全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032177204
油菜新雄性不育系 Xin1 的不育性与恢复性
王桂荣　林宝刚　邵　奇　张　龙　李小白　张明龙
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :本文比较了新不育系 Xin1 CMS (cytoplsmic male sterility) 与我国主要的细胞质雄性不育类型 Pol
(Polima) CMS、Shan2A CMS、Ogu CMS 的花器形态 , F1 代育性情况及其恢保关系 ,研究分析了 orf224 基因
Xin1 CMS 与 Pol CMS 等在线粒体基因组上的差异。结果表明新不育系 Xin1 CMS 花器形态与 Pol CMS、
Shan2A CMS 和 Ogu CMS 的花器有显著差别。与 RF01 杂交 ,得到有正常结构的花器 ,花粉生活力为
9018 %。所试 26 个测交材料中 ,有 13 对 (50 %) 测交 F1 表现出育性反应不同 ,在 14 个 Pol CMS 和
Shan2A CMS 的保持系测交 Xin1 CMS 的 F1 中 ,6 个 Pol CMS 和 Shan2A CMS 的恢复系测交 Xin1 CMS 的 F1
中 ,有 5 个材料能保持 Xin1 CMS ,有 1 个表现为半不育 ,1 个材料能半恢复 Xin1 mtRNA CMS。测交结果
表明 Xin1 CMS 与 Pol 和 Shan2A 的恢保关系不同。对新不育系 Xin1、Polima 和 Ogu 的 orf224 基因的扩增
结果表明 Xin1 有 1 条与 Pol 相同的谱带 ,缺失 Pol 的另一条谱带 ;说明 Xin1 CMS 是不同于 Pol CMS 的新
不育系。
关键词 :油菜细胞质雄性不育 ;花器形态 ;恢保关系 ;线粒体 DNA ; orf224 基因
MALE2STERILITY AND FERTILITY OF NEW RAPESEED CMS LINE Xin1
WANG Gui2rong 　LIN Bao2gang 　SHAO Qi 　ZHANGLong 　Li Xiao2bia 　ZHANG Ming2long
( Institute of Nuclear2Agricultural Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029)
Abstract :The research results indicated that the floral organ of Xin1 CMS was different remarkably from the Pol ( Polima) ,
Shan2A and Ogu CMS. The floral organ of normal structure was gained through interspecies hybridization between Xin1 CMS
and RF01 in B . napus . The rate of viable pollen grains was 9018 %. It was identical with normal pollen grain by Scan of
SEM. The fertility of F1 that gained by the hybridization with 13 varieties as male parents was different among 4 CMS lines.
The F1 ,which gained by the hybridization between Xin1 CMS and 14 varieties as male parents , can maintain Pol CMS and
Shan2A CMS. The F1 that gained by the hybridization between Xin1 CMS and 6 varieties as male parents can restore Pol CMS
and Shan2A CMS. Mitochondrial genome of Pol , Ogu and News lines Xin1 (induced by radiation) were amplified with primer
which was designed according to gene orf224. The results show Xin1 CMS has a amplified band which Pol has , and lack a
band which Pol has. Xin1 is a new cytoplasmic male sterile line , which is different from Pol CMS.
Key words : rapeseed cytoplasmic male sterile ( CMS) ; floral organ morphology ; restoring & maintaining relationship ;
mitochondrial DNA(mtDNA) ; gene orf224
收稿日期 :2005203204
基金项目 :浙江省科技厅重点攻关课题“杂交油菜育种”项目 ( G20010280)
作者简介 :王桂荣 (19822) ,女 ,山东聊城人 ,硕士研究生 ,主要从事作物诱变与分子育种研究。林宝刚和张明龙为通讯作者 , Email :zml @zju. edu.
