全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 042357205
极端耐辐射奇异球菌 Deinococcus sp . BR501 切除
修复系统突变株的构建及功能的鉴定
刘秀敏1 ,2 　吴　菁2 　张　维2 　陆　伟2 　平淑珍2 　林　敏1 ,2 　陈　明2
(11 中国农业大学生物学院 ,北京　100094 ; 21 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081)
摘 　要 :极端辐射异常球菌 Deinococcus sp . BR501 的核苷酸切除修复系统 ,可能包含两条途径 :依赖于UV
损伤内切酶β(UvsE)的修复途径和依赖于 UV 损伤内切酶α(UvrABC)的修复途径 ,其关键酶分别为 UvsE
(dr1819 编码)和 UvrABC(A 亚基 dr1771 编码) 。根据 Deinococcus radiodurans 的序列 ,采用同源克隆的方
法 ,设计 PCR 引物、克隆基因和体外阻断目的基因 ,再通过 PCR 产物线性转化的方法 ,筛选到同源双交
换的重组阻断突变株 △dr1771、△dr1819 和 △dr1771 与 △dr1819 的双突变株。对此突变株和野生型均进
行 UV 辐射抗性和化学损伤试剂 MMC与 H2O2 的损伤修复能力的分析。结果表明了 BR501 中两条核苷
酸切除修复途径的存在 ,并且只有两条途径同时缺失时 ,才能使菌体对 UV 和 DNA 交联剂 MMC敏感。
关键词 :耐辐射微生物 ; Deinococcus radiodurans ; 切除修复
DISRUPTION AND CHARACTERIZATION OF THE EXCISION REPAIR PATHWAY IN THE
EXTREMELY RADIORESISTANT BACTERIUM Deinococcus SP. BR501
LIU Xiu2min1 ,2 　WU Jing2 　ZHANG Wei2 　LU Wei2 　PING Shu2zhen2 　LIN min1 ,2 　CHEN Ming2
(11 College of Biology , China Agricultural University , Beijing 　10094 ;
21Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081)
Abstract :Deinococcus sp . BR501 , an extremely radioresistant bacterium may contain two nucleotide excision repair pathways :
the UV damage endonucleaseβ (UvsE)2dependent excision repair pathway and the UvrABC2dependent pathway. And the UvsE
(coded by dr1819) and UvrABC(Unit A coded by dr1771) are their key enzymes respectively. PCR primers were designed
and homologous genes were cloned and disrupted in vitro according to the completely nucleotide sequence of Deinococcus
radiodurans R1 genome. Then PCR production was transformed to BR501 , and the disrupted mutants ( △dr1771 , △dr1819
and △dr1771dr1819) were checked and confirmed by homologous recombination. These mutants and the wild type were
irradiated by UV light and exposed to the DNA2damaging agents MMC and H2O2 . The results showed that these pathways were
existed in BR501 and only the two pathway losses could result in increased sensitivity to UV and MMC.
