全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　文章编号 :100028551 (2000) 0620371204
外源λDNA 导入普通小麦雄性
不育变异的分子验证
杨景成 3 　于元杰　刘凤珍　齐延芳 3 　沈法富
(山东农业大学农学系植物遗传工程实验室　山东　泰安　271018)
摘　要 :将外源λDNA 导入普通小麦品系 814527 ,获得一细胞质雄性不育变异体 ,稳
定成系 ,简称 D 型不育系 ,受体 814527 可作其保持系。用32 P 标记的λDNA 作为探
针 ,对受体 814527、D 型不育系及其与鲁麦 14 号的杂种 F1 核 DNA 和叶绿体 DNA
进行点杂交。实验结果表明 :D 型不育系及杂种 F1 核 DNA 和叶绿体 DNA 点杂交均
呈阳性反应 ,而受体无阳性反应。说明外源λDNA 片段已经整合进了不育变异体核
基因组和叶绿体基因组中 ,并且可以稳定遗传。该结果从分子水平上初步证明了外
源 DNA 导入技术的可靠性。
关键词 :外源 DNA 导入 ;小麦 ,细胞质雄性不育 ;点杂交
收稿日期 :2000201203
作者简介 :杨景成 (1971～) ,男 ,山东沾化人 ,中国科学院植物所博士。现工作单位 :山东省农业科学院原子能农业应用
研究所。
70 年代以来 ,外源 DNA 导入技术得到很大发展。导入技术体系不断完善 ,供体、受体范
围不断扩大 ,至此 ,已将 50 余种供体 DNA 导入 30 余种作物、蔬菜、林木当中 ,获得变异涉及株
型、叶色、生育期、抗性、品质等 30 多个质量性状和数量性状 ,选育出一批高产、优质、抗病新品
种和新品系以及大批具有优异性状的新种质 ,丰富了遗传资源。同时 ,人们在外源 DNA 导入
的可靠性验证和机制探讨方面展开了广泛研究。周光宇对高粱稻及其亲本进行了酯酶同工酶
分析 ,发现高粱稻的酶谱中有一条来自高粱的谱带[1 ] 。雷勃钧对野生大豆 DNA 导入栽培大
豆的变异后代及供体、受体进行 RAPD 分析 ,发现后代 DNA 多态性特异带与供体、受体 DNA
多态性相对应[2 ] 。Paul 用基因枪法将外源抗除莠剂基因转移到水稻幼胚中 ,用 Southern Blot
检测出外源抗除莠剂基因已转移到水稻 DNA 中[3 ] 。曾君祉用带 GUS 标记基因的质粒 PB Ⅲ
121 经花粉管途径转化小麦 ,选出 5 株转基因小麦 ,用荧光法和 X2GluC 染色法测试 ,检测到
GUS 基因的表达产物β2葡萄糖苷酸酶的存在[4 ] 。本文将报道对外源λDNA 导入普通小麦产
生的细胞质雄性不育变异体及其杂种 F1 和受体核 DNA 和叶绿体 DNA 点杂交的研究结果。
1 　材料与方法
111 　试验材料
173　核 农 学 报　2000 ,14 (6) :371～374Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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受体品系 814527、D 型不育系及其与鲁麦 14 号的杂种 F1 均由山东农业大学农学系植物
遗传工程实验室提供。λDNA 购自北方同正生化试剂公司 , [α232 P ] dCTP 及探针标记试剂盒
购自北京亚辉同位素公司。
112 　试验方法
1. 2. 1 　核 DNA 的提取及纯化 　参照褚启人的方法[5 ] ,提取并纯化受体、D 型不育系及其与
鲁麦 14 号杂种 F1 的核 DNA ,并用 UV22201 紫外检测仪测定 DNA 的纯度。
1. 2. 2 　叶绿体 DNA 的提取及纯化 　参照刘一农方法[6 ] ,提取并纯化受体、D 型不育系及其
与鲁麦 14 号杂种 F1 的叶绿体 DNA ,并用 UV - 2201 紫外检测仪测定 DNA 的纯度。
1. 2. 3 　放射性探针的标记 　探针标记采用 N T2C 缺口平移试剂盒。参照《分子克隆实验指
南》[7 ] ,用[α232 P]dCTP 对λDNA 进行放射性标记。
1. 2. 4 　杂交及放射自显影 　分子杂交参照《分子克隆实验指南》[8 ] 。以未标记的λDNA 作阳
性对照 ,用32 P 标记过的λDNA 为探针 ,分别与受体、D 型不育系及其杂种 F1 核 DNA 和叶绿体
DNA 进行点杂交。杂交完毕 ,于室温下将硝酸纤维素膜晾干 ,固定在一张硬纸上 ,用保鲜膜包
