全 文 ：文章编号 :100028551 (2001) 0320167207
Cu、Zn、Pb、Cd 对鲫鱼 ( Carassius auratus)
组织 DNA 毒性的研究
周新文1 　朱国念2 ,孙锦荷1 　葛才林3
(11 浙江大学核农所　浙江 杭州　310029 ;21 浙江大学农药所　浙江 杭州　310029 ;
31 扬州大学农学院　江苏 扬州　225009)
摘 　要 :用非程序 DNA 的合成作为毒性评价指标研究了混合重金属对鲫鱼 ( carassius
auratus)组织 DNA 的毒性作用 ,结果表明 ,混合重金属的毒性作用靶标器官是鱼脑和
鱼的肝脏 ;混合重金属中的主要毒性成分是 Zn、Pb 和 Cd 离子 ,混合重金属对鱼脑组
织的毒性大小顺序是 Pb > Cd > Zn ,对肝脏 DNA 的毒性顺序为 Pb > Zn > Cd ;Cu 离子
能够降低其它 3 种离子的毒性作用 ,降低的机制在于竞争作用 ,导致了其它离子的吸
收降低。
关键词 :3 H2TdR ;混合重金属 ;鲫鱼 ;DNA
收稿日期 :2001201215
作者简介 :周新文 (1969～) ,男 ,湖北人 ,浙江大学 98 级生物物理专业博士生 ,主要从事环境毒理学研究
传统的生态毒理学的评价程序是在实验室内单一评价多种化合物的相对毒性 ,根据化合
物的相对毒性进行毒性分级。实际上 ,在自然界中 ,各种动植物不可避免地曝露在混合化学物
质中[1 ] ,从吸收和毒性的角度看 ,很少有研究报道混合物中究竟哪些成分在起协同、拮抗及加
和作用[2 ] 。其次 ,在毒性评价上 ,主要用 LC50或 EC50来评判混合组分之间相互作用的关系 ,这
种评价方法都是在较高剂量下进行的 ,而高剂量混合物组分间相互作用的毒性行为与低剂量
混合物组分对生物体的毒性作用并不完全一样[3 ] 。研究还表明重金属如 Pb、Cd 等对生物具有
遗传毒性 ,干扰 DNA 的代谢 ,并可导致染色体和 DNA 分子的变异[4 ] 。基因毒性试验的结果与
传统的毒性评价方法具有较好的相关性 ,用基因毒性评价具有早期预警作用 ,因此越来越受到
人们的青睐[5～8 ] 。针对目前低浓度复合污染的现状 ,在对京杭运河污染水平实际调查的基础
上 ,选择 Zn、Pb、Cd、Cu 4 种主要的污染离子 ,用非程序 DNA 合成 (UDS) 作为毒性指标 ,研究了
其在低浓度时的毒性作用行为。
1 　材料与方法
111 　试剂
CuCl2 、ZnSO4 、CdCl2 、Pb (NO3 ) 2 均为分析纯试剂 ,3 H2胸腺嘧啶核苷 (3 H2TdR) 由中国科学院
上海原子核所提供 (放射性活度为 317 ×107Bq/ m1 ,放射化学纯度 > 95 %) 。
761　核 农 学 报　2001 ,15 (3) :167～173Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
鲫鱼 ( Carassius auratus)由近江水产公司购得 ,体重 20～25g。在暴过气的自来水中驯养 1
周后 ,供试验用。
112 　试验方法
11211 　试验条件 　试验在实验室条件下进行。在 50L 的水族箱中放养 5 尾鱼 ,驯养和试验期
内的温度控制在 25 ±1 ℃,同时保持 12h 的光照与 12h 的黑暗。试验期内禁食。
11112 　处理方法 　驯养 1 周后的鱼分别进行两种试验 (见表 1) ,单一处理试验 :鲫鱼分别曝露
于 011mgΠL 的 Cu2 + (CuCl2 ) 溶液、0105mgΠL 的 Zn2 + (ZnSO4 ) 溶液、0102mgΠL 的 Pb2 + [ Pb (NO3 ) 2 ]溶
液、0101mgΠL 的 Cd2 + (CdCl2 )溶液中。明确单一重金属的毒性大小及毒性作用器官 ;混合处理
试验 :鲫鱼分别曝露于不同组合的重金属混合溶液中 ,混合重金属离子浓度与单一浓度处理一
样。明确 Zn、Pb 与 Cd 3 种金属离子是否会增加 Cu 离子的毒性及混合重金属毒性靶标器官。
各种处理经过 48h 曝露后 ,给每条鱼腹腔注射 50μl 稀释的3 H2TdR ,6h 后取样冷冻供分析。
表 1 　重金属的曝露试验处理
Table 1 　Heavy metals exposure regime
处理 treament Cu 　011mgΠkg Zn 　0105mgΠkg Pb 　0102mgΠkg Cd 　0101mgΠkg
1 + - - -
2 - + - -
3 - - + -
4 - - - +
5 + + - -
6 + - + -
7 + - - +
8 + + + -
9 + - + +
10 + + - +
11 + + + +
　　注 :处理 3 次重复。
Note :The each treatment has 3 duplications.
