全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032256204
用花粉管通道法导入Prd 29 A :DREB 1 A 融合基因
获得转基因小麦植株
梁高峰1 　押辉远1 ,2 　谷运红1 　宋笑明1 　秦广雍1
(1. 郑州大学河南省离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州　450052 ; 2. 洛阳师范学院生命科学系 ,河南 洛阳　471002)
摘 　要 :采用花粉管通道法遗传转化技术 ,将 Prd 29 A :DREB 1 A 融合基因导入小麦品种温麦 19。共处
理温麦 19 的小花 800 朵 ,获得 241 粒种子 ,结实率为 3019 % ,通过 PCR 检测和 GUS 组织化学分析 ,证明
外源的 Prd 29 A :DREB 1 A 融合基因已经整合到其中 5 个 T0 代植株的基因组中。
关键词 :小麦 ;花粉管通道法 ; Prd 29 A :DREB 1 A 融合基因
TRANSFER OF Prd 29 A :DREB1 A GENE INTO WHEAT MEDIATED
BY THE POLLEN2TUBE PATHWAY
LIANG Gao2feng1 　YA Hui2yuan1 ,2 　GU Yun2hong1 　SONG Xiao2ming1 　QIN Guang2yong1
(1. Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering , Zhengzhou University , Zhengzhou , Henan 450052 ;
2. Colleage of Life Sciences Luoyang Normal University , Luoyang , Henan 471022)
Abstract :The Prd 29 A :DREB 1 A gene was transfered into wheat WEN19 by pollen tube pathway. 800 florets of WEN19
were treated and 241 seeds were obtained. The fertility was 3019 % , and five transgenic wheat plants were checked out by
PCR and GUS histochemical analysis at T0 generation.
Key words :wheat ; pollen2tube pathway ; Prd 29 A :DREB 1 A
收稿日期 :2007207227 　接受日期 :2007210210
基金项目 :国家自然科学基金 (10505018)资助项目
作者简介 :梁高峰 (19802) ,男 ,河南周口人 ,在读研究生 ,主要从事离子束生物工程和近红外光谱分析。
通讯作者 :谷运红 (19762) ,女 ,河南新郑人 ,副教授 ,研究方向为小麦抗。E2mail : guyunhong @zzu. edu. cn
　　我国是全球人口最多的农业大国 ,在农业可持续
发展中 ,提高农业资源转化率是核心问题 ,其中水资源
又是关键[1 ,2 ] 。随着经济发展 ,我国的水资源匮乏变得
日趋严重 ,在保持作物较高产量的基础上 ,节约用水和
提高作物水分利用效率是节水农业生产的关键 ,而培
育抗旱节水的农作物品种将是一条重要的途径。
DREB (dehydration responsive element binding protein)
转录 因 子 ( 含 AP2ΠEREBP 结 构 域 ) 是 与 DRE
(dehydration responsive element) 顺式作用元件相结合 ,
调控对干旱、高盐、低温逆境应答相关基因表达的蛋白
质[3 ,4 ] 。试验发现 ,DREB1A 在 35S 启动子的驱动下强
烈表达 ,会产生转基因植物比野生型生长缓慢、株型变
小等不良农艺性状[5～7 ] , RD29A 是 DREB1 调控的目的
基因 ,在植物细胞缺水时能够大量表达 ,但 RD29A 在
细胞不缺水的时候并不表达[8 ,9 ] ,它是一个干旱诱导型
启动子。以 RD29A 启动子驱动 DREB1A 转录因子在
转基因小麦中的表达 ,可以大大减小因基因组成型表
达给转基因植株带来的不利影响。
花粉管通道转基因技术[10 ] 以 DNA 片段杂交假说
为理论基础 ,直接将带有目的性状的供体遗传物质 (总
DNA)或目的基因导入受体植株 ,创造大量的变异材
料 ,通过筛选获得具有目的性状的后代 ,达到改良品种
的目的。由于该技术简单、易行且不受受体植物种类
的限制 ,被越来越多的育种工作者所青睐 ,并在水
稻[11 ] 、棉花[12 ] 、小麦[13 ] 、大豆[14 ] 、玉米[15 ] 及蔬菜[16 ] 等
作物上得到了广泛应用 ,为农业生产培育出了抗虫、抗
病及其他优良性状的新品种及新品系 ,有力地推动了
植物分子育种的研究进程。但无论哪种转基因方法 ,
652　 核 农 学 报　2008 ,22 (3) :256～259Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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转化细胞与非转化细胞相比都是少数 ,两者存在竞争 ,
