全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 042417204
15N 同位素稀释法测定燕麦根际固氮菌固氮量的研究
席琳乔1 ,2 　张德罡3 　姚　拓3
(11 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室 , 新疆 阿拉尔市　843300 ;
2. 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室 , 新疆 阿拉尔市　843300 ; 3. 甘肃农业大学草业学院 甘肃 兰州　730070)
摘 　要 :用15N 同位素稀释法对接种到燕麦上的不同固氮菌的固氮能力进行了测定 ,结果表明 :固氮菌处
理的地上植株15N 原子百分超为 110871 %～113791 % ,其中 Pseudomonas sp N4 最低 (110871 %) ;植株地下
部分为 110921 %～112751 % , Pseudomonas sp N4 也是最低 (110921 %) 。Pseudomonas sp N4、A1 lipoferum O6
和 Zoogloea sp W6 固氮能力较好。植株全氮含量增加 2108 %～39158 % ,A . lipoferum O6 处理的全氮含
量最高 (39158 %) 。接种固氮菌能够提高燕麦的全氮含量、固氮百分率和固氮量。
关键词 :燕麦 ;固氮菌 ;固氮量 ;15N 同位素稀释
UING 15 N ISOTOPIC DILUTION METHOD TO DETERMINE THE QUANTIFICATION OF
ASSOCIATION NITROGEN FIXATION BACTERIA SOIL FROM OAT ROOTS
XI Lin2qiao1 ,2 　ZHANG De2gang2 　YAO Tuo2
(1. Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production & Construction Corps , Alar , Xinjiang 　843300 ;
2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science & Technology of Xinjiang Production & Construction Corps , Alar , Xinjiang 　843300 ;
3. Grassland College , Gansu Agricultural University , Lanzhou , Gansu 　730070)
Abstract :The quantification of nitrogen fixed by associative nitrogen fixing bacteria , which separated from oat and wheat were
re2inoculated to oat , was analyzed using 15N isotopic dilution technique. Results showed that most strains were beneficial to
nitrogen fixation. 15N atom % excesses in the above ground part of plant ranged from 110871 % to 113791 % , and in
underground part were from 110921 % to 112751 %. The lowest 15N atom % excess found in Pseudomonas sp N4 treatment was
110871 % and 110921 % in the above and under ground parts of oat plant respectively. Pseudomonas sp N4 , A . lipoferum O6
and Zoogloea sp. W6 had higher ability of nitrogen fixation. Nitrogen content in oat plant was increased form 2108 % to
39158 % , of which the highest content of total Nitrogen was detected in A . lipoferum O6. Inoculation of nitrogen fixing
bacteria could increase total nitrogen content , nitrogen fixing percent and amount of fixed nitrogen.
Key words :oat ( Avina sativa L. ) ; associative nitrogen fixing bacteria ; the quantification of biological nitrogen fixed ; 15 N
isotopic dilution technique
收稿日期 :2006211215
基金项目 :甘肃省科学技术攻关项目 (2GS0352A412001204) ;甘肃省教育厅科研项目 (042202) ;新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重