113 　样品制备及分析
在 4 ℃下解剖鱼 ,分别取大脑、鱼鳃、肝脏组织 ,用冰生理盐水洗净 ,用滤纸吸水后 ,称取各
组织 100mg ,用冰生理盐水制成 10 %匀浆 ,转移至 10ml 离心管中 ,并用冰生理盐水 1ml 洗涤研
钵 3 次 ,合并滤液。加入 10 %三氯乙酸 5ml ,3000rpm 离心 15min ,弃上清液 ,沉淀物用 1∶1 乙醚
∶乙醇洗涤 3 次 ,然后加入 0120ml 62 %高氯酸、012ml 双氧水 ,在水浴中消化 2h。冷却后用
015M的 NaOH调节 pH至中性。吸取 012ml 样品 ,加到含有 10ml 闪烁液 ( PPO 7g ,POPOP 015g ,
650ml 二甲苯 ,350ml 乙二醇乙醚)的测量瓶中 ,放置 24h 后 ,用 WALLAC21400 液闪计数仪作均
相测量。结果以 100mg 鲜重组织中的 dpm 数表示。数据分析参考文献[9 ] ,并用 Excell 数据分
析工具库函数进行分析。
2 　结果与讨论
211 　单一重金属离子对3 H2TdR 掺入鲫鱼肝脏、脑组织的影响
曝露 48h 后取肝脏组织 ,并分析肝脏细胞 DNA 中掺入的放射性活度。结果发现 Cu 处理
861 核　农　学　报 15 卷
图 1 　混合重金属各成分对肝脏组织非程序 DNA 合成的影响
Fig. 1 　Components effects of the mixture metals on the liver’s UDS
中 (图 1)掺入的放射性活度为 764 dpm/ 100mg ,对照组掺入的放射性活度为 856 dpm/ 100mg。
方差分析表明 ,Cu 处理掺入肝脏 DNA 中的放射性与对照无明显差别 ( F = 2103 , P = 01167) 。
也就是说 ,Cu 处理在该浓度下对鲫鱼肝脏细胞无损伤。Zn、Pb、Cd 处理组掺入的放射性活度
分别为 1059 ,2507 和 1692 (dpm/ 100mg) ,均明显高于对照 ( F = 8196 , P < 01001) ,表明 Zn、Pb、Cd
的毒性作用引发了鲫鱼肝脏细胞 DNA 的断裂 ,使得标记的3 H2胸腺嘧啶核苷在 DNA 的修复过
程中大量掺入。从掺入的放射性活度比较混合重金属组分对肝脏细胞 DNA 的毒性大小 ,可得
出 Pb 离子的毒性最大 ,其次依次为 Zn 离子、Cd 离子、Cu 离子。
图 3 　混合重金属对不同组织 DNA 的毒性比较
Fig. 3 　Toxicity comparison among the different
tissues’DNA by the mixture metals
图 2 　混合重金属各组分对鱼脑非
程序 DNA 合成的影响
Fig. 2 　Componebts effect of the mixture metals
on the brain’s UDS
分析脑组织 DNA 中的放射性发现 (图
2) ,对照和 Cu 处理掺入的放射性活度分别
为 381 和 403 (dpm/ 100mg 组织) ,方差分析
结果表明 ,Cu 处理组脑组织中掺入的放射
性活度与对照组无显著差异 ( F = 01360 , P
= 01554) ,表明在该浓度下 Cu2 + 对鱼脑组
织DNA 也无损伤作用。Zn、Pb、Cd 处理组
掺入的放射性活度分别为 701 ,1454 和 1111
(dpm/ 100mg 组织) ,掺入的放射性活度高于
对照组 ,这些处理对鱼脑组织 DNA 具有明
显的毒性作用 ( F = 81110 , P < 01001) 。从
毒性大小看 , Pb > Cd > Zn > Cu。与肝脏相
比 ,Zn 和 Cd 的毒性顺序存在差异。对鱼脑
而言 ,Cd 由于对该组织有特异亲和性 ,即使
在较低浓度下也可观测到 DNA 的损伤作
用。
212 　混合重金属离子对3 H2TdR 掺入鲫鱼
不同组织 DNA 的影响
图 3 表明 ,从掺入的相对放射性活度
百分比来看 ,肝脏的掺入相对百分比最大 ,
比对照高 3911 %。其次是脑组织DNA 中掺
入的放射性活度相对百分比为 3019 %。腮
961　3 期 Cu、Zn、Pb、Cd 对鲫鱼 ( Carassius auratus)组织 DNA 毒性的研究
组织 DNA 中掺入的放射性活度百分比最低 ,只有 1312 %。从比较掺入放射性相对百分比来
看 ,混合重金属的毒性靶标器官主要是肝脏和鱼脑。原因归结于肝脏是重金属离子的积累器
官 ,同时在混合物中的 Pb 和 Cd 成分作为单一毒物而言 ,对脑组织具有特异的毒性作用。
213 　Zn、Cd、Pb 影响 Cu 对肝脏、脑组织非程序 DNA 的合成作用
根据表 1 的处理体系考察 Zn、Cd、Pb 影响 Cu 对鲫鱼肝脏组织 DNA 的毒性 ,表 2 方差分析
结果表明 ,Zn、Zn2Cd、Pb2Cd、Zn2Cd 以及 Zn2Pb2Cd 这 5 种加 Cu 处理 ,3 H2TdR 掺入肝脏 DNA 中
的放射性活度与单独 Cu 处理相比均有显著差别。Zn2Cu 的处理掺入的3 H2TdR 放射性活度为