而异种细胞的竞争力很弱 ,因此 ,必须对转化细胞进行
筛选。另外 ,由于外源基因整合的表达机制也十分复
杂 ,故须对转基因植株外源基因的特性进行检测。本
文在成功克隆 rd29A 基因的启动子 Prd29A 与抗旱性
基因 DREB1A 进行融合并证实有特异表达的基础之
上 (另文叙述) ,进一步利用花粉管通道法转入小麦 ,并
对其进行研究。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　转基因供体　Prd29A :DREB1A 融合基因为本实验
室构建 ,该载体含有Prd29A 标记基因。受体材料为小麦
品种温麦 19 ,河南省温县农业科学研究所培育。
11112 　菌种和质粒 　大肠杆菌 DH5а、质粒 DNA :
pCAMBIArd :dreb 为本实验构建。
11113 　试剂 　PCR 引物购自上海生物工程公司 ,
ExTaq 购自 Takara 公司 , X2gluc 试剂购自美国 Amresco
公司。
112 　方法
11211 　表达载体的构建 　表达载体构建方案如图 1
所示 ,连接产物转化大肠杆菌工程菌株 DH5α后 ,从平
板上挑选抗卡那霉素的菌落进行 PCR 鉴定 ,证明融合
基因的拼接是正确的 , Prd29A 启动子与DREB1A 方向
符合基因表达的要求[17 ] 。
图 1 　表达载体构建示意图
Fig. 1 　The construction of the expression vector
11212 　质粒 DNA 的提取　质粒 DNA 的提取参照植物
基因工程[18 ]进行 ,并稀释至 250～300μgΠml 备用。
11213 　Prd29A :DREB1A 融合基因的导入　采用花粉
管通道法[19 ] 进行 Prd29A :DREB1A 融合基因的转导。
选取生长发育正常的温 19 小麦植株做受体 ,在抽穗期
图 2 　质粒 pCAMBIA 1301 的物理图谱
Fig. 2 　The map of the plasmid : pCAMBIA 1301
选择尚未开花的小麦穗 ,通过人工去除雄蕊并套袋 ,于
盛花期实施人工自花授粉 ,1 - 115h 打开杂交袋 ,而后
用微量注射器在每个小花的柱头上滴注含 Prd29A :
DREB1A 融合基因的溶液 10μl ,再套上杂交袋防止水
分蒸发 ,直到成熟收获。
11214 　小麦基因组 DNA 的提取　2006 年将收获的转
基因植株后代种子进行消毒、浸种后分别播种于实验
室盆钵 (100 粒) 和温县农业科学研究所大田内 (141
粒) ,当苗龄达到 3～5 叶时 ,分别取单株叶片按 SDS 碱
裂解法提取总 DNA ,得到的 DNA 溶液经紫外分光光度
计测得 :OD260ΠOD280 = 1189～1196
11215 　GUS 基因的组织化学鉴定 　GUS 染色方法按
Jefferson[20 ]等 (1987)的方法进行。染色完毕后脱色 :抽
去 Eppendorf 管中的染色液 ,加入 80 %乙醇 ,每小时换
一次脱色液 ,直至脱去叶片的绿色显白色为止。脱色
完毕 ,在解剖镜下观察 GUS 基因的表达情况。
11216 　PCR 分析　按 SDS 碱裂解法提取总 DNA ,所用
引物 1 : 5′2GATTTCAGCGTGTCCTCTCC23′; 引物 2 : 5′2
TGTGATAACATGGTGGAGCA23′。以提取的总 DNA 为
模板 ,加上引物、反应缓冲液、dNTP 和 Taq 酶后进行
PCR扩增。扩增体系 (50μl ) PCR 循环参数 : 94 ℃预变
性 5min , 94 ℃变性 30s , 55 ℃复性 20s , 50 ℃复性 20s ,
72 ℃延伸 30s ,33 个循环后 ,72 ℃再延伸 5min ,结束反
应。将扩增产物在 112 %琼脂糖凝胶上电泳 ,检测结
果并照相。
2 　结果与分析
2006 年 4 月在河南省温县农业科学研究所试验
田内用花粉管通道法共处理温 19 的小花 800 朵 ,获得
752　3 期 用花粉管通道法导入Prd 29A :DREB 1A 融合基因获得转基因小麦植株
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241 粒种子 ,结实率为 3019 %。将种子种下 ,在小麦生
长至 3～5 叶时 ,取单株叶片分别提取 DNA ,并进行下
列分析。
211 　转基因植株的组织化学鉴定
将 T0 代小麦的叶片进行 GUS 染色、脱色后 ,转基
因植株编号为 3、33、102、144、179 的叶片呈现不同程度
的蓝色 ,而未转基因的对照植株则为白色。这表明报
告基因 GUS 已经得到瞬间表达 ,使转基因小麦植株获
得了 GUS 活性 (图 3) 。
图 3 　转基因植株的组织化学鉴定
Fig. 3 　GUS histochemical analysis of the transgenic wheat
3、33、102、144、179 为转基因植株 ,CK为对照 (未转基因的受体植株)
3、33、102、144、179 are the positive plants and the CK is the untransformed plants
