全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032215203
苦瓜 ISSR 扩增条件优化的研究
宣　朴1 ,2 　邓　婧3 　陈　新3 　尹春蓉2 　陈　放1
(11 四川大学生命科学学院 ,四川 成都　610064 ;21 四川省农科院生物技术核技术研究所 ,四川 成都　610066 ;
31 成都中医药大学 ,四川 成都　610075)
摘 　要 :本文对 ISSR2PCR 扩增苦瓜基因组 DNA 的主要影响因子进行了筛选和分析。试验结果表明 ,25μl
的反应体系中采用 20～30ng 的模板 DNA、1μmolΠL ISSR 引物、1U Tag DNA 聚合酶 ,以及 48 ℃～52 ℃的复
性温度为苦瓜 ISSR2PCR 扩增条件的最佳选择。苦瓜 ISSR2PCR 扩增条件的优化为进行苦瓜种群间遗传
分化的研究奠定了基础。
关键词 :苦瓜 ; ISSR ;影响因子 ;PCR ;反应体系
OPTIMIZATION OF ISSR2PCR AMPLIFICATION IN Momoradica charanita L.
XUAN Pu1 ,2 　DENGJing3 　CHEN Xin3 　YIN Chun2rong2 　CHEN Fang1
(11Life Science College , Sichuan University , Chengdu , Sichuan 　610064 ;
21 Insititute of Biological and Nuclear Technology , Sichuan Academy of Agricultural Sciences , Chengdu , Sichuan 　610066 ;
31 University of Traditional Chinese Medicine in Chengdu , Chengdu , Sichuan 　610075)
Abstract : The factors influencing ISSR2PCR experiments to analyze the genetic divergence in bitter melon ( Momoradica
charantia L. ) were investigated. Comparative experiments on the concentrations of template DNA , ISSR primer , Taq DNA
polymerase and the annealing temperature were carried out . The results showed that the optimum reaction condition of ISSR
experiment was 20～30ng DNA template , 1μmolΠL ISSR primer , 1U Tag DNA polymerase and annealing temperature of 48 ℃
～52 ℃ in each reaction system of 25μl , which set up a basis for the study of genetic divergence among bitter melon
populations.
Key words : Momoradica charantia L. ; ISSR ;influencing factors ;PCR ;reaction system
收稿日期 :2005207230
作者简介 :宣朴 (19642) ,男 ,江苏南通人 ,研究员 ,研究方向为植物胚胎发育与生殖工程学。Tel :028 8450324 ; Email :xuanpu64 @sina. com。
陈放为通讯作者。
　　ISSR 标记 ( Inter Simple Sequence Repeat , ISSR)技术
主要是以一条与微卫星 (SSRs) 序列互补并在 3’或 5’
端含有 2～4 个随机碱基的 DNA 序列为引物 ,对基因
组 DNA 进行 PCR 扩增的一种新型分子标记技术[1 ] 。
这项技术适用于任何在基因组中分布有足够数量 SSR
单元的物种 ,对目前尚不清楚基因组序列的物种尤为
