法的适宜采血时间 ,以简化试验操作过程、节省成本。
1 　材料与方法
111 　试验鸡分组与饲喂
选择 115kg 左右尼克红蛋青鸡 24 只 ,随机分为 4 个处理 ,每处理 3 个重复 ,每重复 2 只鸡。
除绝食处理外 ,设 3 种饲粮 (表 1) 。试验鸡肛门处缝制空心塑料瓶盖 ,以安装集粪袋。试验鸡单
笼饲喂。预试前自由采食以豆粕为唯一氮源的半合成饲粮 5d ,绝食 36h 之后 ,除绝食组外 ,按每
kg 体重 30gDM预强饲相应的饲粮 ,再绝食 48h ,然后正强饲同样数量的相应日粮。绝食组预绝食
48h 后进入正式绝食 (48h) 。整个绝食期试验鸡自由饮水 ,16hΠd 光照。
112 　试验处理与样品预处理
正式绝食及正式强饲后 ,立即皮下注射 30μCi3 H - Leu/ kg BW。注射后 5、30min、4、24、36、48h
采集翅静脉血液于抗凝处理的离心管内 ,全血经 3000rpm 离心 10min ,分离出血浆弃沉淀。血浆
按 1∶1(V/ V) 的比例加入 10 %三氯乙酸 (TCA) ,再离心 10min ,弃沉淀 ,得到去蛋白血浆样品 , -
20 ℃密封保存。注射3 H2Leu 后 ,收集 48h 全部排泄物 ,置于 65～70 ℃的恒温烘箱中干燥至恒重。
粉碎后 ,密封装袋 ,低温保存。
803　 核 农 学 报　2003 ,17(4) :308～312Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
表 1 　试验饲粮组成
Table 1 　Composition of the experimental diets ( %)
饲粮 diet NFD CP20(豆粕 soybean meal) CP20(棉粕 cotton seed meal)
淀粉 starch 59. 98 46. 18 44. 70
豆粕 soybean meal — 46151 —
棉粕 cotton seed meal — — 47160
蔗糖 sugar 31145 — —
菜油 rapeseed oil — 2160 4132
纸纤维 paper fiber 4. 20 1. 41 —
磷酸氢钙 CaHPO3 2. 22 1. 37 1. 30
碳酸钙 CaCO3 1. 22 1. 00 1. 15
食盐 salt 0. 30 0. 30 0. 30
禽用多维 vitamin premix 0. 03 0. 03 0103
微量元素 trace elements 0. 50 0. 50 0. 50
氯化胆碱 choline chloride 0. 10 0. 10 0. 10
　　注 : (1)所有饲粮按MEn 12130MJΠkg ,Ca 0196 % ,有效磷 0138 % ,粗纤维 412 %的标准配制 ; (2)禽用多维每 kg 含 :VA56000KIU ,
VD311000KIU ,VE30KIU ,Vk35g ,VB12g ,VB2 12g ,VB6 6g ,VB12 30mg ,叶酸 500mg ,烟酸 35g 及泛酸钙 25g ; (3) 微量元素中每 kg 含 : Fe
1612g ,Cu 1164g ,Mn 12109g ,Zn 8111g ,Se 33153mg 及 I 75170mg。
Note : (1) All diets contain MEn12130MJΠkg ,Ca 0196 % ,effective phosphorus 0138 % ,crude fiber 412 % ; (2) The vitamin premix contain
(per kg) :VA56000KIU ,VD311000KIU ,VE30KIU ,Vk35g ,VB12g ,VB212g ,VB66g ,VB1230mg ,folic acid 500mg , niacin acid 35g and calcium pan2
tothnate 25g ; (3) The trace mineral premix contain (per kg) :Fe 1612g ,Cu 1164g ,Mn 12109g ,Zn 8111g ,Se 33153mg and I 75170mg.