好 ,盖一张 X光片。 - 70 ℃曝光 2 d。X光片反拍成像。
2 　结果与分析
以未标记的λDNA 作阳性对照 ,用32 P 标记过的λDNA 作为探针 ,分别与受体 814527、D
型不育系及其杂种 F1 核 DNA 和叶绿体 DNA 进行点杂交和放射自显影。结果见图版 Ⅰ和
Ⅱ。
图版 Ⅰ　核 DNA 点杂交放射自显影图
Plate Ⅰ　Autoradiograph of
nuclear DNA dot blotting
1.λDNA 　2. 受体 814527 　3. D 型不育系　4. 杂种 F1
1.λDNA 　2. receptor 814527
3. D2type sterile line 　4. hybrid F1 图版 Ⅱ　叶绿体 DNA 点杂交放射自显影图Plate Ⅱ　Autoradiograph ofchloroplast DNA dot blotting1.λDNA 　2. 受体 814527 　3. D 型不育系　4. 杂种 F11.λDNA 　2. receptor 8145273. D2type sterile line 　4. hybrid F1
　　在两次杂交中 ,阳性对照λDNA 均出现阳性斑点 ,而受体 814527 无论核 DNA 还是叶绿
体 DNA 均呈阴性反应。这说明受体 814527 核基因组和叶绿体基因组都不具有与供体λDNA
同源的核苷酸序列。
273 核　农　学　报 14 卷
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D 型不育系核 DNA 和叶绿体 DNA 点杂交均呈阳性反应。说明 D 型不育系核基因组和
叶绿体基因组具有与供体λDNA 同源的核苷酸序列。这就意味着在导入以后供体λDNA 片
段不仅可以整合进受体核基因组中 ,而且可以整合到细胞质基因组 (叶绿体基因组)当中。
不育系杂种 F1 的杂交结果与不育系相同 ,核 DNA 和叶绿体 DNA 点杂交均出现阳性斑
点。这一结果表明供体 DNA 片段不仅可以整合进受体核基因组和叶绿体基因组中 ,而且可
以稳定遗传。
3 　讨 　论
311 　外源 DNA 导入的机制问题
关于外源 DNA 导入的机制 ,早在 70 年代周光宇就从分子生物学的角度提出了 DNA 片
段杂交假说。认为外源 DNA 导入受体以后 ,保存下来的某些 DNA 片段有可能被整合进受体
染色体 ,而在子代中表达典型的或更多的是非典型的遗传变异。后者可能是外源 DNA 加入
了受体性状基因表达的调控或数量遗传 ,影响了多基因表达体系的结果 ,而使子代出现变
异[1 ] 。这一假说成了开展 DNA 导入植物的理论基础。万文举提出外源 DNA 导入具有双重
作用 ,即基因转移和生物诱变的功能[9 ] 。但是 ,供体 DNA 片段在受体中整合的确切机制如
何 ,整合后的基因 (DNA 片段)如何表达等问题至今尚不清楚。
本研究发现 ,λDNA 导入普通小麦后产生的细胞质雄性不育系核基因组和叶绿体基因组
中均存在供体 DNA 片段 ,并且整合进变异体基因组中的供体 DNA 片段可以在后代中稳定遗
传。这说明可以通过外源 DNA 导入技术实现基因的转移。鉴于导入的供体是λDNA ,我们认
为通过外源 DNA 导入整合进受体基因组的更有可能是 DNA 片段 ,甚至是少数几个碱基 ,而
整合进完整基因的可能性较小。整合进受体基因组的 DNA 片段打破了受体原有的核苷酸顺
序 ,改变了其基因的表达和调控 ,从而引起后代变异。
312 　细胞质雄性不育与叶绿体基因组的关系
叶绿体是绿色植物细胞特有的细胞器 ,是高等植物核外的另一遗传系统。关于叶绿体遗
传系统与细胞质雄性不育的关系 ,研究结果不尽相同。
Kadowaki 等用 Pst Ⅰ和 Xha Ⅰ酶切水稻黎明不育系及其保持系的叶绿体 DNA ,电泳分析
未发现不育系与保持系之间 ctDNA 存在多肽性。在对水稻汕 97 不育系与保持系的 ctDNA
Hind Ⅲ酶切片段的研究中 ,也未发现差异[10 ] 。刘祚昌在对水稻细胞质雄性不育系与保持系叶
绿体离体翻译产物的研究中未发现二者的差异[11 ] 。而在小麦叶绿体翻译产物的研究中发现 ,
雄性不育系与保持系的叶绿体翻译产物有明显差异[12 ] 。高粱 3197A 和遗 3A 不育系均比保
持系 (3197B)多一个 52 ,000 道尔顿的变异多肽 ,而恢复系和 F1 叶绿体蛋白质中发现 3 种特异
多肽[13 ] 。刘一农对小麦雄性不育系及保持系进行限制性核酸内切酶酶切电泳 ,发现二者存在