584dpm/ 100mg 组织 ,而单独 Cu 处理掺入放射性为 764 dpm/ 100mg 组织 ,说明 Zn 能够降低 Cu
对肝脏组织 DNA 的损伤 , 而 Zn2Cd 892dpm/ mg 组织、Pb2Cd 1070dpm/ 100mg 组织、Zn2Cd
892dpm/ 100mg 组织以及 Zn2Pb2Cd 1315dpmΠ100mg 组织加 Cu 的处理 ,掺入的放射性活度均高于
Cu764dpm/ mg 组织的处理 ,说明这 4 种处理的毒性作用大于单独 Cu 处理的毒性 ,进一步分析
可发现 ,Zn2Cd、Pb2Cd、Zn2Cd 以及 Zn2Pb2Cd 加 Cu 的处理中掺入的放射性活度又低于毒性较大
的 Pb 1437dpmΠ100mg 组织和 Cd 961dpm/ 100mg 组织单独处理时的放射性活度 ,反过来可以说 ,
Cu 能够降低低浓度其它 3 种金属离子带来的毒性 ,Pb2Cu 的处理 633dpm/ 100mg 组织与单独
Cu 处理 764dpmΠmg 组织无显著差别 ,进一步证明 Cu 能够降低其它元素的毒性 (图 4) 。
图 4 　8 种不同处理中肝脏 DNA 中的放射性活度
Fig. 4 　Radioactivities in the DNA of liver exposured to the 8 different treatments
表 2 　各处理肝脏 DNA中放射性活度的变异分析
Table 2 　Variance analysis of the radioactivity in the DNA of livers exposed to
various combinations of the mixture metals
变异来源
source
平方和
sum of square
自由度
DF
均方和
mean square
F 值
F ratio
P 值
P value
Zn 23036118 1 23036118 17177 < 01001
Pb 1397144 1 1397144 0112 01732
Cd 56333011 1 56343011 12114 0100233
Zn2Pb 12414193 1 12414193 01479 01489
Pb2Cd 56212412 1 56212412 91875 0100473
Zn2Cd 98905176 1 98905176 8105 0100959
Zn2Pb2Cd 1823366 1 1823366 24113 < 01001
从脑组织DNA 中掺入的放射性活度来看 ,Zn、Pb、Cd、Zn2Pb、Pb2Cd 加 Cu 处理 (表 3)与单独
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Cu 处理比较无显著差异 ,只有 Zn2Cd 769dpm/ 100mg 组织和 Zn2Pb2Cd 1167dpm/ 100mg 组织这两
组加 Cu 处理与 Cu 493 dpm/ 100mg 组织单独处理显著不同 ,且掺入的放射性活度明显高于 Cu
处理 ,而低于毒性较大的 Pb1451dpm/ 100mg 组织和 Cd1111dpm/ 100mg 组织单独处理 ,与肝脏处
理结果类似。
图 5 　8 种不同处理中鱼脑 DNA 中的放射性活度
Fig. 5 　Radioactivities in the of DNA of brain exposured to the different treatments
表 3 　各处理鱼脑 DNA中放射性活度的变异分析
Table 3 　Variance analysis of the radioactivity in DNA of
brian exposed to various combinations of the mixture metals
变异来源
source
平方和
sum of square
自由度
DF
均方和
mean square
F 值
F ratio
P 值
P value
Zn 20554136 1 20554136 11208 01285
Pb 59592164 1 59592164 4134 010502
Cd 5178164 1 5178164 01323 01576
Zn2Pb 9423179 1 9423179 01568 0146
Pb2Cd 13770127 1 13770127 1106 01315
Zn2Cd 61651912 1 61651912 9163 010056
Zn2Pb2Cd 3208384 1 3208384 36142 < 01001
当化学毒性物质进入水体后对水体生物的有效性主要涉及下面 3 个过程[10 ] , (1) 化学和
物理化学过程 ,与水体中的各个物质发生相互作用后 ,对生物体产生毒性作用 ; (2) 生理过程 ,
该过程涉及到物质的吸附、转运、分配、代谢转移、积累和排除的一系列变化 ; (3) 脱毒过程 ,主
要与受体结合有关的过程。
有关重金属离子相互作用毒性机制方面的报道较少。金属离子非常重要的某些因子的改
变以及在进入位点上的竞争都能影响它的生物有效性 ,例如 ,有些金属离子只有在离子状态下