图 4 　转基因植株目的基因的 PCR 检测
Fig. 4 　The PCR detection of the positive plants
1 :DL2000 分子标尺 ; 2 :质粒 pCAMBIA 1301 对照 ;
3、4、5、6、7 分别为编号 3、33、102、144、179
的转基因植株的 PCR 产物
1 :DL2000 DNA marker ; 2 :the PCR production of the
plasmid pCAMBIA 1301 ; 3、4、5、6、7 are the PCR
production of the five positive plants respectively
212 　转基因植株的 PCR 分析
为了验证融合基因的导入与否 ,对种下的 241 个
材料 ,在长到 3～4 叶时 ,提取各个叶片全 DNA ,以质粒
PBI1301 和空白为对照进行 PCR、琼脂糖凝胶电泳分
析 ,结果如图 4 所示。
213 　转基因植株的获得 经组织化学鉴定 ,编号为 3、33、102、144、179 的转基因植株叶片显不同程度的蓝色 ,同时 ,进行 PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳分析表明 ,同样编号的植株扩增出了与质粒 1301 大小相同的条带。组织化学染色结果与电泳结果相吻合 ,从而证明这 5 株小麦得到转化 ,转化率为 2 %。这比文献报道的略低。因为花粉管通道
法进行小麦遗传转化与受体小麦基因型有着较大的关
系 ,不同的受体材料往往转化率有着较大的差异。
3 　讨论
311 　与基因枪法、农杆菌介导法等转基因方法相比 ,
花粉管通道法具有操作简单、无基因型限制、易于实现
大规模基因转化的特点 ,可以在任何开花植物和不同
物种之间实现基因的转移 ,省略了烦琐的组织培养过
程 ,从而避免了植物组织培养过程中可能会产生的植
物基因型的依赖以及各种无法预测的体细胞变异对后
代的不利影响。目前已有多例成功转化的报道[21 ] :如
将 Bt 基因导入棉花[22 ] 、玉米[15 ] 、水稻[23 ] ;将大麦黄矮
病毒的BYDV2GPV 株系缺失复制酶基因[24] 和几丁质酶
基因[25]导入小麦 ;王才林[26] 等将 bar 基因导入水稻 ,获
得了能稳定遗传的抗除草剂转基因植株。本研究再次
证明花粉管通道法是一种简便有效的转基因手段。
312 　在目前转基因抗旱育种中 ,大多数研究只关注了
852 核　农　学　报 22 卷
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目的基因的导入与否 ,而在实际的育种工作中则需要
更多地关注转基因后代[27 ]的抗旱性问题。
313 　本研究通过 PCR 检测和 GUS 组织化学分析 ,证
明外源的Prd29A :DREB1A 融合基因已经整合到 5 个
植株的基因组中 ,为今后的小麦抗旱育种打下了一定
的基础 ,但这只是初步的探索 ,下一步笔者将对由这 5
株小麦收获的 136 粒种子进行种植 ,以做进一步的抗
旱性鉴定。希望能得到抗旱性较强的小麦品种以适应
干旱地区小麦生产的需要。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国 21 世纪议程———中国 21 世纪人口环境与发展白皮书. 北
京 :中国环境出版社 ,1994 ,77～86
[ 2 ] 　邹　琦. 植物对水分胁迫的响应及其在旱作农业和抗旱育种中
的应用. 吴 平 ,陈昆松主编. 植物分子生理学进展. 杭州 :浙江大
学出版社 ,2000 ,207～215
[ 3 ] 　Yamaguchi Shinozaki K, Shinozaki K. A novel cis2acting element in an
Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought , low2
temperature or hight2salt stress. Plant Cell , 1994 ,6 :251～264
[ 4 ] 　Joseph G, Dubouzet ,et al . OsDREB genes in rice , Oryza sativa L. ,
encode transcription activators that function in drought , hight2salt and
cold responsive gene expression. The Plant , 2003 ,33 ,751～763
[ 5 ] 　Jaglo2Ottosen K R , Gilmour SJ , et al . Arabidopsis CBF1over expression
induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science , 1998 ,
280 : 104～106
[ 6 ] 　Mie Kasuga ,Qiang Liu , et al . Improving plant drought ,salt ,and freezing
tolerance by gene transfer of a single stress2inducible transcription factor.