Key words :radioresistant bacterium ; Deinococcus radiodurans ; excision repair
收稿日期 :2006211207
基金项目 :国家高技术研究发展计划项目 (2004AA214170) ;国家自然科学基金项目 (30670050)
作者简介 :刘秀敏 (19782) ,女 ,河北唐山人 ,博士 ,从事极端环境微生物遗传工程的研究。Tel :010268919861 ; E2mail :lxiumin @gmail . com
通讯作者 :陈　明 (19622) ,男 ,广东兴宁人 ,博士 ,从事分子生物学研究。Tel :010268975038 ; E2mail :chenmingbio @hotmail . com　　1956 年 ,Anderson 等人首次从 4000 Gy X射线辐射过的肉罐头中分离到一株红色、无孢子的革兰氏阳性球菌 ( Deinococcus radiodurans R1) [1 ] ,此菌具有极强的电离辐射、紫外线、氢过氧化物和很多种 DNA 损伤试剂的抗性 ,并且具有极高的耐旱能力[2 ,3 ] ,其对电离辐 射的抗性是 E1 coli 的 250 倍 ,对 UV 辐射的抗性是 E.coli 的 20 倍[4 ,5 ] 。目前 ,所发现的极端辐射抗性微生物大多是奇异球菌科的细菌 ,已报道了 10 余种[6 ] 。鉴于此类细菌具有高效 DNA 损伤修复能力 ,深受微生物学家、放射学家和肿瘤研究人员的重视[6 ] 。探讨细胞
753　核 农 学 报　2007 ,21 (4) :357～361Journal of Nuclear Agricultural Sciences
对损伤 DNA 的修复机理对人类健康、污染环境的治理
等具有深远的影响[15 ,16 ] 。
我们从放射性污染的土壤中分离和筛选到 1 株耐
辐射的微生物菌株BR501 ,对其进行了 16 S rDNA 序列
比对、细胞形态的观察以及电离辐射生长曲线等特性
的分析 ,发现此菌株呈四分体球菌、辐射抗性远高于
E1 coli ,16S rDNA 序列与 Deinococcus radiodurans R1 的
相似性达 99 % ; 将其归属于 Deinococcus , 命名为
Deinococcus sp1 BR501[7 ] 。
Deinococcus radiodurans R1 的全基因组序列于 1999
年完成[8 ] ,发现该菌的核苷酸切除修复系统是两条途
径 :依赖于 UV 损伤内切酶β(UvsE) 的切除修复途径和
依赖于UV 损伤内切酶α(UvrABC)的切除修复途径[8 ,12] 。
缺少其中任一条途径 ,均不能使其对 UV 敏感[9 ,12～14] 。
本研究采用同源克隆的方法克隆了这两个基因 ,分别构
建了 △dr1771、△dr1819 突变株和 △dr1771 与 dr1819
( △uvsE、△uvrA、和△uvsE △uvrA) 双突变株[9 ] ,并验证
了其对 UV 辐射和 DNA 损伤化学试剂的敏感程度。
1 　材料与方法
111 　试验菌株和培养条件
菌株和质粒见表 1 ,限制性内切酶、连接酶、DNA
聚合酶购于 Promage 公司 ;引物合成由上海生工生物
工程技术服务有限公司完成 ;JM109 所用培养基 LB
(蛋白胨 10gΠL、酵母粉 5gΠL、NaCl 10gΠL、pH710 ) ;
Deinococcus1sp BR501 用 TGY培养基 (015 % 胰蛋白胨 ,
013 %酵母提取液 ,011 % 葡萄糖) ; Km ( Kanamycin , 卡
那霉素) 用量 8μgΠml 或 50μgΠml ;Aad (Spectionmycin ,壮
观霉 素 ) 为 350μgΠml 或 80μgΠml ; Ap ( 氨 苄 霉 素
Ampicillin)为 50μgΠml。
表 1 　菌株和质粒
Table 1 　Strains and plasmids
菌株和质粒
plasmids and strains
基因型或表型
genotype or phenotype
来　源
source
菌株 strains
Deinococus1sp BR501 野生型 本实验室保存
JM109 本实验室保存
△dr1771 dr1771 : : Km ,Kmr 本实验中构建
△dr1819 dr1819 : : Aad ,Aadr 本实验中构建