有用[2 ,3 ] 。与 RAPD 技术相比 , ISSR 标记多态性水平更
高、实验稳定性更好 ,且供试材料 DNA 量少、成本低 ,
目前已广泛应用于玉米、油菜、小麦、水稻、葡萄、红薯、
小米、柑橘等植物的遗传多样性或品种鉴定等研究 ,但
在苦瓜品种鉴定或种群遗传学研究上的应用却鲜见报
道。本试验针对苦瓜 ISSR2PCR 反应体系中的 4 个主
要影响因子进行了相关的条件优化研究 ,以确保建立
一个适合苦瓜的 ISSR2PCR 反应体系 ,使 ISSR 分析结
果的可靠性和重复性能满足苦瓜种群间遗传分化研究
的要求。
1 　材料与方法
111 　供试材料
供试品种有 :英引苦瓜、滨城苦瓜 (由广东省农业
科学院蔬菜研究所提供) ;32327 (由四川省农业科学院
512　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :215～217Journal of Nuclear Agricultural Sciences
园艺研究所提供) ;长苦瓜、长白苦瓜、阳朔苦瓜、白苦
瓜、小白苦瓜、华绿王苦瓜、蓝山大白苦瓜、光泽长条苦
瓜、中苦瓜、青苦瓜、内江苦瓜 (由中国农业科学院蔬菜
花卉研究所提供) ;种都 1 号、种都 2 号、种都 4 号、台
湾翠玉香、刺菠萝苦瓜、刺皇苦瓜、华绿王苦瓜、青丰苦
瓜、二青白苦瓜和新一代青苦瓜 (四川省农科院种子市
场购得) 。苦瓜种子经温汤浸泡 4h 后播于温室沙床 ,
常规管理 ;长成植株后 ,取叶片作试验材料。
112 　DNA的提取
利用 CTAB 法提取苦瓜 DNA[4 ] ,并略加改进。
113 　ISSR扩增体系
试验流程参照 Tsumura 的扩增反应体系[5 ] ,反应
体系总体积为 25μl。其中 dNTPs 和 Taq DNA 聚合酶为
TaKaRa 公司产品 , ISSR 引物为自行设计并委托赛百盛
公司合成。扩增反应在 Bio2RAD 公司的 Icyclear
Thermal Cyclear 上完成。
114 　ISSR扩增反应程序
94 ℃预变性 5min ;94 ℃变性 30s ,40 ℃～64 ℃复性
45s ,72 ℃延伸 2min ,循环 40 次 ;然后 72 ℃延伸 5min ;最
后置于 4 ℃待电泳检测。
115 　扩增产物检测
扩增产物在 114 %琼脂糖凝胶 (每 100ml 加入 5μl
GoldViewTM DNA 染料) 上进行电泳 ,在 Bio2RAD 公司的
Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统观察并成像分析。
2 　结果与分析
211 　模板 DNA浓度对 ISSR2PCR的影响
PCR 反应中对模板 DNA 浓度要求的范围通常较
宽 ,但最佳的 DNA 模板浓度范围取决于研究的物种、
类群以及 DNA 模板纯度。本研究对不同量的模板
DNA 分别进行了 PCR 扩增 ,发现 20～30ng 的模板
DNA 浓度用于苦瓜 ISSR2PCR 扩增为最佳选择 (图 1) 。
212 　ISSR引物浓度对 ISSR2PCR的影响
引物浓度会对 PCR 扩增的带型产生明显的影响。
浓度过低不能扩增 ,浓度太高会产生新的位点[4 ] 。为
减少非特异性扩增 ,加强重复性 ,本实验对浓度为
015、110、115、210μmolΠL 的 ISSR 引物分别进行了扩增。
试验结果发现 ,在确保产量的前提下 ,采用 110μmolΠL
的浓度 ,效果良好 ,结果稳定 (图 2)
213 　Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR2PCR的影响
在 PCR 反应中 ,不同商家和不同批次的 Taq DNA
聚合酶的用量各异 ,它是影响 PCR 扩增的一个重要因
子。Taq DNA 聚合酶的浓度太高会产生非特异性扩
图 1 　不同模板 DNA 的 ISSR2PCR 电泳结果
M:λEcoT14 Ⅰ;1～5 :20、60、100、160、200ng 英引苦瓜模板DNA 的扩增
图谱 ;6～10 :30、90、150、240、300ng“323 - 7”模板 DNA 的扩增图谱 ;
11～15 :材料为 10、20、60、100、140ng 长苦瓜模板 DNA 的扩增图谱 ;
