全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 012075205 综　述
利用原生质体融合技术选育微生物菌种
谭周进1 　杨海君2 　林　曙3 　吴　铁3
(11 湖南农业大学生物安全科技学院 , 湖南 长沙　410128 ; 21 湖南农业大学植物保护学院 , 湖南 长沙　410128 ;
31 湖南农业大学动物科学院 , 湖南 长沙　410128)
摘　要 :对原生质体融合技术的遗传标记筛选、原生质体的制备与再生、原生质体融合等的方
法 ,以及原生质体融合技术在提高抗生素生产效价、酵母菌工程菌株的构建、多功能菌株的选
育以及污水处理工程菌的构建等方面的研究情况进行了综述。就原生质体融合技术在微生物
育种技术上的应用前景进行了分析。
关键词 :原生质体融合 ;菌种选育 ;生物技术
PROTOPLAST FUSION TECHNOLOGY AND MICROBIAL BREEDING
TAN Zhou2jin1 　YANG Hai2jun2 　XIAO Qi2ming2 　LIN Shu3 　WU Tie3
(11 College of Bio2safety Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan , 410128 ;
2. College of Plant Protection , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan ,410128 ;
31 College of Animal Science , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan ,410128 )
Abstract :Researches on selecting of genetic marks , preparation and regeneration of protoplast , protoplast fusion ,
and the application of protoplast fusion technique in microbial breeding were reviewed. The antibiotics strain
improvement , construction of yeast engineer strain , breeding of multi2functional strain and construction of engineer
strain to coping with waste water were also included. The application of protoplast fusion technology in microbial
breeding was analysed.
Key words :protoplast fusion ;strain breeding ;biotechnology
收稿日期 :2003211209
作者简介 :谭周进 (1969 - ) ,男 ,博士 ,副教授 ,主要研究方向为微生物生态学与发酵工程。E2mail :tanzhjin @hotmail . com原生质体融合 (Protoplast fusion)技术起源于 20 世纪 60 年代。1960 年法国的 Karski 研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。同时 ,日本的 Okada 发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合 ,从而开始了细胞融合的探讨。1974 年 ,匈牙利的 Ferenczy[1 ] 采用离心力诱导的方法报道了白地霉 ( Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体融合 ,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术 ,并从微生物种内融合扩展到界间的融合 (如光合细菌与酵母菌的融合) 。1979 年匈牙利的 Pesti 首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告[2 ] ,开创了原生质体融合技术在实际工作中的应用 ,使原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。