△dr1771 △dr1819 dr1771 和 dr1819 双突变株 ,
Kmr ,Aadr 本实验中构建
质粒 plasmind
p GEM2T APr 购于 Promage 公司
pUC4K Kmr 本实验室保存
p KatAAD2 Aadr 本实验室保存
112 　方法
11211 　PCR 方法和条件 　Deinococcus1sp BR501 基因
组 DNA 的提取采用天为时代公司的离心柱型细菌基
因组 DNA 提取试剂盒 Ⅱ(目录号 : DP302202) ; 质粒
DNA 的提取采用碱裂解方法 ; DNA 片段回收采用
QIAGEN公司 Gel Extraction Kit (目录号 20051) 。大肠
杆菌转化方法采用电穿孔转化法 ;扩增 dr1771 片段的
PCR 反应条件是 : 94 ℃ 5min ; 94 ℃ 30s ,56 ℃ 30s ,72 ℃
1min ,30 个循环 ;72 ℃5min。扩增 dr1819 片段的 PCR
反应条件是 :94 ℃5min ;94 ℃30s ,55 ℃30s ,72 ℃50s ,
30 个循环 ;72 ℃5min。
11212 　PCR 产物线性转化方法[9 ] 　将 Deinococcus 细
胞活化后转接新鲜的 2ml TGY培养基 ,长到 OD600nm约
016 左右。离心 (2700g ,10min) ,收集菌体 ,用 2ml TGY
培养基洗涤后 ,用 100μl TGY重悬 ,混合 40μl 013molΠL
CaCl2 ,取出 30μl 的混合液加到 5～10μl 的 PCR 产物
中 ,再将其放于 30 ℃温育 90min ,加入 2ml TGY培养基
继续培养 24h。取 100μl 涂布于相应抗生素的 TGY平
板上 ,30 ℃培养 3d。将长出的红色菌落接种于相应抗
生素的 TGY液体中 ,使其在抗生素压力下培养 ,纯化
阻断突变株 ,然后提取其基因组 DNA ,用上游校正引
物与下游引物进行 PCR 验证。
表 2 　dr1771 和 dr1819 的基因片段引物及校正引物
Table 2 　The primers of dr1771 and dr1819 to
clone and proofread
引物 primers 序列 sequence
1 dr17712up 5′2CCAGAAGACGACCAGCCA23′
2 dr17712down 5′2CGTCCACCAGAAACTTCAGCC23′
3 dr18192up 5′2CATATGACCTCGGCCTGTGAAG23′
4 dr18192down 5′2GAATTCAGCCTAAGGGTACGTTG23′
5 dr1819VF 5′2CGTCGCTCGGATGGATTCAGA23′
6 dr1771VR 5′2CAACCTCAAGGACATCACCGT23′
11213 　UV 辐射抗性 　将保存的菌液活化 24h ,转接
20ml TGY液体培养基中 ,长到适当时候用 PBS buffer
(pH710)洗涤 ,重悬 ,在 013JΠm2 ·s 的 UV 下照射 ,按剂
量取样 ,然后稀释涂板计数。
11214 　MMC(丝裂霉素 C) 抗性 　将保存的菌液活化
24h 后 ,取 115ml 菌液放于一新管中 ,加入 15μl 的 MMC
(终浓度 10μgΠml MMC) ,未加 MMC 余下的培养物进行
平板记数作对照。MMC处理的试管在 30 ℃摇床培养 ,
定时取样涂平板计数。
11215 　H2O2 抗性 　方法同 MMC 抗性 ,加入的 H2O2
浓度为 0103 %。
853 核　农　学　报 21 卷
2 　结果
211 　dr1771 和 dr1819 重组质粒的构建和验证
用表 2 中的引物 1 与 2、3 与 4 配对进行 PCR 反
应 ,分别扩增得到 113kb 的 dr1771 和 1kb 的 dr1819 的
片段 ; 再将其分别连接到 p GEM2T 载体中 ,构建成
pTDR1819 和 pTDR1771。用 EcoRI 消化 pTDR1771、
HindIII 消化 pTDR1819 ,采用凝胶回收 1kb 的 pTDR1771
和 1kb 的 pTDR1819 片段。同时将质粒 p KatAAD2 用
HindIII消化 ,凝胶回收 900bp 左右的 aad box 片段 ,再
将其与消化的 pTDR1819 连接、转化 JM109 ,在含 80μgΠ