点实验室开放课题 (BR0506)资助
作者简介 :席琳乔 (19782) ,男 ,甘肃省镇原县人 ,主要从事草地农业生态的教学和科研工作。E2mail :gsxlq666 @163. com。　　固氮菌可依赖植物根系分泌物生长和固氮 ,通过固氮作用为作物提供氮素[1～3 ] ,目前 ,研究比较多的有水稻 ( Oryza sativa) 、小麦 ( Triticum aestivum) 、玉米 ( Zeamays)等植物的固氮。禾本科作物和牧草具有较大的种植面积和重要的经济价值和生态功能 ,由于化学氮肥的价格上涨 ,人们开始研究提高化肥的利用率和开 发新的肥料[5～7 ] ,对豆科植物根瘤菌接种剂、禾本科植物促生菌和联合固氮菌的研究较多 ,但对高寒地区禾本科牧草根际固氮菌研究较少。本研究对高寒地区燕麦根际联合固氮菌的生物固氮量进行了研究 ,旨在为促进草地的氮循环和退化草地的治理提供理论依据。
714　核 农 学 报　2007 ,21 (4) :417～420Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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1 　材料与方法
111 　材料
试验所用的菌株由甘肃农业大学草地微生物实验
室提供 ,生脂固氮螺菌 Azospirillum lipoferum O6、固氮菌
属和假单胞菌属 Pseudomonas sp O3 来自燕麦 ( Avena
sativa) 根际 ;固氮菌属 Azotobacter sp W5、动胶杆菌属
Zoogloea sp C6、假单胞菌属 Pseudomonas sp N4 和动胶
杆菌属 Azotobacter sp O5、Zoogloea sp . W6 来自小麦根
际。试验用的氮肥为15 N - 尿素 ,15 N 超量原子百分数
为 2124 %。
试验地的土壤状况 :土壤 pH 为 719 ,有机质含量
15 % ,全氮 0176 % ,全磷 0147 %。
112 　方法
11211 　试验地概况 　研究在甘肃省天祝金强河甘肃
农业大学高山草原试验站进行。地理坐标为 N37°11′
～37°13′,E102°29′～102°33′。海拔 2700～3300m ,该区
气候寒冷潮湿 ,空气稀薄 ,太阳辐射强。年均气温
- 011 ℃,1 月均温 - 1813 ℃,7 月均温 1217 ℃, > 0 ℃积
温 1380 ℃;水热同期 ,对牧草的生长比较有利 ,年日照
时数 2600h ;年降水量 416mm ,多为地形雨 ,集中于 7～
9 月 ;年蒸发量 1592103mm ,是降雨量的 318 倍。当地
种植的主要饲料作物是燕麦 ( Avina sativa ) 、青稞
( Hordeum vulgare) [4 ] 。
11212 　15N 尿素的引入 　2004 年 8 月 1 日播种 ,每小
区 4m ×4m ,小区间距 50cm ,保护行 1m ,采用条播 ,行
间距为 15cm ,3 个重复。燕麦种子的用量为 26215kgΠ
hm2 [9 ] 。15N2尿素的施入量同半量化肥的施用量 ,全量
化肥尿素使用量为 298kgΠhm2 。试验处理为半量尿素
+ 肥料 ,以半量尿素为对照 ,先播化肥 ,混匀后再播种
子 ,覆土、镇压。
11213 　菌悬液浸种 　在盛有 50ml LB 液体培养基的
三角瓶中接种供试菌株 ,28 ℃下置于轨道摇床上培养
48h。用分光光度计测定菌株悬浮液的 OD600nm ,并用无
菌水调节 OD600nm值为 016 ,即约 108 CFUΠml。用此悬浮
液浸种 3h ,播种[8 ] 。
113 　生物固氮测定
播种 2 个月后 (10 月 6 日) 在产量最高期将 20cm
×20cm 样方的植物连同根系一起挖出 ,将地上部与地
下部分开 ,地下部冲洗净 ,地上部按种类分开 ,将洗净
的样品放在 70 ℃的烘箱烘干 ,称重 ,粉碎 ,称取 014～
015g 干样 ,利用半自动凯氏定氮法测定氮含量 ,测后
将吸收瓶的溶液移至蒸发皿 ,向溶液内滴加 1 滴 2 %
的硫酸酸化 ,放入烘箱在 60 ℃下浓缩 ,用氮同位素测
定仪 NOI7 ( Nitrogen analyzer with Optical principle for
determination of stable Isotopes) 测定15 N 原子百分超 ,测
量范围在 10 ～ 50μgNΠ25μl。试验用 NaBrO 浓度为
01071molΠL ,G4 漏斗过滤 ,基本参数 :载气为氦气 ,工作
压力 2par , background = 90 , peak thrshold = 900 , 注入
NaBrO 的时间为 0185s ,流入样品杯的时间为 2215s[8 ] 。
固氮百分率 ( %Ndf a) 和固氮量 ( Nfixed) 的计算公
式如下 :
%N df a = (1 -
15 Nfs
15 N nfs
) ×100
　　其中 ,15 N nfs为样品中15 N 原子百分超 ;15 Nfs为对照
15N 原子百分超 ;
Nf ixed = Nt ×%N df a
　　其中 , Nfixed 为固氮量 ; Nt 为全氮量。
数据分析采用 SPSS 软件 ,数据比较采用LSD 多重
比较。
2 　结果与分析
对接种到燕麦根际固氮菌的地上部分固氮量的测
定结果见表 1。
从表 1 得知 ,各菌株处理的燕麦固氮百分率、固氮
量以及全氮含量差异均较大。固氮菌各处理的全氮含