Hopwood 等[3 ] 提出 ,原生质体融合重组可能实现隐性基因的重组暴露 ,使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型 ,从而使之成为链霉菌抗生素产生菌育种的新途径。1 　原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括[4 ] :原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生。国
57　核 农 学 报　2005 ,19 (1) :75～79Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
内外学者在每一个关键技术上都做了大量的工作 ,取得了可喜的成就。
111 　遗传标记的选择与融合子的检出
遗传标记的选择实际上是融合子检出的重要环节 ,也是融合子检出的标记。
11111 　利用营养缺陷型作为遗传标记选择融合子　即融合的双亲为营养缺陷型 , 并且为不同的缺陷
型。双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子 ,缺陷的单亲原生质体由于丧失了合成某
种物质的能力 ,在基本培养基上不能萌发生长 ,单亲融合的原生质体也不能长出菌落 ,双亲原生质体融
合后 ,缺陷的遗传物质得到互补可以恢复为野生型 ,在基本培养基上能够萌发生长成为菌落。
11112 　利用抗药性作为遗传标记选择融合子　微生物的抗药性是其菌种的特性 ,是由遗传物质决定
的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异 ,利用这种差异或与菌种其它特性结合起来即可对
融合子进行选择。这种方法首先由 Bradshaw 和 Peberdy 于 1984 年使用。药物的浓度过高会使融合频率
降低 ,浓度过低则会使亲本生长 ,影响融合子的检出。
11113 　应用灭活原生质体作为遗传标记选择融合子　原生质体经紫外线照射、加热或经某些化学药剂
的处理 ,可使其丧失在再生培养基上再生的能力 ,而只能作为遗传物质的供体。从而只根据另一亲株特
性设计选择条件而选择融合子。周东坡等[5 ] 通过紫外线照射灭活原生质体融合选育了啤酒酵母新菌
株。用 011 %碘乙酸 , 30 ℃处理产阮假丝酵母 ( Candida utilis ) 原生质体 40min 后 , 与啤酒酵母
( Saccharomyces cerevisiae)的原生质体融合 ,利用形态差异选择融合子。灭活原生质体的机理认为是 :紫
外线使菌株的 DNA 发生突变 ,热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶蛋白变性失活 ,化学药剂的作用能不
可逆地抑制细胞代谢过程的关键酶 ,使之失活。
11114 　利用荧光染色选择融合子　在酶解制备原生质体时向酶解液中加入荧光色素 ,使双亲原生质体
分别带上不同的荧光色素。带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具有再生能力。原生质体融合处
理后 ,在荧光显微镜下观察并通过显微操作 ,直接挑选出带有两种荧光的原生质体。成亚利等[6 ] 以金针
菇为材料 ,经异硫氰酸荧光素标记的金针菇单核 W19 菌株的原生质体与未经标记的单核 Y7 菌株的原
生质体在聚乙二醇的诱导下进行融合 ,得到融合菌株。
11115 　用对碳源利用的不同作选择标记选择融合子 　利用亲株对木糖的利用不同和对放线菌酮
(Actidione ,Ac)的抗性不同选择融合子。如酿酒酵母 ( S1 cerevisiae) 8921 为呼吸完整 ,不能利用木糖 ,对
Ac 敏感。薛瓦酵母 ( S1 chevalieri) Hy4 呼吸完整 ,能利用木糖 ,抗 100μgΠmL Ac。将 8921 与 HY42RD 双亲
的原生质体融合处理后 ,在含有木糖和 20μgΠmLAc 的选择培养基上选择融合子。因为双亲原生质体都
不能生长 ,只有双亲遗传物质重组后才能在选择培养基上萌发生长 ,从而被选择出来。
11116 　利用某些特殊生理特征作为标记选择融合子　如圆褐固氮菌可以在无氮培养基上生长 ,可以与
另外一种菌的抗药性标记联合使用在无氮培养基上来筛选他们的融合子。光合细菌可以在无碳源的培
