全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 052607204
珠眉海棠 cDNA2AFLP 分析体系的建立
李志红1 　唐美玲2 　刘　佳1 　王　忆1 　李天忠1 　韩振海1 　许雪峰1 　孔 瑾1
(1. 中国农业大学园艺植物研究所 ,北京　100193 ; 2. 烟台农业科学研究院果树所 ,山东 烟台　265500)
摘 　要 :以珠眉海棠 ( Malus zumi Mats) 为研究材料 ,对 cDNA2AFLP 反应体系的关键因素 (酶切时间、预扩
增体系、选择性扩增体系) 进行探索 ,建立了重复性好的 cDNA2AFLP 分析体系。结果表明 , EcoRI 和
MseI的组合 4h 可将 ds2cDNA 酶切完全 ,与相应接头连接过夜后产物直接用于预扩增 , 1μl 稀释 20 倍的
预扩增产物作为模板用于选择性扩增 ,可以获得带型丰富且重复性好的结果。珠眉海棠 cDNA2AFLP 反
应体系的建立为进一步的分子生物学研究建立了平台。
关键词 :珠眉海棠 ;cDNA2AFLP ; EcoRI ;MseI
Establishment of cDNA2AFLP System of Malus zumi Mats
LI Zhi2hong1 　TANG Mei2ling2 　LIU Jia1 　WANG Yi1 　LI Tian2zhong1 　HAN Zhen2hai1 　XU Xue2feng1 　KONGJin1
(1. Institute of Horticultural Plants , China Agricultural University , Beijing 100193 ;
2. Fruit Institute , Yantai Academy of Agriculture Sciences , Yantai , Shandong 265500)
Abstract :The cDNA Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA2AFLP) system of Malus zumi Mats was established.
The key factors , including enzyme digestion , preamplification and selective amplification , were optimized. The results
indicated that double2stranded cDNA of Malus zumi Mats was digested completely after 4h digestion by EcoRI and MseI. The
reducible result was obtained when the ligation products without dilution were used as templates for preamplification and 1μl of
20 times2diluted preamplification products for selective amplification. The cDNA2AFLP system was established successfully ,
which provided platform for further molecular study and gene cloning of Malus zumi Mats.
Key words : Malus zumi Mats ; cDNA2AFLP ; EcoRI ; MseI
收稿日期 :2008202222 　接受日期 :2008203213
基金项目 :国家自然基金 (30600416)和北京市自然基金 (5072027)
作者简介 :李志红 (19822) ,女 ,河南洛阳人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为果树逆境生理与分子生物学。E2mail :zixia729 @126. com ;
唐美玲 (19762) ,女 ,山东文登人 ,博士 ,在读博士后 ,果树分子生物学方向。E2mail :tml1999 @yahoo. com. cn
通讯作者 :许雪峰 (19632) ,男 ,北京人 ,教授 ,研究方向为果树逆境生理与分子生物学。E2mail :xuefengx @cau. edu. cn ;