明显差异 ,认为叶绿体基因组核苷酸序列的变异可能打破了叶绿体与细胞核及线粒体之间的
固有平衡 ,从而导致细胞质雄性不育性的形成[6 ] 。李继耕在具有萝卜、油菜细胞质的“湘矮”
不育系中 ,REFA 研究发现其 ctDNA 具有特异性序列 ,位于反向重复区 16rRNA 基因 5’端
410 至 210kb 之间。还发现萝卜不育系 401A ctDNA 的特异性序列编码核糖体蛋白小亚基
S12C - 末端 7 个和 S7N - 末端 93 个氨基酸残基 ,构成 rps12 - rps7 操纵子的一部分 ,说明叶绿
体核糖蛋白 S12 和 S7 可能和细胞质雄性不育性之间存在某种联系[14 ] 。
373　6 期 外源λDNA 导入普通小麦雄性不育变异的分子验证
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我们对λDNA 导入普通小麦后获得的细胞质雄性不育系及受体和杂种 F1 的叶绿体 DNA
进行了点杂交 ,发现不育系叶绿体基因组中具有在受体中不存在的供体 DNA 片段。这一结
果以及后来所做的叶绿体 DNA 的 RAPD 分析均说明 D 型细胞质雄性不育系与保持系叶绿体
DNA 序列存在明显差异 ,证明叶绿体基因组与该不育系的细胞质雄性不育有一定关系。
参考文献 :
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MOLECULAR VERIFICATION ON MALE STERILE MUTANT AFTER
INJECTED EXOGENOUSλDNA INTO WHEAT
YAN G Jing2cheng 　YU Yuan2jie 　L IU Feng2zhen 　Qi Yan2fang 　SHEN Fa2fu
( Plant Genetics Engineering L aboratory , Depart ment of A gronomy of S handong
A gricult ural U niversity , Taian , S handong prov . 271018)
ABSTRACT :A cytoplasmic male sterile mutant and then a stable cms l ine named D2type sterile
l ine were obtained after injected exogenousλD NA into wheat l ine 814527 ,and line 814527 could
be its maintainer l ine. By usingλD NA labled with 32 P as probe , unlabledλD NA as positive
check ,dot blottings of nuclear D NA and chloroplast D NA of receptor 814527 ,D2type sterile l ine
and its hybrid F1 with Lumai 14 were carried out. Positive dots appeared in nuclear D NA and
chloroplast D NA of D2type sterile l ine and its hybrid F1 , but did not appear in the receptor. It
showed that fragments of exogenousλD NA existed in nuclear genome and chloroplast genome of
D2type sterile l ine ,and could be inherited stably. All these results , on a molecular level , proved
the rel iabil ity of exogenous D NA injection.
Key words :exogenous DNA ;injection ;wheat ;cytoplasmic male sterility ;dot blotting
473 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
2000 ,14 (6) :371～374