养基上生长 ,可以与另外的标记联合使用在无碳培养基上来筛选其融合子。
11117 　利用其他一些标记　如荧光假单胞菌的荧光基因与芽孢杆菌的芽孢。
112 　原生质体制备与再生技术
微生物细胞一般是有细胞壁的 ,进行该项技术的第一步就是制备原生质体。现在去除细胞壁的主
要方法是使用酶法 ,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶 ,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体
形成的因素很多 ,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上 ,多采用对数生长期或生长中
后期的菌 ,也有的采用生长后期的这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低 ,细胞壁对酶的
作用最敏感 ,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱 ,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智华
等[7 ]对野生大杯蕈 ( Clitocybe maxima)进行原生质体制备的过程中 ,用 2 种以上的酶液混合使用能提高
去壁效果。陈海昌等[8 ]证明 ,在一定范围内 ,酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正
相关 ,而与再生率成反相关。林红雨等[9 ] 采用酶解 10 分钟后补加 EDTA 的方法 ,改变酶解环境中的离
子强度和渗透压 ,可以提高原生质体形成率。Costeron J1W1 等[10 ] (1967) 报道 ,在高渗 Tris 溶液中添加
115 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)等原生质体扩张剂 ,有助于制备原生质体 ,添加 0102molΠL 镁离子 ,有利于
原生质体的稳定。
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113 　原生质体融合技术
1974 年 ,匈牙利的 Ferenczy[1 ]报道了离心力诱导法对白地霉 ( Geotrichum candidum) 营养缺陷型突变
株的原生质体融合。随后人们相继用 NaCl、KCl 和 Ca (NO3 ) 2 等作为诱变剂进行融合 ,但融合频率都很
低。同年 ,Kao 发现 PEG在适量 Ca2 + 存在下能有效地诱导植物原生质体融合 ,PEG种类对原生质体融合
的影响不大[11 ] ,从而使这一技术跃上了新的阶段 ,大大提高了融合频率。在融合方法上 ,除了传统的化
学方法外 ,1998 年王金盛等[12 ]报道了电场诱导细胞融合的新技术 ,进一步提高了融合频率。1998 年陈
五岭等[13 ]又报道了激光诱导动物细胞融合。此外 ,其融合率还受其它诸因素的影响。陈海昌等[14 ] 的研
究证明原生质体的融合受 PEG和钙离子的浓度及诱导融合时间的影响。林红雨等[9 ] 采用在融合液中
添加新生磷酸钙的方法可以促进原生质体融合。
2 　原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用
211 　抗生素高产菌株的选育
利用原生质体融合技术不但可用于提高抗生素的产量 ,同时还可用于融合子产生新抗生素的研究 ,
特别是在链霉菌育种中[15 ] 。贺敏霞[16 ]等通过诺卡氏菌原生质体融合重组发现 4 株融合子产生亲本所
没有的简体转化中间体 ,3 株融合子产生亲本所没有的抗生物质 ,还得到一株简体转化活力明显高于亲
本的融合子。林荣团[17 ]等以天然无抗菌活性的变青链霉菌 1326 与链霉菌 1254 营养缺陷型突变株进行
种间原生质体融合 ,筛选到 5 株抗菌活性较稳定的菌株。曾洪梅等[18 ] 通过原生质体融合的方法提高了
农抗武夷菌素的效价。陈五岭等[13 ]通过比较 He2Ne 激光和聚乙二醇 (PEG)对红霉素链霉菌 (SE) 和龟裂
链霉菌 (SR)灭活原生质体的诱导融合 ,筛选得到几株红霉素产量与亲本相比有明显差异的融合子 ,产
抗生素能力最多提高了 28104 %。王金盛等[19 ] 以小诺霉素 ( Micronomicin ,MCR) 产生菌棘孢小单胞菌