ml aad 的 LB 平 板 上 进 行 筛 选 ; 所 得 质 粒 为
pTDR1819AAD。同样 ,将质粒 pUC4K用 EcoRI消化 ,回
收 116Kb 的 Km box 片段 , 与 pTDR1771 连接、转化
JM109 ,在含 Km 50μgΠml 的 LB 平板上筛选 ;所得质粒
为 pTDR1771Km ;分别用 HindIII 和 EcoRI 进行酶切验
证质粒 (见图 1、图 2) 。
图 1 　pTDR1819AAD HindIII酶切
Fig. 1 　HindIII digestion of plasmid pTDR1819AAD
1 :λDNA EcoR I and Hind III marker
2、3 : pTDR1819AAD HindIII 酶切
pTDR1819AAD digested with HindIII
图 2 　pTDR1771Km EcoRI酶切
Fig. 2 　EcoRI digestion of plasmid pTDR1771Km
1 :λDNA EcoR I and Hind III marker
2、3 : pTDR1771Km EcoRI 酶切
pTDR1771Km digested with EcoRI
212 　基因阻断突变株的筛选、纯化及验证
将以上酶切验证正确的质粒做模板 ,用上述克隆
引物进行 PCR 反应 ,反应条件只需将延伸时间延长
50s。pTDR1819AAd PCR 产物即约为 119Kb 左右 ,
pTDR1771Km 的 PCR 产物应约为 216Kb。将 PCR 产物
采用线性方法转化 Deinococcus1sp BR501 ,分别在 Km
8μgΠml 和 aad 350μgΠml 的 TGY固体平板上筛选。生长 出的单菌落再次在相应抗生素的 TGY液体中培养 24h以上进行纯化。然后提取基因组 DNA ,采用克隆引物(同 211 中的引物) 进行 PCR 验证后 ,根据同源双交换的原理 ,再次采用基因的上游序列作验证引物与克隆引物 (表 2 中 2 与 6 ,4 与 5) 配对进行 PCR 验证 (见图3、图 4) ,结果正确的分别命名为 △dr1819 和 △dr1771。
图 3 　△dr1819 验证引物的 PCR
Fig. 3 　PCR of △dr1819 with emendatory primers
1 :CK
2、3、5 :验证引物 PCR 扩增 dr1819AAD 片段
4 :λDNA EcoR I and Hind III marker
图 4 　△dr1771 验证引物的 PCR
Fig. 4 　PCR of △dr1771 with proofread primers
1 :CK
2 :验证引物 PCR 扩增 dr1771AAD 片段
3 :λDNA EcoR I and Hind III marker
953　4 期 极端耐辐射奇异球菌 Deinococcus sp1 BR501 切除修复系统突变株的构建及功能的鉴定
213 　双突变株△dr1819 △dr1771 的获得
在以上结果的基础上 ,以 △dr1771 为受体菌 ,按照
相同的线性转化方法 ,将 dr1819AAD 的 PCR 产物进行
转化 ,再用相同的方法筛选和验证 ,从而构建了同源双
交换的切除修复途径的双突变株 △dr1819 △dr1771。
214 　单双突变株的 UV 辐射抗性
UV辐射损伤了 DNA ,产生环丁烷嘧啶二聚体
(CPDs) 和嘧啶 (624) 嘧啶酮光生成物 ( 624PPs) 。对
Deinococcus sp1 BR501 的切除修复途径的单双突变株
进行了 UV 辐射抗性分析 ,结果见图 5。图 5 表明 ,阻
断依赖于 UV 损伤内切酶 UvsE的修复途径 ( △dr1819)
和阻断依赖于 UvrABC 的切除修复途径 ( △dr1771) 都
不能使其对 UV 辐射敏感 ,而同时阻断该两条途径后
( △dr1819 △dr1771) ,其对UV 辐射变得很敏感。可见 ,
该两条途径的任意缺失一条 ,都不足以使菌体对 UV
损伤致死 ;只有两条途径同时阻断 ,UV 引起的 DNA 损
伤才能对菌体起到致死作用。
图 5 　BR501 切除修复途径突变株的 UV 辐射生存曲线
Fig. 5 　UV survival curves for for Deinococcus sp .