cn
　　新胞质不育类型的创新和研究对丰富我国油菜不
育胞质的资源具有重大的理论和实践意义。油菜细胞
质雄性不育杂种优势的利用主要是依靠雄性不育系与
其相应的恢复系配制强优势组合来达到增产目的[1 ] 。
771　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :177～180Journal of Nuclear Agricultural Sciences
在育种应用上恢复与保持关系是评价不育类型最重要
的指标之一[2 ,3 ] 。CMS 的不育机理至今未得到明确的
阐述 ,多数结果表明 CMS 的决定因素在线粒体基因组
上[4 ] 。油菜 Polima 的线粒体基因组 (mtDNA) 含有 atp6
基因的区段是 Pol CMS、保持系和恢复系间表现差异的
唯一区段 ,该基因片断与雄性不育有关[4 ,5 ] 。orf224 基
因和 atp6 基因共转录[6 ] 。含有 orf224 基因 415kb 的
DNA 片断在 CMS 中缺失 ,在 nap CMS 中与 orf224 基因
相似的 orf222 基因与 atp6 连锁。含有 orf222 基因的
片断大小是 5kb[7 ] 。本文通过分析比较新不育系 Xin1
CMS与我国主要的细胞质雄性不育类型的花器形态、
F1 代育性情况及其恢保关系 , orf224 基因通过辐照产
生的新不育系 Xin1 与 Pol CMS 的差异分析 ,研究了
Xin1 CMS 特性 ,为正在选育杂交油菜的新胞质不育类
型提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　试验材料
供试材料为甘蓝型油菜细胞质雄性不育系 Pol
(Polima) 、Shan2A、Ogu、Xin1、和保持系 Shan2B。其中
Shan2A 和 Shan2B 由陕西省杂交油菜研究中心李殿荣
研究员提供 ;Pol 由江苏农业科学院经济作物研究所油
菜研究室提供 ,Ogu CMS 由西南农业大学农业生物学
院李加纳提供 ;Xin1 由瑞典农业大学 Glimelius 教授采
取细胞工程手段创造并提供。4 个细胞质雄性不育系
与同一种保持系 MF01 连续回交 5 代 ,植株遗传性状
稳定。
112 　恢保关系测定
从全国各地收集及本所油菜研究室提供的 26 个
来源不同、具有恢保能力的品种 (系) 用于恢保关系测
定。各不育材料的雄性不育性调查标准参照杨光圣
等[8 ]和柯桂兰[9 ]的方法 ,即取同一父本单株花粉同时
对 Xin1 CMS、Pol CMS、Shan2A CMS 和 Ogu CMS 授粉 ,
每个不育系授粉 5 个花序 ,次年每组合测交 F1 种植 5
行。在开花期进行育性调查、可育株的花粉活性鉴定。
113 　orf224 在 mtDNA 中扩增的差异性分析
Tag 酶、dNTPs 和 DNA 分子量参照物 (marker) 购自
上海生工公司 ;引物由上海 Sangon 生物技术公司合
成。mtDNA 的提取及引物设计参照文献[10 ,11 ] 的方法。
据已发表的 orf224 基因的序列设计 2 条引物 ,上游引
物 : 5’2GCCTCAACTGGATAAATTC23 ; 下 游 引 物 : 5’2
CAAGGATCTCGTTCACCT23’;PCR 反应及琼脂糖电泳分
离采用 30μl 的反应体系 : 10 ×PCRbuffer3μl , MgCl2
(15mmolΠL ) 3μl。2 条引物 ( 20ngΠμl ) 各 1ul , dNTP
(215mmolΠL) 3μl , Taq 酶 (2UΠμl) 1μl ,模板 mtDNA (10ngΠ
μl) 2μl ,超纯水 17μl。PCR 反应程序包括 : 94 ℃变性
5min 后进行 40 个循环的扩增反应。每个循环包括
94 ℃,45s ;56 ℃,60s ;72 ℃,90s。最后在 72 ℃下继续延
伸 10min ,4 ℃保存。扩增后的产物加入含有溴酚兰的
上样缓冲液 ,用 112 %的琼脂糖凝胶 (含 EB015μgΠmL)
在 100V 电压上进行电泳分离 ,检测扩增产物的多态
性。紫外灯下观察并用成像仪器拍照。
2 　结果与分析
211 　Xin1 的花器官形态特征
细胞质雄性不育系的花器官形态特征是评价不育
系的最重要的指标之一。Xin1 CMS 与我国主要的细
胞质雄性不育类型 Pol CMS、Shan2A、Ogu CMS 的花器
形态测定结果 (表 1)表明 :4 个细胞质雄性不育系的花
瓣都较小 ,但 Ogu CMS 比其他 3 个略大 ,且没有皱缩 ;
Shan2A CMS 和 Pol CMS 半皱缩 ,而 Xin1 CMS 的花瓣很
小 ,皱缩的较严重。雌蕊均发育正常 ,长度与可育株无
差异 ,Xin1 CMS 雌蕊的顶部有所弯曲 ,但都能够正常
授粉。不可育株与可育株雄蕊长呈显著差异。其中