113 　化学分析及放射性测定
化学分析及放射性测定同姚军虎等 (1999) [2 ] 。
114 　资料处理与统计原理
资料处理与统计原理同姚军虎等 (1999) [2 ] 。利用 SPSS 软件包对去蛋白血浆各时间点的比
放射性强度 (SR)作回归拟合分析 ,并对血浆比放射性强度的衰变曲线进行定积分 ,计算与收集排
泄物相对应时间区间内血浆中比放射性强度的定积分值 ,使去蛋白血浆与排泄物中的比放射性
强度值对应 ,应用微积分分析 ,估计适宜采血时间。
2 　试验结果
211 　强饲不同饲粮时血浆游离Leu 比放射性强度变化规律
从表 2 可见 ,不同处理间同一时间点血液游离 Leu 比放射性强度无显著差异 ( P > 0105) ,并
随采血时间推移呈逐渐减少趋势。回归分析表明 ,血浆游离Leu 比放射性强度呈显著的指数衰
变规律 (表 3) ,符合一室模型。
212 　排泄物放射性强度变化规律
不同处理间 48h 内排泄物Leu 比放射性强度分为两个水平 :FAS组和 NFD 组为一个水平 (表
4) ,豆粕组和棉粕组为一个水平 ,两水平间差异显著 ( P < 0105) ,各水平内差异不显著( P > 0105) 。
903　4 期 一次注射法适宜采血时间的确定
表 2 　血浆游离 Leu比放射性强度
Table 2 　specific radioactivity of free leucine in plasma ( ×104dpm/μmol Leu)
饲粮 diet
时间 time (h)
01083 0. 5 4 24 36 48
无氮日粮组 NFD 2. 080 ±0. 464 1. 673 ±0. 432 1. 357 ±0. 391 0. 904 ±0. 341 0. 668 ±0. 287 0. 570 ±0. 202
绝食组 FAS 2. 045 ±0. 451 1. 845 ±0. 406 1. 336 ±0. 367 0. 915 ±0. 338 0. 683 ±0. 312 0. 611 ±0. 178
CP20 %(豆粕组
soybean meal) 1. 972 ±0. 580 1. 631 ±0. 525 0. 841 ±0. 473 0. 814 ±0. 442 0. 667 ±0. 393 0. 537 ±0. 185
CP20 %(棉粕组
cotton seed meal) 1. 879 ±0. 535 1. 336 ±0. 473 0. 809 ±0. 438 0. 804 ±0. 383 0. 706 ±0. 331 0. 637 ±0. 212
　　注 :各时间点不同处理间差异均不显著(P > 0105) 。
Note :Means in the same time point do not differ significantly( P > 0105) .
表 3 　4 种处理时血浆游离 Leu比放射性强度回归分析( n = 6)
Table 3 　Regression analysis of specific radioactivity of free leucine in plasma ( n = 6)
饲粮 diet 回归公式
regression equation
S yt P1 P2
差异性
significance
SR0 K
无氮日粮组 NFD y = 663715e - 0. 0104 t 0. 3120 0. 0217 0. 0107 A A
绝食组 FAS y = 6760. 3e - 0. 0101 t 0. 2790 0. 0162 0. 0094 A A
CP20 %(豆粕组 soybean meal) y = 5693. 9e - 0. 0068 t 0. 1690 0. 0330 0. 0314 AB B
CP20 %(棉粕组 cotton seed meal) y = 5446. 1e - 0. 0069 t 0. 2750 0. 0460 0. 0371 B B
　　注 : (1)公式中 Y 为血浆游离Leu 比放射性强度(dpmΠμmol Leu) , t 为时间(h) ; (2) S yt为回归估计标准误差 ; (3) P1、P2 分别为
起始放射性强度 SR0 及血浆游离Leu 更新速率常数的显著性标准 ; (4)差异性分别列出 SR0 值和 K值的差异性比较 ,同列标不
同字母者表示差异显著( P < 0105) 。
Note : (1) SR in regression equations means radioactivity of leucine in plasma and the time at blood sampling(h) ; (2) S yt means standard
error of estimate of the regression equation ; (3) P1 and P2 represent probabilities of signficance of initial specific radioactivity( SR0) and regres2
sion rate constant ( K) of free leucine in plasma , respectively ; (4) In the column of significance , different letters differ significantly( P < 0105) .
表 4 　排泄物中放射性强度
Table 4 　Specific radioactivity of excreta
饲粮
diet
放射性强度
radioactivity
( ×103 dpm/ g)
排泄物重量
excreta weight
(g)
排泄物Leu 浓度
Leu
concentration in
excreta ( %)
排出Leu 量
Leu excretion per bird
(μmolΠ48h) 比放射性强度specific radioactivity( ×104dpmΠμmol Leu)
无氮日粮组 NFD 4. 48 ±1. 11a 27. 86 ±6. 89b 0. 18 ±0. 01a 380. 57 ±101. 28a 3. 22 ±0. 12a
绝食组 FAS 3. 58 ±0. 19a 16. 13 ±6. 10a 0. 23 ±0. 03a 277. 54 ±95. 45a 3. 48 ±0. 24a
CP20 %(豆粕组
soybean meal) 5. 68 ±1. 71
a 30. 55 ±4. 88b 0. 40 ±0. 07b 940. 90 ±205. 83c 2. 16 ±0. 15b
CP20 %(棉粕组
cotton seed meal) 4. 95 ±2. 47
a 24. 14 ±3. 22b 0. 38 ±0. 16b 701. 87 ±329. 80b 2. 17 ±0. 08b
　　注 :表中数据为 €x ±Se ( n = 6) 。Note :Mean ±standard error ( n = 6) .