BR501 mutants in excision repair pathway
215 　MMC抗性
丝裂霉素 C (MMC) 是 DNA 的交联损伤试剂。用
10μgΠml 的 MMC 处理 Deinococcus sp1 BR501 的切除修
复途径突变株和野生型后 ,结果 (图 6) 显示 :只有当同
时阻断依赖于 dr1819 和依赖于 dr1771 的切除修复途
径 ,菌体才对 MMC 表现得极为敏感 ,在 2min 以内 ,其
数量级就已降低了 10 - 6 。而任意缺失一条 ,与野生型
相比 ,突变株均没有明显的致死作用 ,所以 ,进一步确
认了阻断的两条途径可能就是突变株切除修复途径。
216 　H2O2 的抗性
H2O2 是引起细胞氧化损伤的试剂 ,用 H2O2 处理
Deinococcus sp1 BR501 的切除修复途径突变株和野生
型后 ,结果 (图 7) 表明 , △dr1819 和 △dr1771 的抗性与
图 6 　Deinococcus sp. BR501 切除修复途径突
变株对 MMC的生存曲线
Fig. 6 　MMC survival curves for Deinococcus sp .
BR501 mutants in excision repair pathway
野生型相比 ,没有明显降低生存率 (数据未列) 。同样 ,
△dr1819 △dr1771 与野生型相比 ,对 H2O2 的抗性也没
有明显差异 ;在 10min 内都没有降低一个数量级。这
表明阻断的两条途径对氧化试剂的损伤没有起到修复
作用 ,即氧化试剂的损伤是通过其他有还原能力的修
复途径进行修复的。
图 7 　Deinococcus sp. BR501 切除修复途径突变
株对 0. 03 %H2O2 的生存率
Fig. 7 　H2O2 (0103 %) survival rate for Deinococcus sp .
BR501 mutants in excision repair pathway
3 　讨论
本实验室从放射性污染的土壤中分离到 1 株极端
耐辐射菌株 BR501 ,经 16s rDNA 序列比对及 G + C 含
量测定以及表型特征分析鉴定为 Deinococcus sp1
BR501。该菌对γ辐射、UV 辐射和 MMC 等化学试剂
损伤的抗性远高于 Escherichia coli K12 ,而且与已知最
具辐射抗性的 Deinococcus radiodurans R1 相当[7 ] ,根据
Deinococcus radiodurans R1 基因组序列设计辐射相关基
因的引物 ( recA、pprI和 mutS 等) 能够扩增得到相同大
小的片段 , 我们推测该菌极有可能与 Deinococcus
063 核　农　学　报 21 卷
radiodurans是同种[7 ] 。
迄今 ,已分离了 10 余株 Deinococcus 属菌株[10 ,11 ] 。
分析 Deinococcus radiodurans R1 的基因组 ,存在大量功
能上与 DNA 修复系统有关的重复。比较其他生物 ,该
菌属高抗辐射的特性不能归因于某一种完美的 DNA
修复系统 ,而应视为一种高效复杂的修复网络 ;不同的
基因或者同一基因不同的功能 ,均是一种修复能力的
重叠。DNA 修复系统的研究还需要进一步阐明系统
间功能的重叠上来[12 ] 。
为了证实该菌中切除修复途径的功能 ,我们阻断
了两个关键基因 ———dr1819 和 dr1771 ;dr1819 是 UV 损
伤内切酶 UvsE的编码序列 ;dr1771 是 UV 损伤内切酶
UvrABC的大亚基的编码序列。我们采用插入抗生素
盒阻断基因的方法 ,构建了此两条途径的单、双阻断突
变株。对野生型和该突变株进行了 UV 辐射、化学试
剂损伤的抗性实验。结果表明 ,此两条途径对 DNA 损
伤的修复能力是独立的 ,随意阻断一条途径都还有另
外一条进行补偿 ,这对菌体抵抗外界环境的损伤具有
重大的意义 ,可能在生物进化的过程作为一种有意义
的优势而进化保留下来的。
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