( Micromonsporae chinospora)为出发菌株 ,通过单亲致死原生质体融合 ,以链霉素为选择条件选出融合株 ,
筛得 4 株 MCR 百分含量高于亲株的融合子。朱昌雄等[20 ] 通过用紫外线处理、低温和紫外线复合处理、
原生质体加紫外线复合处理及原生质体融合等 4 种育种方法 ,都能有效地提高中生菌素的效价。
212 　原生质体融合技术在酵母菌工程菌构建上的应用
庞小燕等[21 ]以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本 ,获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精稳定的酵
母融合株 ,具有良好的应用前景。高年发等[22 ]将酿酒酵母与粟酒裂殖酵母进行属间原生质体融合选育
到降解苹果酸强的菌株。高玉荣[23 ]利用发酵力强的葡萄酒酵母与降酸能力强 ,发酵性能好的杰酒裂母
融合 ,进行生物基因交换和重组 ,获得的融合子降酸率可达 3014 % ,比葡萄酒酵母的降酸性提高 20 %。
Kumari 等[24 ]将能够分解纤维素的 Trichoderma reesei QM 9414 和从葡萄糖产酒精的 S1 cerevisiae NCIM
3288 进行融合 ,得到具有很强的将滤纸纤维素转化为酒精的融合子。赵华等[25 ] 运用紫外线灭活原生质
体融合技术 ,成功地对酒精酵母 ( K酵母) 和产酯酵母 ( F2) 进行了属间细胞融合 ,获得既具有高产酒特
性 ,又具有高产酯特性的发酵性能稳定的融合子 FK3227。王昌禄等[26 ]利用紫外线致死原生质体融合技
术 ,成功地将对紫外线敏感的嗜杀酵母菌株的嗜杀质粒转移到 CD42W 中 ,获得的大量融合子经嗜杀活
性检出实验 ,小型酿造实验 ,遗传稳定。杜连祥等[27 ]利用 PEG诱导原生质细胞融合技术 ,将糖化酵母的
糖化酶基因转移到嗜杀啤酒酵母中 ,获得 1 株高发酵度嗜杀啤酒酵母 F235288 菌株。
S1 cerevisiae 在啤酒发酵后期能凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母 ,而沉淀不好的酵母称为粉状
酵母。具有良好凝集性的酵母可使啤酒发酵液澄清速度加快 ,降低酵母分离时的能量消耗 ,并且还可防
止酵母在发酵液中长时间悬浮导致细胞自溶而影响啤酒的风味。啤酒酵母的凝集特性由其本身的遗传
特性决定。一般凝集性较好的啤酒酵母往往发酵度偏低。陈海昌等[14 ] 应用原生质体融合技术选育出
的融合子 FP19 ,既具有较高的发酵度又具有较强的凝集性。
许多种微生物能在 45 ℃～65 ℃生存 ,关于微生物耐热性的机理研究得还不是很清楚 ,但其耐热性
却有很重要的应用价值。在酒精酿造中 ,酿酒酵母于 40 ℃时产酒明显下降。为此必须消耗大量能源降
低发酵液的温度。方霭祺等[8 ]报道了以酿酒酵母 396 和假丝酵母 C6 为亲本 ,通过原生质体融合技术 ,
77　1 期 利用原生质体融合技术选育微生物菌种
得到了一株在 40 ℃培养条件下原料利用率为 9413 % ,乙醇产量为 5917gΠL 的属间融合株。文铁桥等[28 ]
通过 PEG诱导碘乙酸灭活呼吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合 ,获得 45 ℃发酵产酒
率高达 817 %的高温酵母菌株 AY006。
213 　原生质体融合技术在其它多功能菌种选育中的应用
通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组 ,从而得到兼具两个亲本优良性状的新菌
株。张清文等[29 ]以多糖产生菌 T和胡萝卜素产生菌 C12B 为双亲 ,用原生质体融合技术选育出了 1 株既
产多糖又产胡萝卜素的杂交品系。韦革宏等[30 ] 利用原生质体融合技术 ,成功地获得了 Rhizobium
leguminosoum USDA2370 和 Sinorhizobium xinjiangnesis CCBAU110)的属间融合菌株 ,可分别在双亲寄主植物
上结瘤。融合菌株与亲本菌株的生物学特性均不同。Jianxiu 等[31 ]将 Bacillus thuringiensis S184 和 TnX 两
菌株进行融合 ,将 cyt1Aa 和 cry11Aa 基因成功地组合到一个菌株中 ,得到高毒力菌种。林红雨等[9 ] 用原