1～10 所用 ISSR 引物为 008 号 ;11～15 所用 ISSR 引物为 807 号
图 2 　不同浓度引物的 ISSR2PCR 电泳结果
M. :为分子量标准 (DL2000) ;1～4 :015、110、115、210μmolΠL
引物浓度的扩增图谱 ,所用引物为 008 号。材料为台湾翠玉香
增 ,浓度太低则无法扩增。本实验采用的 Taq DNA 聚
合酶购自 TaKaRa 公司 ,每个反应体系中从 015～215U
分别进行了扩增实验 ,结果如图 3。试验结果表明 ,
Taq DNA 聚合酶用量为 015U 时无扩增 ,1 U 时扩增谱
带结果稳定 ,重复性好 ,115 U 和 2 U 时扩增谱带出现
模糊 ,215 U 时带型发生变化。所以在确保实验结果
稳定的前提下 ,每个反应体系应采用的 Taq DNA 聚合
酶浓度为 1 U。
图 3 　不同浓度 TaqDNA 聚合酶的 ISSR2PCR 电泳结果
M:为分子量标准 (DL2000) ;1～5 :015、110、115、210、215U 的
TaqDNA 聚合酶对 008 号引物的扩增图谱。材料为台湾翠玉香
214 　复性温度对对 ISSR2PCR的影响
ISSR2PCR 和 RAPD2PCR 很相似 ,复性温度明显影
响扩增带的式样[2 ] 。在本研究中对不同的 ISSR 引物 ,
尝试了从 40 ℃～64 ℃不同的复性温度 ,发现不同引物
具有不同的最佳复性温度。本研究对选用的 ISSR 引
612 核　农　学　报 20 卷
物进行了复性温度梯度筛选 ,发现凡锚定的 ISSR 引
物 ,其最佳复性温度与熔融温度极为接近 ;而非锚定
ISSR 引物的最佳复性温度与其熔融温度存在一定差距
(表 1 ,图 4) ;最佳的复性温度范围在 48 ℃～52 ℃之间。
表 1 　部分 ISSR2PCR 引物序列以及 PCR 最佳复性温度( Ta)
引物 序列 5’→3’ AT GC 熔融温度( ℃)
复性温度
( ℃)
001 ACTGACTGACTGACTG 8 8 48 5216
008 GCACACACACACACAC 7 9 50 4916
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 9 8 50 4916
901 CAGCAGCAGCAGCAG 5 10 50 5416
902 CAACAACAACAACAA 10 5 40 4813
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 8 9 52 5013
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 8 9 52 5013
图 4 　不同复性温度的 ISSR2PCR 结果
M:λEcoT14 Ⅰ;1～8 :复性温度在 6210 ℃、6018 ℃、
5812 ℃、5416 ℃、4916 ℃、4610 ℃、4315 ℃和 4210 ℃时对
008 号引物的扩增图谱。材料为台湾翠玉香
图 5 　优化条件下 ISSR2PCR 的结果
M:λEcoT14 Ⅰ; ISSR 引物 : 807 号 : 1～12 :模板 DNA 的用量为 20～
30ng、引物浓度为 1μmolΠL、Tag DNA 聚合酶的用量为 1U ,复性温度为
50 ℃时依次对新一代青苦瓜 ,长白苦瓜 ,阳朔苦瓜、小白苦瓜、滨城苦
瓜、华绿苦瓜、蓝山大白苦瓜、光泽长条苦瓜、中苦瓜、刺菠萝苦瓜、刺
皇苦瓜和青苦瓜的扩增图谱
　　综上所述 ,我们得出比较稳定的苦瓜 ISSR2PCR 的
反应体系 ,在 25μl 的反应体系中 ,模板 DNA 的用量为
20～30ng ,ISSR 引物的浓度为 1μmolΠL ,Tag DNA 聚合酶
的用量为 1U ,复性温度在 48 ℃～52 ℃之间。按照此体
系 ,94 ℃预变性 5min ;94 ℃变性 30s ,根据不同引物在
48 ℃～52 ℃复性 45s ,72 ℃延伸 2min ,循环 40 次 ;然后
72 ℃延伸 5min ; 扩增的重复性好 ,多态性位点丰富
(图 5 和 6) 。
图 6 　优化条件下 ISSR2PCR 的结果
M:λEcoT14 Ⅰ; ISSR 引物 : 902 号 : 1～14 :模板 DNA 的用量为 20～