孔瑾 (19732) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,副教授 ,果树分子生物学方向。E2mail :jinkong @cau. edu. cn　 　cDNA2AFLP ( cDNA Amplified Fragment LengthPolymorphism) 技术是Bachem 等[1 ]将 AFLP 技术应用于mRNA 表达差异分析的技术。它的多态性丰富、稳定性较高[2 ] ,可以在遗传信息较少的情况下 ,找到特定时空基因表达的差异 ,具有效率高 ,灵敏度高 ,检测的基因覆盖面广的特点 ,可对生物体转录组进行全面、系统的分析 ,已成功地用于多个物种基因差异显示和基因克隆的研究。陈桂平等[3 ] 采用 cDNA2AFLP 技术 ,分析了“一粒传”小麦后代耐盐突变体中两个不同耐盐品系盐胁迫前后的基因表达差异 ,并获得了大量与耐盐相 关的基因片段。Campalans 等[4 ] 用此技术比较和鉴定了 8 个杏树品种在干旱条件下叶片基因表达情况。而土壤盐渍化是影响果树产量和品质的自然逆境之一 ,盐渍化会使果树水分养分吸收失去平衡 , 导致生长发育不良 , 叶片变褐焦边 ,坐果不良 , 幼果脱落 ,严重时导致树体整株枯萎死亡。培育耐盐品种是果树有效利用盐渍化土壤的一条根本途径[5 ] 。苹果是我国北方主栽树种之一 ,而珠眉海棠 ( Malus zumi Mats)是苹果的优良砧木 ,它原产日本北部山区 , 为三叶海棠和毛山荆子的野生天然杂交种 ,耐盐性很强 ,可以在
706　核 农 学 报　2008 ,22 (5) :607～610Journal of Nuclear Agricultural Sciences
016 %(100mmolΠL)的盐碱地上正常生长[6 ] 。本研究以
珠眉海棠为试验材料 ,建立重复性好的 cDNA2AFLP 分
析体系 ,以期为进一步分离、克隆及定位珠眉海棠耐盐
基因奠定基础。
1 　材料和方法
111 　植物材料的培养
为确保材料的一致性 ,本试验以组织培养的珠眉
海棠 ( Malus zumi Mats) [7 ] 为试材 ,经生根练苗后 ,在营
养液中生长 1 个月 ,待其生长正常取其幼嫩叶片作样
品 ,液氮速冻后置 - 70 ℃冰柜保存待用。
112 　方法
11211 　总 RNA 的提取和 cDNA 的合成 　总 RNA 的提
取采用改进的 CTAB 法[8 ] ,在 CTAB 提取缓冲液中添加
较高浓度的 PVP (聚乙烯斯吡咯烷酮) 和β2巯基乙醇 ,
去除 DNA 参照 DNAse I 的说明书。cDNA 双链的合成
及补平纯化参考 Takara 公司的 cDNA Synthesis Kit。
cDNA 第一链的合成参照 Takara M2MLV 说明书进行 ,
总 RNA 用量为 2μg。cDNA 第二链 (ds2cDNA)合成的反
应体系为 100μl : 第一链混合 物 25μl , 10 ×DNA
polymerase I buffer ,DNA polymerase I 20U , RnaseH 1U ,
dNTP(10mmolΠl) 3μl ,ddH2O 补平。体系混匀后 ,16 ℃反
应 215h ,70 ℃灭活 10min 后置于在冰上。双链 cDNA
(ds2cDNA)末端补平 :在上述反应物中依次加入 dNTP
(10mmolΠl) 2μl ,T4 DNA 聚合酶 10U ,混匀后 ,37 ℃反应
30min ,70 ℃灭活 10min。纯化 ds2cDNA 用等体积的 CI
[氯仿∶异戊醇 (24∶1) ]抽提 ,取上清液 ,加入 011 倍体
积的乙酸钠 (3molΠL ,pH512) 和 215 倍体积无水乙醇混
匀 ,沉淀 30min ,离心 10min 后弃上清 ,吹干沉淀 ,用
ddH2O 溶解 ,调整浓度至 100ngΠμl。
11212 　酶切及连接 　EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ两种限制性内切
酶酶切 ,酶切总体系 40μl :上述补平纯化的 ds2cDNA
(100 ngΠμl) 20μl ,EcoRI 5U ,MseI 5U ,10 ×YΠTango Buffer ,
ddH2O 补平。混匀后 ,37 ℃分别酶切 2、4、8 和 12h ,酶
切结束后 70 ℃灭活 10min ,立即置于冰上。用 1 %琼脂
糖凝胶电泳检测结果 ,确定合适的酶切时间。
EcoR Ⅰ接头和Mse Ⅰ接头如表 1 所示 ,连接体系
30μl :上述酶切产物 20μl , EcoR Ⅰ接头 (50pmolΠμl) 1μl ,
MseI接头 (50pmolΠμl) 1μl ,ATP (10mmolΠL) 1μl , T4 连接
酶 350U ,10 ×T4 Ligation buffer ,ddH2O 补平。混匀后 ,
16 ℃连接 10h 以上 ,70 ℃10min 中止反应。
11213 　预扩增 　扩增反应分 2 个步骤进行 ,首先利用
EcoRI + 0ΠMseI + C 两条引物预扩增 ,然后利用具有 3
个选择碱基的引物进行选择性扩增预扩增及选择性扩
增引物序列见表 1。
表 1 　接头及引物序列
Table 1 　Sequences of adaptors and primers
接头和引物
adaptors and primers
序列 sequences
EcoRI 双链接头 5′2CTC GTA GAC TGC GTA CC23′
EcoRI double2stranded adaptors 3′2CAT CTG ACG CAT GGT TAA25′