才能被生物体吸收 ,而有些则只有形成有机复合物后才能通过生物膜进入到生物体内。Zamu2
da 和 Sunda 研究了 Cu 离子的毒性作用 ,他们利用有机络合物控制金属离子的浓度 ,测定溶液
中的自由离子浓度和毒性之间的关系 ,结果发现 ,毒性大小与自由离子的浓度相关 ,而不是与
溶液中溶解的离子浓度相关。他们在研究 Cu 和 Mg 相互对海水浮游植物生长的影响时发现 ,
Mg离子的增加可以加快浮游植物的生长 ,加入 Cu 离子后 ,Cu 离子抑制了 Mg 离子的吸收 ,使
171　3 期 Cu、Zn、Pb、Cd 对鲫鱼 ( Carassius auratus)组织 DNA 毒性的研究
浮游植物的生长缓慢。他们把原因归结为 Cu 抑制 Mg 离子进入浮游植物体内造成的结果[11 ] 。
一种金属离子还可以通过交换途径改变另一种金属离子在组织中的浓度。Engel 和 Brou2
wer 发现 Cu 的毒性作用对蜕皮期的蟹 ( calinectes sapidus)是增加的 ,因为 Zn 能够替代结合在中
肠腺金属硫蛋白上的 Cu ,结果随着 Cu 离子在中肠腺被释放出来 ,自由状态的 Cu 离子在中肠
腺的浓度增高。毒性作用也随着 Cu 离子浓度的增加而增大[12 ] 。
在我们的研究中 ,Cu 离子在 011mgΠL 的浓度下对鲫鱼肝脏、鱼脑的 DNA 无损伤作用 ,从
Cu 与 Zn、Pb、Cd 相互作用的结果来看 ,Cu 离子能够明显降低其它金属离子的毒性作用 ,这种
降低的机制在于离子间的竞争作用 ,竞争的结果使得进入鱼体内的金属离子浓度降低。
3 　结 　语
混合重金属联合作用的研究有助于对其污染效应进行分析和评价。我们的研究可以得出
以下结论 :
11 混合重金属的毒性作用的靶标器官是鱼脑和鱼肝脏 ;
21 在混合重金属中起主要毒性作用的重金属是 Pb、Zn 和 Cd。在肝脏中的毒性大小顺序
为 Pb > Zn > Cd ,鱼脑中的顺序为 Pb > Cd > Zn ;
31 作为混合金属离子的联合毒性作用 ,Cu 离子具有抑制 Zn、Pb、Cd 离子及其它各种离子
组合的毒性作用 ,抑制的机制可认为是 Cu 离子与其它离子在吸收上存在着竞争 ,竞争的结果
抑制了重金属离子在体内的浓度 ,结果降低了混合重金属离子的毒性作用。
参考文献 :
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271 核　农　学　报 15 卷
TOXICITY OF COPPER , ZINC , LEAD , CADIMUM
TO TISSUE’S CELL UR DNA OF THE FISH ( Carassius auratus)
ZHOU Xin2wen1 　ZHU Guo2nian2 　SUN Jin2he 　QE Cai2lin3
(11 Institute of Nuclear Agricultural Sciences ;21 Institute of Pesticide Sciences , Zhejiang University ,
Zhejiang University 　Hangzhou 　Zhejiang prov. 310029 ;31 Yangzhou University 　Yangzhou 　Jiangsu prov. 225009)
ABSTRACT :The toxicity of the mixture metals to tissue’s cellur DNA of the fish( Carassius aura2
tus) was studied by the unscheduled DNA synthesis( UDS) method. The results demonstrated that
the target organ for the mixture metals was the brain and liver. The key toxicity components in
the mixture metals is zinc , lead , cadimum , the magnitude sequence of the toxicity of the compo2
nents was Pb > Zn Cd in the liver , that sequence in the brian was Pb > Cd > Zn. Copper could
decrease the other metlas toxicity as there was the competition between the copper and the other
metals , which lead to the decrease uptake of the other metals.
Key words :DAN toxicity ; copper lead cadimum ; fish ( Carassius auratus)
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