全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062477205
速生型刺槐遗传转化体系的建立
沈俊岭1 　赵　芳1 　李　云1 　陈受宜2 　田秀红2
(11 北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室 ,北京　100083 ;
21 中国科学院遗传与发育生物研究所 ,北京　100101)
摘 　要 :为获得稳定的转基因刺槐植株 ,以速生型刺槐叶轴为转化受体 ,对转化过程中的一些影响因素进
行了探究 ,建立了较为完善的遗传转化体系。结果表明 :继代 20～35d 之间刺槐叶轴最适宜转化 ;卡那
霉素的筛选浓度为 30mgΠL ;头孢霉素的抑菌浓度为 200mgΠL ;合适的侵染时间是 20min ;30mgΠL 的乙酰丁
香酮有利于抗性芽的发生 ;共培养 2d 对转化适宜 ;抑菌 7d 后再加选择压有利于抗性芽的产生。最后得
到的抗性植株经 PCR 检测 ,初步证明外源目的基因 OsDREB1 已整合到刺槐基因组中。
关键词 :刺槐 ;叶轴 ;农杆菌 ;遗传转化
ESTABLISHMENT OF GENETIC TRANSFORMATION SYSTEM OF FAST- GROWING BLACK LOCUST
SHEN Jun2ling1 　ZHAO fang1 　LI Yun1 　CHEN Shou2yi2 　TIAN Xiu2hong2
(11 Key Lab of Genetics and Breeding of Forest Tree and Ornamental Plants of Ministry of Education , Beijing Forestry University , Bejing 　100083 ;
21 Institute of Genetics and Developmental Biology , Chinese Academy of Science , Bejing 　100101)
Abstract :The rachis of fast2growing Black Locust was used as explants in the study. The factors that affected transformation
ratio were studied , and a stable transformation system was established. The results suggested that germinated shoots which 20～
35dsdd in vitro were suitable for transgenic. The optimal concentration of kanamycim to the rachis was 30mgΠL and that of
cefotaxine was 200mgΠL. The ideal time for rachis dipping in Agrobacterium was 20min and optimal co2cultivation was 2 days.
30mgΠL acetosyringone could increase the transformation ratio. The selection of the inoculated rachis was done at 7th days of
bacterial inhibiting treatment by cefotaxine. The PCR analysis showed that the target gene OsDREB1 was integrated into the
genome of black locust .
Key words :black locust ; rachis ; agrobacterium ; genetic transformation
收稿日期 :2006205230
基金项目 :国家林业局重点推广项目 (20032522)
作者简介 :沈俊岭 (19792) ,女 ,山东德州人 ,硕士 ,从事林木基因工程育种的研究。Email : junLing5541 @1631com。李云为通讯作者 , Tel : 010