213 　公式 SRe0ΠSRp0 = SReiΠSRpi = k[ 2] 的证明
48h 血浆Leu 比放射性强度定积分均值 ,4 种处理间无显著差异 ( P > 0105 ,表 5) 。排泄物与
血浆Leu 比放射性强度定积分值之比 ,无氮日粮组与绝食组差异不显著 ( P > 0105) ,证明公式
SRe0ΠSRp0 = SReiΠSRpi = k 成立。豆粕组和棉粕组两者比值差异不显著 ( P > 0105) ,且均显著低于
无氮日粮和绝食组 ( P < 0105) 。根据公式可知 ,豆粕组和棉粕组排出内源Leu 分别占Leu 总排出
013 核　农　学　报 17 卷
量的 61138 %和 57153 %。假设采食含氮饲粮时内源氨基酸模式与无氮日粮时相同 ,据上述比例
可推算出其余氨基酸的内源损失量。
表 5 　排泄物中与血浆游离 Leu比放射性强度之比
Table 5 　Ratio of specific radioactivity between excreta and plasma
项目
item
无氮日粮组 NFD 绝食组 FAS CP20 %(豆粕组
soybean meal)
CP20 %(棉粕组
cotton seed meal)
排泄物中比放射性强度
excreta SR(X1 , ×102dpm/μmol Leu) 3. 2604 ±0. 1246
a 3. 0390 ±0. 2362a 1. 8602 ±0. 1527b 1. 7064 ±0. 0820b
血浆中比放射性强度定积分值
definite integral SR of free Leu in plasma
(X2 , ×103 dpm/μmol ,Leu)
5. 2230 ±0. 0450a 5. 3550 ±0. 0489a 4. 8570 ±0. 0421a 4. 7500 ±0. 0273a
K(X1/ X2)
内源Leu 占总排出Leu( %)
ratio of endogenous Leu of
total Leu in excreta
0. 0624 ±0. 0025a
100
0. 0568 ±0. 0044a
100
0. 0383 ±0. 0031b
61. 38
0. 0359 ±0. 0017b
57. 53
　　注 : (1)表中数据为€x ±SE(n = 6) ; (2)同行数据标不同字母者差异显著( P < 0105) 。
Note : (1) Mean ±standard error ( n = 6) ; (2) Means in the same row with different superscript letters differ significantly( P < 0105) .
214 　适宜采血时间的确定
强饲两种 CP20 %的饲粮时 ,蛋青鸡血浆 SRP 衰变函数分别为 :豆粕组 : Y = 569319e - 010068 t 　
( P = 01013 , n = 6 , R2 = 01831) ;棉粕组 : Y = 544611e - 010069 t 　( P = 01003 , n = 6 , R2 = 01725) 。
式中 , Y 为血浆游离Leu 比放射性强度 (dpmΠμmol.Leu) , t 为引入同位素后时间 (h) 。
根据动物营养学理论及同位素示踪原理 ,设一次注射法的适宜采血时间为 t (h) ,则有下式
成立 :豆粕组　　Y= 569319e - 010068t 　　　　棉粕组　Y= 544611e - 010069t
485710 = 569319e - 010068t 　　　　475010 = 544611e - 010069t] t = 23140 　　　　] t = 20180
根据以上推导 ,我们可将一次注射法的采血时间确定为静脉注射3 H2Leu 之后 20～24h。
3 　讨论与结论
传统的连续灌注法以饲喂时血浆样品 (1d 饲喂 2 次 ,采血 2 次)的15N 富集度作为分泌进入肠
腔的内源蛋白质的富集度[3 ] 。内源蛋白质的合成和分泌是连续过程 ,连续收集的食糜内源蛋白
质的富集度可反映整个收集期内内源蛋白质合成与分泌情况[4 ] ,因此 ,饲喂时采血难以准确代表
回肠食糜中的富集度[5 ,6 ] 。
连续灌注法测定内源蛋白质损失量 ,以检测时间内引入的放射性物质在体内各部位均匀分
布为前提。实际上 ,由于受标记物引入量、引入速度、血浆中原有该 AA 含量、AA 的吸收状态等
影响 ,内源氮的富集度是可变的 ,与理论上的恒定值不可能相等。
多次采血 ,并给各时间点估计内源 AA 富集度时以相同的权数 ,也难以准确反映内源 AA 的
损失规律。本试验中 ,经 4 种处理并静脉注射相同剂量3 H2Leu ,5、30min、4、24、36、48h 采血 ,回归
分析表明 ,4 种处理时血浆比放射性强度的衰变规律有明显差异 ( P < 0105) ,说明算术平均法表
示 48h 收集期内血浆比放射性强度会引起一定误差。定积分法可反映血浆比放射性强度的动态
变化规律 ,将排泄物Leu 与血浆游离Leu 比放射性强度定积分值联系起来 ,避免血浆比放射性强
度估计的误差。本试验采用比值法 ,只强调不同饲粮时 SRe 与 SRp 具有相同的消长规律 ,不要求
113　4 期 一次注射法适宜采血时间的确定
血浆中比放射性强度在整个试验期内保持恒定 ,这样使得由于采血时间、采血次数及血浆比放射
性强度测定所引起的误差大大降低。
一次注射法以强饲 NFD 为参照 ,通过 SRe / SRp 之值推算实际饲粮时 EAAL ,可抵消或部分抵
消连续灌注法中肠道合成对测值的干扰。
本研究经微积分处理 ,确定的最佳采血时间为注射3 H2Leu 后 20～24h ,即血浆游离Leu 浓度