生质体融合技术获得能够稳定地将 D2葡萄糖一步转化为 22酮基2L2古龙酸的欧文氏菌和棒杆菌融合子。
唐宝英等[32 ]将具有解钾活性的胶质芽孢杆菌 ( B . mucilaginesus) W9212 与具有杀虫活性的苏云金芽孢杆
菌 ( B . thuringiensis) B179208 原生质体进行了融合 ,融合子既具解钾活性 ,又具具有杀虫活性。陈五岭
等[33 ]在双亲灭活原生质体融合选育苏云金杆菌新菌株的过程中 ,最终筛选出一株毒力效价较双亲分别
提高 41 %和 117 %的新菌株。张修军等[34 ] 以农抗 5102 产生菌同源菌株 90211 和 FR2008 进行原生质体
融合 ,筛选获得 1 株两亲本均不具备的产抗细菌活性的融合子 SR27 和 1 株各种抗菌活性均高于亲本的
融合子 SR2T19。王宪川等应用原生质体融合技术 ,得到了既杀鳞翅目昆虫 ,又杀双翅目害虫的苏云金
杆菌重组菌株。又如枯草芽胞杆菌 ( B1subtilis) TG26 产生抗菌蛋白 ,能抑制同种或不同种属微生物的生
长。B1 thuringiensis subsp1 Pacifeus AS11904 产生伴胞晶体蛋白 ,能杀植物害虫。王雅平等[35 ]通过原生质
体融合获得了能表达亲株抗菌蛋白和毒素蛋白的融合株。
应用原生质体融合技术对酶的研究是相当广泛的。研究最多的是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶 ,主要
用于提高菌种的产酶活力 ,改变菌种酶分泌的种类或使产酶菌种获得新的优良性状等。日本 Waseda 大
学应用此技术以柠檬酸生产菌株黑曲霉 ( A1 niger) 和纤维素酶产生菌绿色木霉 ( Trichoderma viride) 为亲
本 ,融合后筛选到能在甘蔗渣固体培养基上生长产生柠檬酸的融合子 ,兼具了绿色木霉产纤维素酶的能
力和黑曲霉产柠檬酸的能力。曹军等[36 ]以两性霉素 B 抗性作为标记 ,进行栖土曲霉种内非营养缺陷型
原生质体融合 ,在 40 %的 PEG26000 促融下 ,获得稳定的融合子 ,融合子为杂合二倍体 ,产角蛋白酶活力
较亲本显著提高。
214 　原生质体融合技术在污水工程菌构建上的应用
利用微生物处理及利用污水是一个很有效的方法 ,但是这一技术的应用往往涉及多种微生物 ,多种
菌的优化组合是一个很复杂的课题 ,原生质体融合技术可以将多个功能组合到一个菌上 ,为其在污水处
理上的应用提供了良好的条件。许燕滨等[37 ]采用原生质体融合技术 ,将两株具有含氯有机化合物降解
特性的菌假单胞菌 T21 和诺卡氏菌 RB21 融合构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌 ,应用于造纸
漂白废水 ,融合菌去除 CODCr 和 TCL 的能力比混合菌分别提高了 72105 %和 190 %。周德明[38 ]采用原生
原体融合技术将球形红假单胞菌和酿酒酵母构建成高效降解工程菌 ,工程菌用于废水处理的比降解率
明显提高。程树培等[39 ]将光合细菌与酵母菌进行原生质体融合 ,用于连续发酵豆制品废水处理。程树
培等[40 ]由单亲株灭活法获得的酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂种酵母细胞 ,在净化味
精废水产生单细胞蛋白方面优于双亲菌株 ,为提高废水的净化效率 ,增加单细胞蛋白的产量 ,创造了极
为有利的条件。
215 　原生质体融合技术在其它微生物育种方面的应用
裘娟萍等[41 ]以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株。肖在勤等[42 ] 将热灭活的凤尾菇原生质
体与金针菇原生质体融合 ,选出双亲细胞质和细胞核都融合的无锁状联合菌株 ,经融合核分裂技术处理
后 ,融合核分裂成为具有锁状联合的双核菌株。通过原生质体融合技术还可对耐热机理进行研究。如
有一株耐高温酵母一旦经 EB 诱变失去线粒体变为小菌落后 ,即失去耐高温特性。说明耐热性与线粒
体有关系。因而应用原生质体技术对耐热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。
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综上所述 ,原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具 ,也为