Xin1 CMS 的雄蕊有 4 个或者 5 个完全退化 ,有的 6 个
都退化 ,剩下的 1 个或者 2 个也变为叶片状。Ogu CMS
的花药比其他不育系略长 ,呈淡黄色 ,但无花粉 ; Pol
CMS和 Shan2A CMS 花药较小 ,黄色 ,开花时温度 ≤
10 ℃时有大量花粉出现。由表 1 可以看出 , Shan2A
CMS和 Pol CMS 与正常可育株的雌雄蕊比 ( ♀Π♂) 都
呈极显著差异。Ogu CMS 与可育株的 ♀Π♂也呈显著
差异。Xin1CMS 雄蕊心皮化 ,或者消失 ,没法测量。4
个不育系的花瓣长和 4 强雄蕊的长与可育株均呈极显
著差异 ,而 2 弱雄蕊长只有 Shan2A CMS 和 Pol CMS 与
可育株呈极显著差异。花药长、花萼长和雌蕊长都与
可育株无显著差异。Xin1 CMS 的花器形态为雄蕊退
化或者花药心皮化 ,与其他不育系的花器形态比较有
显著差异。
212 　花粉活力检测
用 RF01 与 Xin1 CMS 连续回交 4 代 ,在花期 ,对
BCF4 及其恢复系 RF01 群体进行 3 次花粉生活力测
定 ,每次随机选 10 株 ,每株 10 朵花 ,测定结果见表 2 ,
恢复系有生活力的花粉为 9418 % ,BCF4 有生活力花粉
为 9018 % ,与恢复系相近。表明 RF01 对 Xin1CMS 有
完全的恢复能力。花粉粒电镜扫描与正常花粉粒无
差异。
871 核　农　学　报 20 卷
表 1 　4 个细胞质雄性不育系及其保持系的花器形态比较
Table 1 　The comparison of floral organs morphology of four cytoplasmic male2sterile lines and their maintainer
CMS 材料
CMS
material
花瓣 petal 雄蕊 stamen
长度
length
宽度
width
四强雄蕊长
length of four stronger stamen
二弱雄蕊长
length of two weaker stamen
花药长
length of anther
雌蕊长
length of pistil
花萼长
length of calix
♀Π♂
Polima 110233 014533 014633 013833 0118 1107 0164 213233
Shan2A 111233 0168 3 015133 014233 0120 1109 0164 211433
Ogu 112533 0183 016133 0150 3 0129 1103 0168 1169 3
Xin 1 016933 013233 - 　 - 　 - 1101 0168 - 　
保持系
maintainer
1147 0189 1116 0197 0131 1110 0175 0195
表 2 　Xin1 BCF4 和其恢复系 RF01 的花粉生活力鉴定
Table 2 　Pollen vitality test of Xin1 BCF4 and
their restorer RF01
材料
名称
name of
material
观察花
粉总数
total No. of
pollen grains
有活力花粉
viable pollen
无活力花粉
nonviable pollen
粒数
No1of pollen
grains
占总数
percent ( %)
粒数
No1of pollen
grains
百分率
percent ( %)
Xin1 BCF4 168 154 9117 14 813
135 120 8819 15 1111
159 146 9118 13 812
平均值
average 154 140 9018 14 912
RF01 162 156 9613 6 317
157 148 9413 9 517
178 167 9318 11 612
平均值
average
166 157 9418 9 512
213 　不同细胞质雄性不育恢保关系比较
4 种不同细胞质雄性不育系与不同来源的品种杂
交 F1 的育性表现列于表 3 ,在所有测交的 26 个材料
中 ,没有发现能使 Ogu 恢复育性的 ,有的测交材料能使
雌雄比接近于正常可育株 ,但没有花粉。Shan2A CMS
和 Pol CMS 恢保关系完全一致 , Xin1 CMS 和 Pol CMS
的差异主要表现在测交材料 407 等 11 个品种 (系) 上 ,
407、417、427、496 和 450 能完全保持 Xin1 CMS ,不育株
率都达到 100 % ,而对 Shan2A CMS 和 Pol CMS 是完全
恢复的。442、447、452 和 467 测交 Pol CMS 的 F1 育性
表现为半不育 ,而这 4 种材料对 Xin1 CMS 具有完全的
保持能力。值得一提的是 ,测交材料 512 是 Pol CMS