处于相对稳定时期。姚军虎等 (1999)的研究表明 ,不同饲粮时血浆直接提供的内源Leu 占总内源
Leu 的比例相对恒定[2 ] ,这一结论与本试验的结果相一致。本研究进一步证明一次注射法测定内
源氨基酸损失量法成立。采食以豆粕或棉粕为唯一氮源的半合成饲粮时 ,内源Leu 量分别占Leu
总排出量的 61138 %和 57153 %。
参考文献 :
[1] 　姚军虎 ,王康宁.单胃动物消化道内源氨基酸排泄量测定方法学研究进展.国外畜牧科技 ,1998 ,4 :6～9
[2] 　姚军虎 ,王康宁 ,杨风等 ,一次注射3H2Leu 测定肉仔鸡内源氨基酸排泻量的方法学研究.核农学报 ,1999 ,4 :229～235
[3] 　Bergner H , Drochner W and Bartelt J . Secretion of endogenous protein in dependence of the protein and fiber intake of 15N labeled pigs.
Ⅵth Int Symp Dig Phsiol in Pigs. Bad Doberan 4～6h Oct , 1994 ,11～13
[4] 　De Lange CFM , Souffrant WB , Sauer WC. Real ileal protein and amino acid digestibilities in feedstuffs for growing pigs as determined
with the 15N2isotope dilution technique. J Anim Sci . 1990. (68) :409～418
[5] 　Lien KA , Sauer WC , Mosenthin R , et al . Evaluation of the 15N2isotope dilution technique for determining the recovery of endogenous
protein in ileal digestion of pigs :effect of dilution in the procursor pool for endogenous nitrogen secretion. J Anim Sci . 1997 , (75) :148～
158
[6] 　Moughan P J , Schuttert G, Leenaars M. Endogenous amino acid flow in the stomach and small intestine of the young growing pig. J Sci
Food Agric. 1992 , (60) :437～442
[7] 　Wykes L J , Fiorotto M , Burrin DG, et al . Chronic low protein intake reduces tissue protein synthesis in a pig model of protein
malnutrition. J Nutr. 1996 ,126 :1481～1488
DETERMINATION OF THE OPTIONAL TIME FOR TAKING BLOOD SAMPLES
BY SINGLE INTRAVENOUS INJECTION OF 3 H2LEUCINE
MENG De2lian 　YAO Jun2hu 　LU Jin2yin 　WU Xiao2bin 　LIU Jun
( Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Foresty , Yangling , Shanxi prov , 　712100)
Abstract : Twenty four young hens ( 115kg of body weight , BW) were randomly divided into 4
groups. Every group was diet free( FAS) or force2fed a nitrogen2free diet ( NFD) or the diet with
20 %crude protein in which soybean meal or cotton seed meal was the sole nitrogen source ( 30g
DMΠkg BW) . 30μCi 3 H2Leu/ kg BW was intravenously injected into all birds just after force2fed or
on fasting. Venous blood samples were taken at 5 , 30min , 4 ,24 ,36 and 48h after injection. The
excreta during the whole period of 48h after injection was collected. Special radioactivities of non2
protein plasma at every time point and excreta were measured. The optional time of taking blood
samples was 20～24 hours after injected 3 H2Leu.
Key words :poultry; endogenous amino acid; single injection ; isotope labeled leucine
213 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17(4) :308～312