MseI 双链接头 5′2GAC GAT GAG TCC TGA G23′
MseI double2stranded adaptors 3′2TAC TCA GGA CTC AT25′
EcoRI 预扩增引物 5′2GAC TGC GTA CCA ATT C23′
EcoRI preamplification primers
MseI 预扩增引物 5′2GATGAGTCCTGAG TAA C23′
MseI preamplification primers
选择性扩增引物 E6 5′2GACTGCGTACCAATTC ACC23′
selective amplification primers E6
选择性扩增引物 M7 5′2GATGAGTCCTGAGTAA CTC23′
selective amplification primers M7
选择性扩增引物 E3 5′2GACTGCGTACCAATTC AAG23′
selective amplification primers E3
选择性扩增引物 M1 5′2GATGAGTCCTGAGTAA CAA23′
selective amplification primers M1
　　将连接产物的原液及其 10 倍和 20 倍的稀释物 ,
作为预扩增的模板 ,总体系 25μl :模板 215μl ,10 ×PCR
buffer , dNTP ( 10mmolΠl ) 014μl , EcoRI 预 扩 增 引 物
(10μmolΠl) 110μl ,MseI预扩增引物 (10μmolΠl) 110μl ,Taq
酶 2U , ddH2O 补平。预扩增程序 : 94 ℃预变性 2min ;
94 ℃变性 30s ,56 ℃退火 60s ,72 ℃延伸 60s ,30 个循环 ;
72 ℃延伸 5min。预扩增产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳检
测 ,确定合适的稀释倍数。
11214 　选择性扩增 　以预扩增产物原液及其 10、20、
30 倍的稀释物为模板 ,选择性扩增引物用 E6M7 ,E3M1
( E6、E3 为 EcoRI相对应的选择性扩增引物 ,M7、M1 为
MseI相对应的选择性扩增引物 ;均为带 3 个选择性碱
基的引物 ,表 1 中其序列最后三个碱基为选择性碱
基) 。选择性扩增程序 : 94 ℃预变性 4min ; 94 ℃变性
30s ,65 ℃退火 30s (每个循环降 017 ℃) ,72 ℃延伸 60s ,
13 个循环 ;94 ℃变性 30s ,56 ℃退火 30s ,72 ℃延伸 60s ,
23 个循环 ;72 ℃延伸 10min。选择性扩增产物用 1 %琼
脂糖凝胶电泳检测结果 ,初步确定扩增产物弥散范围 ,
从而确定预扩增产物的最佳稀释倍数。
选择性扩增产物用 6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测结果 ,确定扩增条带的多态性。
11215 　选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 　
经琼脂糖电泳检测扩增产物有弥散条带即为扩增成
功 ,在扩增成功的选择性扩增产物中加入等体积的甲
806 核　农　学　报 22 卷
酰胺上样缓冲液 [ 98 %去离子甲酰胺 ,10mmolΠL EDTA
(pH810) ,0125 %溴酚蓝 ,0125 %二甲苯氰 ]充分混匀 ,
95 ℃变性 5min 后 ,立即冰浴。
将 6 %的聚丙烯酰胺变性胶 80W 恒功率预电泳
30min 后 ,取 7μl 变性混合液上样 , 60W 恒功率电泳至
二甲苯氰距胶下缘 1Π4 处停止电泳。银染显色 ,X 光
胶片观察灯下 ,目测统计结果。
2 　结果与分析
211 　总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
目前提取 RNA 的常用方法有异硫氰酸胍法[9 ,10 ] 、
Trizol 试剂盒、热酚法[11 ] 等 ,由于果树中含有大量的多
糖和多酚等物质[12 ] ,用以上方法很难获得高质量的
RNA。因此本试验采用改进的 CTAB 法提取 RNA ,经
紫外分光光度计测定 ,样品总 RNA 的 OD260ΠOD280值介
于118～210 之间 ,OD260ΠOD230 大于 210 ,说明样品总
RNA 的纯度较高 ;且条带清晰整齐 (如图 1) ,总 RNA
　　　
图 1 　总 RNA 电泳图
Fig. 1 　Electrophoresis of total RNA
的完整性较好。
本试验的 cDNA 在 300bp 至 118kb 的范围呈弥散
分布 ,表明反转录成功 ,符合进一步试验的需要。合成
的 ds2cDNA 经进一步纯化后符合 cDNA2AFLP 技术要
求。
212 　酶切时间对酶切效果的影响
结果表明酶切 2h 不完全 ,酶切 4h 与酶切 8 和 12h
均可以将 cDNA 切开 ,且差异不显著。不同酶切时间