和 Shan2A 很好的保持系 ,而对 Xin1 CMS 具有半恢复
能力 ,这对于 Xin1 CMS 应用于生产提供了可能。再
者 ,488 对 Xin1CMS 具有半恢复能力 ,而对 Pol CMS 具
有完全恢复能力。
其中有 13 对测交 F1 表现出育性反应不同 ,占测
交材料总数的 50 %。在 14 个 Pol CMS 和 Shan2A CMS
保持系测交 Xin1 CMS 的 F1 中 ,有 1 个材料能半恢复
Xin1 CMS , 6 个 Pol CMS 和 Shan2A CMS 恢复系测交
Xin1 F1 中 ,有 5 个材料能保持 Xin1 CMS ,有 1 个表现
为半不育。
上述结果表明 ,Pol CMS、Ogu CMS 和 Xin1 CMS 的
恢保关系不同 ,说明 Xin1 CMS 细胞质是不同于 Pol
CMS、Shan2A CMS、Ogu CMS 的新不育细胞质。
表 3 　Shan2A CMS、Pol CMS、Ogu CMS和 Xin1 CMS
的恢保关系比较
Table 3 　Comparison of restore2and2maintain relationship of
Shan2A CMS ,Pol CMS ,Ogu CMS and Xin1 CMS
测交材料
testing
material
测交 F1 不育株率 ( %)
ratio of sterile plant in tested F1
测交 F1 育性归类
fertility of tested F1
Polima Shan2A Ogu Xin1 Polima Shan2A Ogu Xin1
407 0 0 100 100 f f s s
412 9814 100 100 100 s s s s
417 0 0 100 100 f f s s
427 0 0 100 100 f f s s
432 64 56 100 65 ps ps s ps
437 9316 100 100 100 s s s s
442 57 46 100 100 ps ps s s
447 53 61 100 100 ps ps s s
452 44 32 100 100 ps ps s s
462 50 56 100 73 ps ps s ps
467 67 49 100 100 ps ps s s
488 0 0 100 33 f f s ps
496 0 0 100 100 f f s s
500 0 0 100 100 f f s s
512 100 100 100 3817 s s s ps
注 :F :全恢复 ;ps : 半恢复 ;s :不育。材料 422、457、472、476、480、484、492、
504、508、515 和 518 的测交 F1 不育株均为 100 % , 测交 F1 育性归类均为
不育。
Note :F : fertility restoration ; ps : partial fertility restoration ; s : sterility. Sterlile
ratios in F1 of materials 422、457、472、476、480、484、492、504、508、515 and 518
were 100 % , the fertility in test2cross was all classified sterility.
214 　orf224 在各不育系及其保持系 mtDNA 中扩增的
差异性分析
试验所提取的 mtDNA 经紫外检测 ,测定其在 230、
260 和 280nm 处的紫外吸收值 ,OD260ΠOD280 值在 117～
118 ,OD260ΠOD230 > 210 ,符合 PCR 扩增的样品质量要求。
971　3 期 油菜新雄性不育系 Xin1 的不育性与恢复性
用 2 条引物对 Xin1、Polima、及其共同的保持系 Shan2B
的 mtDNA 进行 PCR 扩增 ,结果如图 1 ,Pol CMS 和保持
系 Shan2B 有 1 条共同的 695bp 大小的条带 ,而 Xin1 缺
失这条带。Xin1 和 Pol CMS 有区别于保持系的 680bp
左右的特异条带 ,因此这条带就是基因 orf224。
图 1 　orf224 基因在 2 个 CMS和保持系 Shan2B 的线
粒体基因组中的电泳图谱
Fig. 1 　Profile of gene orf224 in mitochondrial genome
of 2 CMS lines and their maintainer Shan2B
1、2、3、4 分别表示 Xin1、Polima、Shan2B 和 Marker。
1、2、3and 4 represents Xin1、Polima、Shan2B and Marker , respectively.