62336094 ; Email :yunLi63 @1631com　　刺槐 ( Robinia pseudoacacia L. ) 是重要的多用途树种 ,在材性、抗逆性、生物量等方面都具备十分优良的特性 ,是我国干旱、半干旱地区的造林先锋树种。刺槐系喜光树种 ,不耐蔽荫 ,喜温暖湿润气候 ,不耐严寒 ,在我国北方大多数较寒冷地区生长不良 ,晚霜和严寒常会导致刺槐顶端分生组织冻死或枯梢 ,下一年又从新的部位萌发枝条 ,造成主干分杈 ,严重影响了刺槐的高生长和干性[1 ,2 ] 。为解决这些问题 ,育种工作者通过人工选优、杂交等方法培育优良品种及对苗木进行抗寒性锻炼等 ,但受现有种质资源的限制 ,抗寒改 良效果不够显著。植物基因工程的发展 ,为刺槐的遗传改良提供了条件 ,利用转基因技术进行刺槐遗传转化有望解决刺槐抗寒性差的问题。已有文献报道[3～7 ] ,刺槐下胚轴、子叶、茎段和叶片均可作为转化受体材料进行遗传转化 ,但以叶轴作为转化受体还未见相关报道。我们以刺槐叶轴为转化受体 ,以农杆菌介导法将抗寒基因 OsDREB1 转入刺槐 ,并对转化过程中的影响因素进行了初步研究 ,以期建立高效、稳定的刺槐遗传转化体系 ,为刺槐抗寒性状的改良及应用推广提供实验技术及依据。
774　核 农 学 报　2006 ,20 (6) :477～481Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　刺槐　国外引进的速生型二倍体刺槐 ,取继代
培养 20～35d、健壮的刺槐无菌组培苗 ,将其叶轴剪成
015～110cm 的小段 ,放到芽诱导培养基上进行预培
养 ,2d 后用于遗传转化。
11112 　农杆菌与质粒 　本研究所用 OsDREB1 基因属
于 AP2ΠEREBP 基因家族[8 ] ,含有该基因的根癌农杆菌
GV3101 受赠于中国科学院遗传所陈受宜先生。携带
外源基因 OsDREB1 的植物表达载体结构如图 1 所示。
图 1 　植物表达载体 pBIN438-OsDREB1
Fig. 1 　Plant expression vector of pBIN438-OsDREB1
112 　方法
11211 　工程菌液的制备　从平板上挑取单菌落 ,接种
于 10ml 含有卡那霉素 ( Km) 浓度为 50mgΠL 的 YEP 液
体培养基中 (pH710) ,在恒温 28 ℃摇床上 180～200rpm
振荡暗培养过夜 ,当菌液 OD600为 016～018 时待用。
11212 　卡那霉素选择压的确定 　将预培养 2d 的刺槐
无菌组培苗叶轴分别接种到含 Km 浓度为 0、20、30、
50、100mgΠL 的芽诱导培养基上 ,每处理重复 3 次。刺
槐组培苗叶轴芽诱导培养基[9 ] 为 MS + 6 - BA 210mgΠL
+ NAA 015mgΠL ,蔗糖 3 % ,琼脂 015 % ,培养温度 25 ℃,
光周期 13hΠd ,光强 1500～2000lx ,30d 后统计抗性芽的
平均发生率。
11213 　头孢霉素对 GV3101 的抑制效果　用牙签挑选
1 个单菌落放入 20ml 含 Km 浓度为 50mgΠL 的液体
YEP 培养基中 ,180～200rpm 振荡暗培养过夜至对数生
长期。吸取 200μl 菌液分别加入到含有不同浓度的头
孢霉素 (Cef) (0、50、100、150、200、250、300、400mgΠL) 的
YEP 液体培养基中 ,同上条件培养过夜。取添加不同
浓度 Cef 的菌液各 2ml ,以不加菌液的液体 YEP 培养基
为空白 ,以未加 Cef 的菌液为对照 ,用紫外分光光度计
(TU21901)测定各种菌液的光吸收值 OD600 ,每处理重
复 3 次。计算 3 个处理的算术平均值。
11214 　转化条件的建立
1121411 　不同培养时间的叶轴对抗性芽发生的影响
　　将同一生长状态下的刺槐无菌苗接种到继代培养
基上进行继代培养 ,继代培养基为 MS + 6 - BA 011mgΠ
L + NAA 0105 mgΠL。选取继代 15、25、35、45、55、65d
的刺槐继代苗的叶轴进行遗传转化试验 ,每处理重复
3 次 ,每个重复接种 30 个芽。30d 后分别统计抗性芽
的个数 ,计算抗性芽的平均发生率。
1121412 　共培养时间对抗性芽发生的影响 　将侵染
后的叶轴放在共培养基上 ,分别共培养 1、2、3、4d 后再
进行抑菌 ,抑菌培养基为 MS + 6 - BA 210mgΠL + NAA
015mgΠL + KT 110mgΠL + Cef 200mgΠL ;每处理重复 3 次 ,
每个重复接种 50 个叶轴 ,30d 后分别统计抗性芽的个
数 ,计算抗性芽的平均发生率。
1121413 　侵染时间对抗性芽发生的影响 　将预培养
2d 后的叶轴放入 OD600 = 016～018 的农杆菌菌液中分
别侵染 5、10、15、20、25、30min ,每处理重复 3 次 ,每个
重复接种 50 个叶轴 ,30d 后观察其生长情况 ,统计抗