产物与接头连接后预扩增产物电泳结果也显示 (图
2) ,酶切 4h 与酶切 8 和 12h 的预扩增产物差异不显
著 ,故最终确定采用 37 ℃酶切 4h。
图 2 　连接产物稀释不同倍数预扩增电泳图
Fig. 2 　Electrophoresis of the products preamplificated from ligation products diluted differently
1、2、3 :酶切 4h 产物连接后预扩增产物 ;4、5、6 :酶切 8h 产物连接后预扩增产物 ;7、8、9 :酶切 12h 产物连接后预扩增产物。
1、4、7 : 不同酶切时间产物连接后原液的预扩增产物 ;2、5、8 : 不同酶切时间产物连接后稀释 10 倍的预扩增产物 ;
3、6、9 : 不同酶切时间产物连接后稀释 20 倍的预扩增产物。
Lane 1 ,2 ,3 : the preamplification products after 4h digestion ;lane 4 ,5 ,6 : the preamplification products after 8h digestion ;
lane 7 ,8 ,9 :the preamplification products after 12h digestion. Lane 1 ,4 ,7 :the preamplification products amplified from
ligation products without dilution ; lane 2 ,5 ,8 :102times dilution ; lane 3 ,6 ,9 : 202times dilution
213 　连接产物稀释倍数对预扩增的影响
本试验采用的是 EcoRI + 0ΠMseI + C 的引物组合 ,
并对影响预扩增反应的关键因子连接产物的稀释倍数
进行了优化 ,图 2 为预扩增的电泳结果 ,可见连接产物
原液的预扩增产物弥散范围较宽 ,且扩增信号较强 ,一
致性较好 ,说明预扩增效果较好 ,为选择性扩增提供了
良好的模板。
214 　选择性扩增的影响因素
为了使选择性扩增产生清晰、稳定的条带 ,将预增
扩产物的原液及其 10、20 和 30 倍的稀释物分别作为
模板进行选择性扩增。结果表明 (图 3) ,预扩增产物
稀释 20 倍后进行选择性扩增 ,其产物集中在 100～
750bp 之间 ,适合做 cDNA2AFLP 分析。 图 3 　选择性扩增电泳图Fig. 3 　Electrophoresis of selective amplification1 :预扩增产物原液的选扩产物 ;2 :预扩增产物稀释10 倍的选扩产物 ;3 :预扩增产物稀释 20 倍的选扩产物 ;4 :预扩增产物稀释 30 倍的选扩产物Lane 1 :selective amplification products amplified from preamplificationproducts without dilution ;lane 2 :102times dilution ;lane 3 :202times dilution ;lane 4 :302times dilution
906　4 期 珠眉海棠 cDNA2AFLP 分析体系的建立
　　引物中选择性碱基的数目也直接影响扩增条带的
数目。本试验采用带 3 个选择性碱基的引物 , 扩增条
带数目适中 ,分布均匀 ,适于 cDNA2AFLP 分析 (如图 4) 。
图 4 　选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig. 4 　Polyacrylamide gel electrophoresis of
the selective amplification products
3 　讨论
311 　总 RNA 的提取
cDNA2AFLP 分析对 RNA 的要求很高 ,因此提取高
质量的 RNA 是该技术成功的关键之一[13 ] 。苹果叶片
多糖类物质和酚类化合物含量较高 ,酚类化合物极易
被氧化成醌类物质 ,与 RNA 不可逆地结合 ,影响 RNA
的分离纯化。多糖的许多理化性质与 RNA 相似 ,在提
取过程中能与 RNA 形成共沉淀 ,很难将它们分开。高
浓度的 PVP 在提供的还原条件下 ,与多酚化合物结
合 ,阻止酚氧化成醌类物质 ,防止 RNA 与醌类物质的
结合 ,同时还能有效去除多糖 ,提高 RNA 的纯度。β2
巯基乙醇可打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活 ,
从而防止多酚类被氧化。因此 ,本试验用改进的 CTAB
法 ,在提取缓冲液中加入 PVP 和β2巯基乙醇 ,所提取
的总 RNA 的纯度及完整性都很高 ,符合 cDNA2AFLP
分析要求。
312 　酶切时间对酶切效果的影响
cDNA2AFLP 技术是对双链 cDNA 酶切片段进行选
择性扩增 ,为了使酶切片段大小分布均匀 ,常采用两种
限制性内切酶 :一种酶的识别位点为 4 个碱基 ,另一种