量增 加 2108 % ～ 39158 % , A1 lipoferum O6 最 高
(39158 %) ,其次依次为 Azotobacter sp O5、Pseudomonas
sp O3、Zoogloea sp C6、Pseudomonas sp N4、Zoogloea sp
W6 和 Azotobacter sp W5 , 其 中 A1 lipoferum O6、
Azotobacter sp O5 和 Pseudomonas sp O3 与对照差异显著
( P < 0101) ,其他固氮菌与对照差异不显著 ,固氮菌株
能够提高燕麦全氮含量 ; 各处理固氮百分率为
41546 % ～ 211173 % , 其 中 Pseudomonas spN4 最 高
(211173 %) ,其余依次为 A1 lipoferum O6、Azotobacter sp
O5、Zoogloea sp W6、Azotobacter sp W5、Zoogloea sp C6 和
Pseudomonas sp O3 ;固氮量为 2117～10161kgΠhm2 。固
氮量 Pseudomonas sp N4 最高 10161kgΠhm2 ,其余依次为
A1 lipoferum O6、Azotobacter sp O5、Zoogloea spW6、
Azotobacter sp W5、Zoogloea sp C6 和 Pseudomonas sp O3 ,
其中 Pseudomonas sp N4 与其他固氮菌差异显著 ( P <
0101) , Pseudomonas sp O3 与 Zoogloea sp C6 差异不显
著 ,A1 lipoferum O6、Azotobacter sp O5、Zoogloea sp W6 和
Azotobacter sp W5 之间差异不显著 ;15 N 原子百分超为
110871 % ～ 113791 % , Pseudomonas sp N4 最 小
(110871 %) ,其他次之 ,除 Pseudomonas sp O3 外 ,均与
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对照差异显著 ( P < 0101) 。
表 1 　不同菌株处理的燕麦地上干物质 N 含量
和15N 原子百分超
Table 1 　N concent and atom % 15N excess of
above ground dry matter of Oat treated with
different bacteria strains from Oat
菌株
bacteria
strains
N 含量
N concent ( %)
15N 原子
百分超
atom % 15N
excess
固氮百分率
percent of
N fixation
( %Ndfa)
总固氮量
total N
fixation
(kgΠhm2)
O6 0167aA 111309dD 171997 6186bB
O5 0165aA 111865cC 131966 5178bB
W5 0149cB 112287bB 101906 4167bB
C6 0158bAB 112451bB 91716 3128cC
CK 0148cB 113791aA Π Π
O3 0163aA 113164aA 41546 2117cC
N4 0158bAB 110871eE 211173 10161aA
W6 0153bcAB 112013bB 121892 5121bB
注 :小写字母表示差异显著 ( P < 0105) ;大写字母表示差异极显著 ( P <
0101) ;CK表示不接种固氮菌的半量尿素。下表同。
Note : The same or different letters mean no significant or significant difference
between the treatments respectively. Small letters means ( P < 0105) , capital
letters means ( P < 0101) . CK means half N2fertilizer. The same as in the
following table.
　　对接种到燕麦根际固氮菌的地下部分固氮量测定
的结果见表 2。
表 2 　不同菌株处理的燕麦地下部干物质 N 含量
和15N 原子百分超
Table 2 　N concent and 15N atom % excess
of under ground dry matter of Oat treated
by different bacteria strains
菌株
bacteria
strains
N 含量
N concent
( %)
15N 原子
百分超
15N atom %
excess
固氮百分率
percent of
N fixation
( %Ndfa)
总固氮量
total N
fixation
(kgΠhm2)
O6 1109cC 111726bB 81039 1156cC
O5 113bB 111813bB 71356 1195bcBC
W5 1112cC 112129aA 41878 1162cC
C6 1137bB 112137aA 41851 1156cC
CK 1106cC 112751aA Π Π
O3 1136bB 111208cC 121101 2152bBA
N4 1155aA 110921cC 141352 3196aA
W6 1114cC 111665bB 81517 3189aA