30ng、引物浓度为 1μmolΠL、Tag DNA 聚合酶的用量为 1U、复性温度为
48 ℃时 ,依次对阳朔苦瓜、白苦瓜、小白苦瓜、长苦瓜、内江苦瓜、种都
1 号、种都 2 号、种都 4 号、台湾翠玉香、华绿王苦瓜、”323 - 7”、青丰
苦瓜、二青白苦瓜和新一代青苦瓜的扩增图谱
3 　讨论
由于 PCR 扩增反应中的变性、复性、延伸的温度
和时间 ,反应过程的循环次数 ,以及反应体系中的不同
试剂浓度 ,如模板 DNA 的用量、Mg2 + 、Taq DNA 聚合
酶、dNTPs 和 ISSR 引物的浓度等诸多因子都会对扩增
反应过程和结果产生影响 ,因此 ,要保证苦瓜 ISSR2
PCR 实验结果的稳定性、重复性和可信性 ,必须针对各
自的仪器设备、不同来源的试剂以及影响 PCR 扩增的
主要因子进行适当地调整、筛选和优化。试验表明 ,只
要反应条件保持不变 ,反应体系中多种试剂来源和浓
度保证一致并严格控制反应程序的各个环节及各个循
环参数的稳定性 ,重复结果是不难得到的[6 ] 。
试验证明 ,采用 CTAB 法提取苦瓜 DNA ,由于苦瓜
多糖和多酚的含量较高 ,往往提取的 DNA 样品纯度不
够 ;在进行苦瓜 ISSR2PCR 扩增时 ,需采用有效浓度范
围内较低值的模板进行扩增 ,才能将抑制 Taq DNA 聚
合酶活性因子的影响降到最小 ,获得最佳的扩增效果 ,
这与邹喻苹等人的结论一致[4 ] 。试验结果同时证实 ,
凡锚定的 ISSR 引物 ,其最佳复性温度与熔融温度极为
接近 ;而非锚定 ISSR 引物的最佳复性温度与其熔融温
度存在一定差距。因此 ,在利用不同类型 ISSR 引物 ,
特别是非锚定 ISSR 引物对苦瓜进行 PCR 扩增分析时 ,
必须筛选出最佳的复性温度才能获得满意的效果。
通过试验对获得苦瓜 ISSR2PCR 扩增的主要条件
因子进行了优化 ,包括模板 DNA 浓度、ISSR 引物浓度、
Taq DNA 聚合酶浓度和 ISSR2PCR 复性温度等。在这
些条件下 ,以不同时间抽提 DNA 为模板 ,经过多次重
复 ,结果均一致 ,且稳定性和重复性好 ,说明所建立的
反应体系和优化的扩增条件是适用于苦瓜 ISSR2PCR
　　　 (下转第 168 页)
712Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (3) :215～217
射处理后 ,小麦基因组 DNA 发生突变从而导致与 SSR
上下游引物配对的碱基序列发生改变 ,致使扩增片段
增加或减少甚至没有扩增产物 ;同时 ,SSR 上下游引物
之间的碱基插入或缺失 ,致使扩增产物长度发生变化
等。
高睦枪等利用 53 对 SSR 引物对 48 个小麦新品种
进行遗传差异研究 ,认为 B 基因组的等位变异最
多[13 ] ;贾继增等对来自 11 个国家的 15 个小麦品种进
行 RFLP 多态性检测 ,表明六倍体小麦 B 基因组的遗
传多样性最高[14 ] 。本实验中 B 基因组的多态性频率
占总多态性频率的 46 % ,明显高于其他两个基因组 ,
因此 B 基因组对辐照最敏感 ,是小麦 3 个基因组中的
“热点”突变基因组 ,这与先前的研究相吻合。
参考文献 :
[ 1 ] 　刘录祥 ,郑企成. 空间诱变与作物改良. 北京 :原子能出版社 ,1997
[ 2 ] 　Liu Luxiang et al . Crop germplasm enhancement through aerospace
mutation technique , In : Proceedings of International Conference on
Engineering and Technological Sciences 2000 ( Eds by Song Jian and
Wang Maohua) , 356～357 , New World Press , 2000
[ 3 ] 　Liu L , Van Zanten L , et al . Officially Released Mutant Varieties in
China. Mutation Breeding Review , 2004 , 14 : 1～62
[ 4 ] 　刘录祥 ,王　晶 ,等. 作物空间诱变效应及其地面模拟研究进展.