性芽的平均发生率。
1121414 　乙酰丁香酮 (AS) 对抗性芽发生的影响 　摇
菌 20h 后 ,向菌液中分别加入 AS ,使菌液中 AS 的最终
浓度为 10、20、30、40mgΠL ,继续摇菌 ,达到对数生长期
后用于侵染 ,每处理重复 3 次 ,每个重复接种 50 个叶
轴 ,30d 后观察其生长情况 ,统计抗性芽的发生率。
1121415 　培养方式对抗性芽发生的影响 　共培养后
采用光照培养 (2000lx) 和暗培养进行脱菌培养和选择
培养 ,每处理重复 3 次 ,每个重复芽数量为 30 个 ,30d
后分别统计抗性芽的发生率。
1121416 　延迟选择对抗性芽发生的影响 　在抑菌培
养 0、3、5、7、9、11d 后加入 Km ,使培养基中 Km 浓度为
30mgΠL 进行抗性芽的筛选试验 ,筛选培养基为 MS + 6
- BA 210mgΠL + NAA 015mgΠL + KT 110mgΠL + Km
30mgΠL + Cef 200mgΠL。每处理重复 2 次 ,30d 后分别统
计抗性芽个数 ,计算抗性芽的发生率。
113 　PCR检测
取抗 Km 植株的叶轴和嫩叶共 011g ,用 SDS 法提
取 DNA[10 ] ,并以此为模板 ,以质粒 DNA 作为阳性对
照、未经转化的刺槐组培苗 DNA 为阴性对照 ,进行
PCR扩增检测。引物 1 : 5′2CGG CGG GGC GGA CCA
AGT TCA G23′;引物 2 :5′2CGT CGG CGA GGA TGG CGT
CAC C23′。
PCR 扩增条件如下 : 预变性 94 ℃, 5min ; 变性
874 核　农　学　报 20 卷
94 ℃,30s ;复性 68 ℃,40s ;扩增 72 ℃1min ,30 个循环 ;延
伸 72 ℃,10min。预期片段大小为 500bp ,所以采用的电
泳琼脂糖凝胶浓度为 1 %。
2 　结果与分析
211 　Km 对叶轴不定芽再生的影响
为了确定刺槐叶轴在进行不定芽分化时所能忍受
的 Km 的临界浓度 ,在培养基中加入 Km ,使其终浓度
分别为 0、10、20、30、50 和 100mgΠL。30d 后统计叶轴不
定芽分化率 (表 1) 。
表 1 　Km对叶轴不定芽再生的影响
Table 1 　Effects of Km on regeneration of rachis buds
Km 浓度
concentration
of Km(mgΠL) 接种外植体总数 (个)totle No. of
explant
分化芽总
数 (个)
totle No. of
rachis buds
不定芽平均
再生率
average rate of
rachis buds
regeneration ( %)
0 38 34 89
10 28 8 29
20 30 1 3
30 32 0 0
50 30 0 0
100 34 0 0
　　从表 1 中可以看出当芽诱导培养基中不含 Km
时 ,叶轴再生频率可达 89 % ;含 Km 10～20mgΠL 时 ,叶
片再生受到抑制 ;含 30mgΠL 以上时 ,完全抑制了叶轴
的再生 ;更大浓度时 ,叶轴不定芽再生率均为零 ,而且
叶轴均迅速褐化死亡。因此本试验以 30mgΠLKm 作为
不定芽诱导阶段的选择压。
212 　头孢霉素对 GV3101 的抑制效果
Cef 对农杆菌 GV3101 抑制效果 ,如图 2 所示 :当
Cef 浓度达到 150mgΠL 时 , 菌液的 OD 值为 01023 ;
200mgΠL 时 ,菌液的 OD 值接近于零 ,说明 Cef 浓度为
200mgΠL 时即可满足抑菌的要求。
图 2 　头孢霉素对农杆菌 GV3101 的影响
Fig. 2 　Effects of Cefotaxine on agrobacrium GV3101
213 　不同继代时间组培苗叶轴对抗性芽发生的影响
刺槐组培苗继代约 15d 左右即可观察到明显的分
化生长现象 ,此后的组培苗叶轴已可以作为遗传转化
的材料 ;25d 左右 ,组培苗生长已达瓶口 ,此时茎间生
长较缓慢 ,上层复叶较大 ,小叶浓绿 ;40d 后 ,以长到瓶
口的苗子的茎呈盘旋生长状态 ,近瓶口处复叶很大 ,小
叶也显著增大 ,但观察到部分复叶的小叶泛黄 ; 60d
时 ,刺槐整株生长停滞 ,叶片发黄。
分别对继代 15、25、35、45、55、65d 的组培苗叶轴进
行遗传转化 ,30d 后 ,观察并统计抗性芽的发生率 ,结
果 (图 3) 表明 :继代 15d 的叶轴抗性芽率为 20 % ;25d
的叶轴抗性芽率最高为 3811 % ,得到的抗性芽数量最
多 (16 个) ;之后随着继代时间的逐渐增加 ,抗性芽率