　　表 2 显示 ,燕麦地下部分的固氮百分率、固氮量以
及全氮含量差异均较大。各处理全氮含量增加 218 %
～46122 % , Pseudomonas sp N4 增加最多 (46122 %) ,其
余 依 次 为 Zoogloea sp C6、Azotobacter sp O5 和
Pseudomonas sp O3 ,与对照均差异显著 ( P < 0101) ;各
处理的固氮百分率为 41851 %～141352 % , Pseudomonas
sp N4 最高 (141352 %) ,其余依次为 Pseudomonas sp O3、
Zoogloea sp W6、A1 lipoferum O6 和 Azotobacter sp O5 ,与
对照差异显著 ( P < 0101) ;固氮量为 1156～3196kgΠ
hm2 , Pseudomonas sp N4 最多 ( 3196kgΠhm2 ) , 其次是
Zoogloea sp W6 和 Pseudomonas sp O3 ,与其他固氮菌差
异显著 ( P < 0101) ;各处理 15N 原子百分超为 110921 %
～112751 % , Pseudomonas sp N4 最小 (110921 %) ,其次
是 Pseudomonas sp O3、Zoogloea sp W6、A1 lipoferum O6
和 Azotobacter sp O5 ,与对照差异显著 ( P < 0101) 。
3 　结论与讨论
311 　结论
固氮菌的15N 原子百分超 ,植株地上部为 110871 %
～113791 % , Pseudomonas sp N4 最低 ( 110871 %) , 除
Pseudomonas sp O3 外 ,均与对照差异显著 ( P < 0101) ;
地下部分为 110921 %～112751 % , Pseudomonas sp N4 最
低 (110921 %) ,除 Azotobacter sp W5 和 Zoogloea sp C6
外 ,均与对照差异显著 ( P < 0101) 。其中 Pseudomonas
sp N4、A1 lipoferum O6 和 Zoogloea sp W6 固氮能力较
好。
固氮菌接种能够提高燕麦的全氮含量、固氮百分
率和固氮量。固氮菌处理的地上植株全氮含量增加
2108 %～39158 % ,A1 lipoferum O6 最高 (39158 %) ;地下
部分增加 218 %～46122 % , Pseudomonas sp N4 增加最
多 ( 46122 %) 。地上植株固氮百分率为 41546 %～
211173 % ,其中 Pseudomonas sp N4 最高 (211173 %) ;地
下部分 41851 %～141352 % , Pseudomonas sp N4 最高
(141352 %) 。地上植株固氮量为 2117～10161kgΠhm2 ,
Pseudomonas sp N4 最高 (10161kgΠhm2 ) ;地下部分 1156
～3196kgΠhm2 , Pseudomonas sp N4 最多 (3196kgΠhm2 ) 。
312 　讨论
利用15N 同位素稀释法测定禾本科植物固氮菌固
氮量的研究较多。Rennie 报道玉米 ( Zea mays) 根际接
种固氮菌 A1 brasilense ,有 1216 %的氮素量来自空气 ,
如果在培养基中再加入碳源 ,则其固氮率可增加至
38 %[10 ] 。Lethbridge 等发现小麦接种固氮菌 ,不加碳
源 ,则其固定氮素量甚微[12 ] 。Malik 等研究发现 ,实验
室条件下不加碳源时 ,对生长于半固体营养培养基上
的 Kallar 草等接种固氮菌 , 其固氮率为 63183 %～
80115 %[13 ] ;用熏蒸剂处理的土壤进行盆栽接种实验 ,
其固氮率为 6106 %～ 31192 %[10 ] ; 田间接种固氮率
26 % ,固氮量为 60kgΠhm2 [13 ] 。Haahtela 等对草地早熟
禾 (Poa pratensis)根际接种固氮菌 K1 pneumoniae 发现 ,
914　4 期 15N 同位素稀释法测定燕麦根际固氮菌固氮量的研究
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在不加碳源的情况下 ,713 %～3318 %氮素量来自空
气[14 ] 。Hussain 等将分离自甘蔗根际的固氮菌株
Herbaspirillum ZM 176、Herbaspirillum SS1、Herbaspirillum
SS20、Azospirillum SR 10、Acetobacter SR 23、Acetobacter
SR46 接种于甘蔗 , 测定发现其固氮率为 111 %～
4816 %[19 ] 。从上述研究报道和本次小区实验得出燕
麦的固氮百分率为 41546 %～211173 %来看 ,禾本科植
物固氮菌的固氮量存在较大差异[11～19 ] ,这与所用的植
物材料、菌株、培养条件、基质等诸多因素有关[16～18 ] 。
豆科根瘤的固氮量为 10～350kgΠhm2 ,鱼腥藻为 40～
120kgΠhm2 ,念珠藻 19～60kgΠhm2 [7 ] 。从对固氮量已有
的研究报道和本研究得出的燕麦根际固氮菌固氮量为
2117～10161kgΠhm2 来看 ,禾本科植物的固氮量较低。
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