3 　讨论
311 　对新细胞质雄性不育系 Xin1 的探讨
徐义俊等曾将不育系花器结构分为 6 种类型 ,即
闭锁不育型、败雄不育型、功能不育型、部位不育型、败
药不育型和返祖不育型[12 ] 。在 Xin1 CMS 连续 5 代杂
交过程中 ,全部植株花器结构均表现出雄性不育的特
征 ,具体为雄蕊退化或者花药心皮化 ,应属于败雄不育
型。BCF4 及其恢复系 RF01 的花粉生活力相近 ,花粉
粒电镜扫描与正常花粉粒一致 ,表明 RF01 对 Xin1
CMS 有完全的恢复能力。Xin1 CMS 与 Pol CMS 和
Shan2A CMS 有不同的恢保关系。据已发表的 orf224
基因的序列设计引物 ,对 Polima、Ogu 和新不育系 Xin1
线粒体基因组进行 PCR 扩增的结果表明 Xin1 是不同
于 Pol CMS 的新不育系[14 ] 。对其不育分子机理 ,生物
学、遗传特征研究及其在油菜杂种优势利用研究中的
应用前景 ,有待更深入研究。
312 　创造新细胞质雄性不育类型的理论及其实践意义
在我国已被审定的杂交油菜品种中 ,90 %以上是
细胞质雄性不育三系油菜杂交种[2 ] 。大量油菜杂交种
的审定与推广应用使我国的油菜产量上了一个新台
阶。目前的 CMS 都是花粉败育 ,且对温度表现出不同
程度的敏感性 :大部份表现为低温敏感 ,开花时遇 ≤
10 ℃低温时 ,不育系会出现微量花粉 ,从而影响了杂交
种纯度[15 ,16] 。如果寻找到控制雄蕊发育的基因 ,培育没
有雄蕊或者雄蕊心皮化的新细胞质雄性不育类型 ,无疑
是解决杂交种纯度的一个好方法。结合已知的不育类
型的机理 ,拓建和加强新的不育胞质的研究 ,为揭开细
胞质不育机理、丰富我国油菜不育胞质的资源 ,对推动
我国杂交油菜生产的发展具有很大的理论和实践意义。
致谢 :感谢瑞典农业大学 Glimelius 教授提供 Xin1 不
育系。
参考文献 :
[ 1 ] 　Fu Tingdong. Production and research of rapeseed in the People Republic
of China. Eucarpia Cruciferae News2letter ,1981 , (6) :6～7
[ 2 ] 　傅廷栋. 杂交油菜的育种与利用. 武汉 :湖北科技出版社 ,1995 , 5
(2) :73
[ 3 ] 　杨光圣 ,傅廷栋. 油菜细胞质雄性不育恢保关系的研究. 作物学
报 ,1991 , (3) :151～156
[ 4 ] 　Wang H M , Ketela T , Keller W A , Gleddie S C ,Brown G G. Genetic
correlation of the orf224Πatp6 gene region with Polima CMS in Brassica
somatic hybrids. Plant Mol Biol ,1995 ,27 :801～807
[ 5 ] 　L’homme Y, Brown G G. Organizational differences between
cytoplasmic male2sterility and male2fertile Brassica mitochondrial genomes
are confined to a single transposed locus. Nucleic Acids Res ,1993 ,21 :
1903～1909
[ 6 ] 　Singh M , Brown G G. Characterization of expression of a mitochondrial
gene region associated with the Brassica‘polima’CMS: developmental
influences. Curr Genet ,1993 ,24 :316～322
[ 7 ] 　Yvan L’Homme , Richard J . Stahl , Xiu2Qing Li , et al . Brassica nap
cytoplasmic male sterility is associated orf224 gene. Curr Genet ,1997 ,
31 :325～335
[ 8 ] 　杨光圣. 甘蓝型油菜 ( B . napus L)雄性不育细胞质的初步分类. 华
中农业大学油菜研究年报 ,1988 :13～14
[ 9 ] 　柯桂兰 ,张鲁刚. 大白菜异源胞质雄性不育恢保关系的研究. 西
北农业学报 ,1993 ,2 (1) : 15～20
[10 ] 　Kemble R J . A rapid simple single leaf nucleic acid assay for determining
the cytoplasmic organelle complement of rapeseed and related Brassica
species. Theor Appl Genet ,1987 ,73 :364～370
[11 ] 　Xie Weiwu , Kang Chuanhong , Wang Bin. Molecular characterization of
a new type of cytoplasmic male sterile sugar beet . Science in China (Series
C) . 1996 ,39 (1) :53～62
[12 ] 　刘后利. 油菜的遗传和育种. 上海 :科学技术出版社 ,1985
[13 ] 　Handa H , Gualberto J M , Grienenberger J M. Characterization of the
mitochondrial orfB gene and its derivative , orf224 , a chimeric open
reading frame frame specific to one mitochodnrial genome of the“polima”
male2sterile cytoplasmic in rapeseed ( Brassica napus L. ) . Curr Genet ,
1995 ,28 :546～552
[14 ] 　林宝刚 ,张明龙 ,王桂荣. 辐照诱导的新雄性不育系过氧化物酶
和脂酶同工酶分析. 核农学报 ,2005 (4) :304～306
[15 ] 　Fan Z , Stefansson B R. Influence of temperature on sterility of two
cytoplasmic male2sterility systems in rape ( Brassica napus L) . Can J
Plant Sci ,1986 ,66 :221～227
[16 ] 　赵坚义 , 陈曼玲 , 张冬青 ,等. 甘蓝型油菜波里马雄性不育的感
温性. 中国油料 ,1996 ,18 (4) :1～5
081 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (3) :177～180