也逐渐降低 ,其中 35、45d 相差不大 ,到达 55d 时 ,急剧
降低。由于继代 35d 后 ,刺槐组培苗的分化率降低 ,所
以继代 20～35d 的刺槐组培苗的叶轴适宜作为遗传转
化的受体材料。
图 3 　继代不同时期的无菌苗对抗性芽发生的影响
Fig. 3 　Effect of subculture time on
adventitious buds differentiation
214 　共培养时间对抗性芽发生率的影响
由表 2 可以看出 :共培养时间 2d 时 ,叶轴边缘开
始出现白色的菌落 ,这时进行抑菌处理 ,抗性芽的平均
发生率最高 ;超过 3d 后 ,部分叶轴已经褐化死亡 ,抗性
芽平均发生率明显降低。因此叶轴最适宜的共培养时
间为 2d。
215 　侵染时间对抗性芽发生率的影响
抗性芽的发生率是指叶轴经侵染和分化诱导后 ,
平均每叶轴分化出的抗性芽数量。结果显示 : 20min
时抗性芽发生率最高 (23105 %) ,随着侵染时间的延长
抗性芽发生率明显下降 ,30min 时已下降到 1112 % ,所
以侵染 20min 为刺槐叶轴最适宜的侵染时间。
974　6 期 速生型刺槐遗传转化体系的建立
表 2 　共培养时间对转化率的影响
Table 2 　Effects of co2cultivation on adventitious buds transgenic ratio
共培养时间
time of co2cultivation (d) 叶轴边缘菌生长状态state of Agrobacrium around rachis 抑菌后叶轴的生长状况status of rachis after antibiotic 抗性芽的平均发生率frequency of transgenic buds( %)
1
未见叶轴边缘有菌出现
no agrobacrium around the rachis
生长良好
the rachis grew well
15145
2
叶轴边缘有白色菌落出现
a little agrobacrium around the rachis
生长良好
the rachis grew well
32121
3
叶轴边缘布满白色菌落
many agrobacrium around the rachis
有部分叶轴褐化
part of rachis browned 12120
4
菌已把叶轴埋没
agrobacrium coverd the rachis
大部分叶轴已褐化
most of rachis browned 2101
图 4 　侵染时间对抗性芽发生的影响
Fig. 4 　Effect of infection time on
frequency of transformation
216 　不同浓度 AS 对抗性芽发生的影响
在试验的 4 个 AS 浓度中 ,30mgΠL 的抗性芽发生
率最高 ,达到了 40112 % ,表明此浓度的 AS 对叶轴遗
传转化有利。
217 　培养方式对叶轴抗性芽发生的影响
结果表明 ,两种培养方式对抗性芽的发生率没有
明显影响 ,但一直持续暗培养的材料生长较弱 ,产生的
抗性芽生长也较弱 ,但是发生的愈伤组织较多 ,本试验
采用前期暗培养 ,抗性芽产生后立刻转入光培养
(2000Lx) ,以利于抗性芽的生长。共培养后 ,需要暗培
养的时间约为 10～15d。
218 　延迟筛选天数对叶轴抗性芽发生的影响
表 3 为延迟筛选时间叶轴抗性芽的发生率 ,将其
进行反正弦转换 ( X →sin - 1 x ) 后 ,方差分析[11 ] 结果
(表 4)如下 :延迟筛选对抗性芽的发生率有显著影响 ;
进一步多重比较表明 ,延迟筛选 7～11d 对抗性芽发生
率的影响处于一个水平 ,延迟筛选 0～5d 对抗性芽发
生率的影响处于一个水平 ,前后两个水平的差异显著。
前者的抗性芽发生率明显高于后者 ,因此 ,抑菌 7d 后
就可以进行筛选。
219 　抗性芽的 PCR检测
对 km 抗性筛选植株进行 PCR 检测 ,结果如图 5
所示 ,以未转基因植株作为阴性对照 ,质粒为阳性对
　　　　表 3 　延迟筛选天数对抗性芽发生的影响
Table 3 　Effects of delayed selection on adventitious
buds differentiation
延迟筛选
天数
day of
delayed
selection
接种外植体数
(个)
No. of explants
抗性芽数 (个)
No. of transgenic
buds
抗性芽发生率 ( %)
frequency of
transgenic buds
重复Ⅰ
Brepeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