酶的识别位点为 6 个碱基。本试验采用 MseI 和 EcoRI
这两种限制性内切酶。
酶切时间长短与酶切是否完全密切相关。酶切时
间过短 ,酶切不完全 ,双链 cDNA 的不完全酶切产物扩
增后会出现额外的高分子量的带型 ,重复性差[14 ] ;酶
切时间过长会导致双链 cDNA 的降解。本试验证明
37 ℃酶切 4h ,可保证双链 cDNA 充分酶切 ,满足 cDNA2
AFLP 分析的要求。
313 　连接产物稀释倍数对预扩增的影响
用于预扩增的连接产物量直接影响预扩增的严谨
度和效率 ,模板浓度过高会引起非特异性扩增 ;稀释倍
数过大 ,PCR 产物过少 ,影响统计分析。因此本试验分
别以连接产物原液及其 10 倍、20 倍稀释物作为预扩
增的模板 ,结果发现采用连接产物原液作模板 ,预扩增
产物弥散范围较宽 ,扩增信号较强 ,一致性较好 ,说明
预扩增效果较好。
314 　选择性扩增的影响因素
预扩增产物稀释倍数对扩增结果的影响很大 :稀
释倍数太大 ,扩增条带减弱 ;稀释倍数太小 ,引物或
dNTP 过早被耗尽 ,底物过量扩增 ,扩增结果不稳定 ,导
致实验结果重复性差 ,影响带型统计分析。
应用本试验建立和优化的珠眉海棠 cDNA2AFLP 体
系 ,对部分选择性扩增产物进行电泳及银染检测 ,得到
了带纹清晰、扩增信号强度基本一致、重复性强的结果 ,
说明该体系适于进行珠眉海棠的 cDNA2AFLP 分析。
参考文献 :
[ 1 ] 　Bachem C W B ,Van der Hoeven R S ,De Bruijn S M. Visualization of
differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting
based on AFLP : analysis of gene expression during potato tuber
development . Plant J , 1996 ,9 (5) :745～7531
[ 2 ] 　李　娜 ,焦　浈 ,秦广雍. DNA 分子标记技术及其在小麦育种及
遗传研究中的应用. 核农学报 ,2005 ,19 (3) :322～327
[ 3 ] 　陈桂平 ,马闻师 ,黄占景 ,沈银柱. 小麦耐盐突变体盐胁迫下
SIR73 基因片段的分离和鉴定. 遗传 ,2003 ,25 (2) :173～176
[ 4 ] 　Campalans A ,PagesM ,Messeguer R. Identification of differentially expressed
genes by the cDNA2AFLP technique during dehydration of almond ( Prunus
amygdalus) . Tree Physiol ,2001 ,21(10) :633～643
[ 5 ] 　武玉清 ,刘录祥 ,郭会君 ,赵林姝 ,赵世荣. 小麦苗期耐盐相关性
状的 QTL 分析. 核农学报 ,2007 ,21 (6) :545～549
[ 6 ] 　顾　良 ,赵惠祥 ,马继龙 ,周绍武. 珠美海棠对盐碱地适应范围及
应用. 天津农学院学报 ,1996 ,3 (3) :48～52
[ 7 ] 　耿　建 ,常新文 ,佘永杰. 耐盐碱植物—珠眉海棠的离体快繁技
术. 现代农业科技 ,2007 ,17
[ 8 ] 　张玉刚 ,成建红 ,韩振海 ,许雪峰 ,李天忠.小金海棠总 RNA提取方法
比较及 cDNA的LD2PCR扩增.生物技术通报 ,2005 ,4 :50～53
[ 9 ] 　Chomczynski P ,Sacchi N. Anal Biochem ,1987 ,162 (1) :156～159
[10 ] 　张玉进 ,孟祥春 ,潘瑞炽 ,王小菁. 非洲菊花瓣总 RNA 提取方法的
改进. 植物学通报 ,2001 ,18 (6) :722～726.
[11 ] 　郑　军. 玉米幼苗水分胁迫相关基因的克隆与分析. 中国农业大
学博士毕业论文 ,2004
[12 ] 　曹秋芬 ,孟玉平 ,孙 　毅. 苹果属植物总 RNA 有效、快速提取方
法. 农业生物技术学报 ,2003 ,11 (4) :428～429.
[13 ] 　孙涌栋 ,李贞霞 ,张兴国 ,陈碧华 ,李新峥. 黄瓜 cDNA2AFLP 分析
体系的建立. 华北农学报 ,2007 ,22 (4) :116～119
[14 ] 　Goto Yamamoto N ,Effect of concentration of restriction enzyme on AFLP
analysis in grape ,and differentiation of ’Pinotn oir’a nd ’pinot blanc’by
AFLP analysis. Japan Soc Hort Sci ,1998 ,67 :83～88
016 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (5) :607～610