遗传育种提供了一种有效手段 ,已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。但是还都只局限于两个菌
之间的融合 ,没有扩展到 3 个以上的菌之间的融合 ,如果我们能够开展多个菌之间的融合 ,则有可能获
得同时具多个优良性状的菌株 ,进一步扩宽这一技术的应用。
参考文献 :
[ 1 ] 　Ferencezy L , Kevei F , Zsolt J . Fusion of fungal Protoplast . Nature ,1974 ,248 :793～794
[ 2 ] 　Pesti M , Konszky E ,Polga J ,et al . Fifth international protoplast symposium ,1979 :54
[ 3 ] 　Hopwood D A ,Wright H M ,Bill M J , et al . Genetic recombination through protoplast fusion in streptomyces. Nature ,1977 ,268 :171～173
[ 4 ] 　Muralidhar R V , Panda T. Fungal protoplast fusion2a revisit . Bioprocess Engineering ,2000 ,22 (5) :429～431
[ 5 ] 　周东坡 ,张宝国. 通过灭活原生质体融合选育啤酒酵母新菌株. 微生物学报 ,1999 ,39 (5) :454～460
[ 6 ] 　成亚利 ,朱宝成. 荧光标记金针菇原生质体融合. 微生物学通报 ,1997 ,24 (6) :331～333
[ 7 ] 　彭智华 , 曾广文. 大杯蕈原生质体菌株筛选的研究. 园艺学报 ,2000 ,27 (3) :193～197
[ 8 ] 　方霭祺 ,李绍兰. 耐热酵母与酿酒酵母原生质体融合的研究. 生物工程学报 ,1990 ,6 (3) :224～229
[ 9 ] 　林红雨 ,陈策实 ,尹光琳. 欧文氏菌和棒杆菌的属间融合研究. 微生物学通报 ,1999 ,26 (1) :3～6
[10 ] 　Costerton J W. Nutrition and methabolism of marine bacteria. Journal of bacteriology ,1967 ,11 : 1764～1777
[11 ] 　Hopwood D A. Genetic studies with bacterial protoplasts. Ann Rev Microbial , 1981 ,35 :237～259
[12 ] 　王金盛 ,李春波. 电场诱导棘孢小单胞菌原生质体融合. 生物技术 ,1998 ,8 (6) :6～8 ,13
[13 ] 　陈五岭 ,姚胜利 氦氖激光在红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合中的应用. 光子学报 ,1998 ,27 (7) :651～655
[14 ] 　陈海昌 ,唐屹 ,张岭花 ,等. 原生质体融合技术提高啤酒酵母凝絮性的研究. 微生物学通报 ,1994 ,21 (4) :213～217
[15 ] 　RICHARD H. BALT Z. Genetic Recombination by Protoplast Fusion in Streptomyces. Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology. 2001 ,22
(425) :460～471
[16 ] 　贺敏霞 ,史济平 ,褚志文. 诺卡氏菌原生质体融合重组研究. 生物工程学报 ,1989 ,5 (4) :303～308
[17 ] 　林荣团 ,杨毓芬. 天然无抗菌活性链霉菌种间原生质体融合与活性重组体的分离. 生物工程学报 ,1990 ,6 (2) :134～139
[18 ] 　曾洪梅 ,张震霖. 原生质体融合提高农抗武夷菌素的效价. 微生物学报 ,1995 ,35 (5) :375～380
[19 ] 　王金盛 ,郝德阳. 棘孢小单胞菌原生质体的融合育种. 山东大学学报 : (自科版) 1999 ,34 (2) :219～223
[20 ] 　朱昌雄 ,李永慧. 中生菌素高产菌株的选育. 中国生物防治 ,1996 ,12 (1) :15～19