重复Ⅰ
repeat Ⅰ
重复Ⅱ
repeat Ⅱ
0 20 17 0 1 0 519
3 21 20 2 2 915 10
5 18 19 3 0 1617 0
7 24 21 8 9 3313 4219
9 19 25 8 8 4211 32
11 22 21 7 10 3118 4716
表 4 　延迟筛选天数对抗性芽发生影响的方差分析表
Table 4 　Variance analysis of effects of delayed selection
on adventitious buds differentiation
差异源
difference
constitutes
平方和 SS
sum of
squares
自由度 f
df
均方 MS
mean square
F F (0105)
延迟筛选时间
days of delay
selection
25071234 5 50114469 41816044 3 4139
误差 error 62417205 6 10411201
总计 total 31311955 11
照 ,有 2 个系号的植株经过 PCR 扩增得到和 CK+ 大小
一致的条带 ,初步证明外源目的基因已整合到刺槐基
因组中。
3 　结论与讨论
本研究初步建立了刺槐的遗传转化体系 ,以刺槐
叶轴作为转化受体 ,对转化过程中的主要影响因子进
行了探究 ,得出如下结论 :
311 　继代培养时间在 20～35d 之间的刺槐叶轴是适
宜的转化受体。
084 核　农　学　报 20 卷
图 5 　PCR 鉴定刺槐转基因植株
Fig. 5 　Identification of transgenic plant by PCR
1、2 :转基因植株 ; CK2 :未转化植株做阴性对照 ;
CK+ :质粒做阳性对照 ; Mr :DNA 分子量
1 ,2 :transgenic plant ; CK- :negative control ;
CK+ :positive control ; Mr :DNA maker
312 　叶轴 km 筛选浓度应为 30mgΠL。Igasaki 等[7 ]报道
根癌农杆菌介导的刺槐遗传转化 ,预试验结果表明刺
槐茎段对卡那霉素不敏感 ,对潮霉素敏感 ,筛选浓度为
20μgΠL。Davis J M 等[13 ]用下胚轴和子叶作为材料进行
刺槐的遗传转化结果证明 ,适宜的 Km 筛选浓度为
100mgΠL。牛正田等[12 ] 认为刺槐茎段对卡那霉素不敏
感 ,对 G418 敏感 ,对潮霉素极为敏感。比较 4 种试验
的结果可以看出 ,刺槐的不同器官对不同种类的抗生
素敏感程度不同 ,茎段对潮霉素敏感 ,而速生型刺槐的
叶轴对卡那霉素敏感 ;而且不同器官对同一种类的抗
生素敏感程度也不同 ,叶轴对卡那霉素的敏感程度要
高于下胚轴和子叶。
313 　在农杆菌均液中加入 AS 30mgΠL 时 ,抗性芽发生
率最高 ,达到了 40112 %。夏阳等[14 ,15 ]在对四倍体刺槐
进行遗传转化时 ,以愈伤组织为转化受体 ,向活化培养
好的农杆菌菌液及共培养基中分别加入不同浓度的
AS进行试验时 ,发现 AS 20mgΠL ,抗性芽发生率最高 ,
与本研究 AS 的使用浓度有明显差异 ,其原因可能是
AS在不同倍性植物的不同受体材料上的作用效果不
同 ;不同的加入方式对 AS 激活农杆菌 Vir 区基因的效
果也不同。
314 　叶轴合适的侵染时间是 20min ;共培养 2d 是较为
适宜的共培养时间 ;侵染或共培养时间过长 ,均会导致
农杆菌的过量生长 ,致使叶轴褐化死亡。
共培养 7d 后进行筛选 ,抗性芽的发生率较高
(37178 %) ,综合考虑其他因素的作用效果 ,此为最适
宜的延迟天数 ;直接筛选时抗性芽的发生率为 217 % ,
效果较差 ,是因为少数的转化细胞处在未转化的大量
死细胞之中 ,这些坏死细胞的分泌物会对其产生毒害
作用[16 ] 。延迟筛选有助于转化细胞分化及转化细胞
团或芽原基的形成 ;但如果延迟筛选时间太短 ,由于转
化细胞尚未开始生长 ,抗性基因没有完全表达 ,抗性芽
的发生率较低 (5d 时仅为 8111 %) ;若延迟筛选的时间
太长 ,虽然非转化细胞由于转化细胞的滋养作用也能
正常生长、有一个更高的抗性芽发生率 ,但同时也会产
生许多嵌合体和假阳性植株 ,增加后期检测的难度 ,所
以本试验选择了抗性芽发生较高水平的初始天数 7d
作为延迟筛选的天数。
经 PCR 检测得到了 2 个转基因植株 ,初步证明外
源目的基因 OsDREB1 已整合到刺槐基因组中。
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