Nature Biotechnology , 1999 ,17 :287～291
[ 7 ] 　Kazuko Yamaguchi Shinozaki , Mie Kasugua , et al . Biological
mechanisms of drought stress response. J IRCAS Working Report , 2002.
1～8
[ 8 ] 　Liming xiong , Karen S Schumaker , Jiankang Zhu. Cell signaling during
cold , drought and salt stress. The Plant Cell , 2002 ,14 :166～183
[ 9 ] 　江香梅 ,黄敏仁 ,王明麻. 植物抗盐碱、耐干旱基因工程研究进
展. 南京林业大学学报 (自然科学版) ,2001 ,25 (5) :57～62
[10 ] 　Zhou G Y, Wen J , et al . Introduction of exogenous DNA into cotton
embryos. Methods in Enzymology , 1983 ,101 : 433～488
[ 11 ] 　Rathmore K S , Chowdhury V K, Hodges T K. Use of bar as a selectable
marker gene and for the production of herbicide resistant rice plants from
protoplasts. Plant Mol Biol , 1993 , 21 : 871～884
[12 ] 　倪万潮 ,张震林 ,郭三堆. 转基因抗虫棉的培育. 中国农业科学 ,
1998 ,31 (2) :8～13
[13 ] 　刘云英 ,周　　 ,李维琪. 新疆大赖草 DNA 导入小麦后代种子醇
溶蛋白的分析. 新疆农业科学 ,1996 , (3) :101～104
[14 ] 　崔　岩 , 杨庆凯 , 周思军. 利用花粉管通道技术导入大豆抗病虫
目的基因. 生物技术 ,2002 (6) : 5～7
[15 ] 　丁群星 ,谢友菊 ,等. 用子房注射法将 Bt 毒蛋白基因导入玉米的
研究. 中国科学 (B 辑) , 1993 , 23 (7) : 707～713
[16 ] 　田长恩 ,王正询 ,等. 抗菌肽 D 基因导入番茄及转基因植株的鉴
定. 遗传 ,2000 ,22 (2) 86～89
[17 ] 　押辉远 ,秦广雍 ,霍裕平. Prd29A 及 DREB1A 的克隆和干旱诱导
型植物表达载体的构建与鉴定. 植物生理学通讯 ,2005 ,41 (3) :
371～375
[18 ] 　王关林 ,方宏筠 ,主编. 植物基因工程. 北京 :科学出版社 ,2002 ,
734～736
[19 ] 　龚蓁蓁 ,沈慰芳 ,等. 授粉后外源 DNA 导入植物技术———DNA 通
过花粉管通道进入胚囊. 中国科学 (B 辑) ,1988 , (6) : 611～614
[20 ] 　Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants : the Gus gene fusion
system. Plant Mol Biol Rep , 1987 , 5 :387～405
[21 ] 　朱生伟 ,黄国存 ,孙敬三. 外源 DNA 直接导入受体植物的研究进
展. 植物学通报 , 2000 , 17 (1) : 11～16
[22 ] 　谢道昕 ,范云六 ,等. 苏云金芽孢杆菌 ( B acillus thuringiensis) 杀虫
晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株 . 中国科学 (B 辑) ,
1991 , 21 (4) : 367～373
[23 ] 　谢道昕 ,范云六 ,倪丕冲. 苏云金芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽
培水稻品种中花 11 号获得转基因植株. 中国科学 (B 辑) , 1991 ,
21 (8) : 830～834
[24 ] 　吴茂森 ,田苗英 ,陈彩层 ,等. 通过花粉管途径将 BYDV2GPV 株系
缺失复制酶基因导入小麦. 农业生物技术学报 , 2000 , 8 (2) : 125
～127
[25 ] 　刘伟华 ,李文雄 ,等. 菜豆几丁质酶基因转化小麦的研究. 东北
农业大学学报 , 2001 , 32 (2) :111～116
[26 ] 　王才林 , 赵　凌 , 宗寿余 ,等 ,用花粉管通道法将 bar 基因导入水
稻获得可遗传的转基因植株. 江苏农业学报 , 2002 ,18 (3) :129～
133
[27 ] 　崔海瑞 ,卢美贞 ,等 , 转基因抗虫水稻矮杆突变体的品质性状分
析. 核农学报 ,2005 ,5 :336～339
952Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (3) :256～259
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net