[21 ] 　庞小燕 ,王吉瑛. 构建直接发酵淀粉产生酒精的酵母融合菌株的研究. 生物工程学报 ,2001 ,17 (2) :165～169
[22 ] 　高年发 ,王淑豪. 酿酒酵母与粟酒裂殖酵母属间原生质体融合选育降解苹果酸强的菌株. 生物工程学报 ,2000 ,16 (6) :718～722
[23 ] 　高玉荣. 原生质体融合葡萄酒酵母用于葡萄酒降酸. 酿酒科技 ,2001 , (3) :59～60
[24 ] 　Kumari J ,Panda T. Intergeneric hybridization of trichoderma reesei QM9414 and saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion. Enzyme
and Microbial Technology ,1994 ,16 (10) :870～882
[25 ] 　赵华 ,赵树欣. 运用紫外线灭活原生质体融合技术选育高产酯酒精酵母的研究. 酿酒科技 ,1996 , (5) :13～16
[26 ] 　王昌禄 ,杜连祥. 利用紫外线致死原生质体融合技术选育嗜杀啤酒酵母. 食品与发酵工业 ,1993 , (6) :1～7 ,48
[27 ] 　杜连祥 ,姜悦. 糖化酵母在干啤酒生产中应用的研究 ( Ⅱ) . 食品与发酵工业 ,1995 , (4) :1～5
[28 ] 　文铁桥 ,赵学慧. 克鲁维酵母与酿酒酵母属间原生质体融合构建高温酵母菌株. 菌物系统 ,1999 ,18 (1) :89～93
[29 ] 　张清文 ,张素琴. 多糖产生菌 T与β2胡萝卜素产生菌 C12B 的融合研究. 应用与环境生物学报 ,1999 ,5 (2) :195～198
[30 ] 　韦革宏 ,陈文新 豌豆根瘤菌与新疆中华银瘤菌原生质体的属间隔合研究. 生物工程学报 ,2001 ,17 (5) :534～538
[31 ] 　Jianxiu Y, Pang Y,Mujin T ,et al . Highly Toxic and Broad2Spectrum Insecticidal Bacillus thuringiensis Engineered by Using the Transposon Tn917
and Protoplast Fusion . Current Microbiology ,2001 , 43 (2) :112～119
[32 ] 　唐宝英 ,朱晓慧. 硅酸盐细菌和苏云金芽孢杆菌原生质体融合. 生物技术. 1998 ,8 (5) :19～21 ,31
[33 ] 　陈五岭 ,张芳琳. 双亲灭活原生质体融合技术在苏云金杆菌菌种选育上的应用研究. 西北大学学报 : (自然科学版) 1998 ,28 (5) :419
～422
[34 ] 　张修军 ,周启. 利用同源菌株融合改良农抗 5102 产生菌 :融合子的检出筛选. 中国抗生素杂志 ,1999 ,24 (2) :93～95 ,125
[35 ] 　王雅平 ,刘伊强. 利用原生质体融合技术选育防治植物病虫害的基因重组菌株. 遗传学报 ,1993 ,20 (6) :524～530
[36 ] 　曹军 ,宋志文. 非营养缺陷型原生质体融合选育角蛋白酶生产菌应用与环境. 生物学报 ,2001 ,7 (4) :388～391
[37 ] 　许燕滨 ,江霞. 高效含氯有机化合物降解工程菌的构建研究. 重庆环境科学 ,2001 ,23 (2) :46～48 ,51
[38 ] 　周德明. 原生原体融合构建高效降解工程菌的研究. 中南林学院学报 ,2001 ,21 (2) :42～46
[39 ] 　程树培 ,邓良伟. 光合细菌与酵母原生质体融合子连续发酵豆制品废水研究. 环境科学学报 ,1997 ,17 (3) :372～377
[40 ] 　程树培 ,崔益斌. 酿酒酵母与热带假丝酵母融合子多功能性研究. 环境污染与防治 ,1995 ,17 (1) :9～12
[41 ] 　裘娟萍 ,周宁一. 以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株. 中国病毒学 ,1995 ,10 (4) :362～366
[42 ] 　肖在勤 ,周俊初. 金针菇与凤尾菇科间原生质体融合研究. 食用菌学报 ,1998 ,5 (1) :6～12
97Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (1) :75～79