核农学报 ,2004 ,18 (4) :247～251
[ 5 ] 　刘录祥 ,韩微波 ,等. 混合粒子场诱变小麦的细胞学研究. 核农学
报 ,2005 ,19 (5) :327～331
[ 6 ] 　刘录祥 ,赵林姝 ,等. 高能混合粒子场辐照冬小麦生物效应研究.
科学技术与工程 ,2005 ,5 (21) :1642～1645
[ 7 ] 　Micheli M R , Bova R , et al . Reproducible DNA fingerprinting with the
random amplified polymorhic DNA ( RAPD) method. Nucleic Acids
Research , 1994 , 22 : 1921～1922
[ 8 ] 　郭会君. 小麦茎秆强度及其相关性状的 QTL 分析. 中国农业科学
院研究生院 :硕士研究生论文 ,2002
[ 9 ] 　Roder M S , Korzun V , et al . A microsatellite map of wheat . Genetics ,
1998 , 149 : 2007～2023
[10 ] 　徐冠仁. 植物诱变育种. 北京 :中国农业出版社 ,1992
[11 ] 　周　峰 ,易继财 ,等. 水稻空间诱变后代的微卫星多态性分析. 华
南农业大学学报 ,2001 ,22 (4) :55～57
[12 ] 　王岳光 ,孙锡勇 ,等. γ射线照射和离子束注入小麦生物学效应
的研究. 莱阳农学院学报 ,1998 ,15 (4) :258～260
[13 ] 　高睦枪 ,刘冬成 ,等. 我国部分冬小麦新品种 (系) SSR 标记遗传
差异的研究. 农业生物技术学报 ,2001 ,9 (1) :49～54
[14 ] 　贾继增 ,张正斌 ,等. 小麦 21 条染色体 RFLP 作图位点遗传多样
性分析. 中国科学 C辑 ,2001 ,31 (1) :13～21
(上接第 217 页)
扩增分析的。
参考文献 :
[1 ] 　Zietkiewicz E , Rafalski A , Labuda D. Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR) 2anchored polymerase chain reaction amplification.
Genomics , 1994 , 20 :176～183
[2 ] 　Bornet B , Branchard M. Nonanchored inter simple sequence repeat
( ISSR ) markers : reproducible and specific tools for genome
fingerprinting. Plant molecular biology reporter ,2001 , 19 : 209～215
[3 ] 　Gupta M , Chyi Y S , Romero2Severson J , et al . Amplification of DNA
markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple2
sequence repeats. Theor Appl Genet , 1994 , 89 :998～1006
[4 ] 　邹喻苹 ,葛 颂 ,王小东. 系统与进化植物学中的分子标记. 北京 :
科学出版社 ,2001
[5 ] 　Tsumura Y, Ohba K, Strauss S. H. Diversity and inheritance of inter
simple sequence repeat polymorphisms in Donglas2fir and sugi
(Cryptomeria japonica) . Theor Appl Genet , 1996 , 92 :40～45
[6 ] 　冯富娟 ,王凤友 ,刘 　彤. 红松 ISSR2PCR 实验系统影响因素. 植
物学通报 , 2004 , 21 (3) : 326～331
861 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (3) :165～168