全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 062798205
EMS 诱发草莓不同组培材料的耐盐性变异
刘艳萌1 　张学英1 　葛会波2
(11 河北农业大学 ,河北 保定　071001 ;21 河北省林业局 ,河北 石家庄　050081)
摘 　要 :以全明星草莓花药诱导的愈伤组织以及组培苗叶片为试验材料 ,用化学诱变剂甲基磺酸乙酯
( EMS)进行诱变处理。结果表明 ,愈伤组织诱变处理的适宜浓度与时间组合为 011 % + 115h 和 012 % +
110h ,而 (012 %～014 %) + (110～210h)可作为离体叶片诱变处理的适宜浓度和时间范围。与离体叶片
诱变相比 ,草莓花药的愈伤组织对诱变剂 EMS 更为敏感。通过对再生植株的耐盐性进行比较发现 ,愈
伤组织诱变筛选植株的盐害率和盐害指数低于离体叶片诱变筛选植株 ,说明愈伤组织较组培苗叶片更
适于作为草莓耐盐诱变育种的起始材料。
关键词 :草莓 ; EMS ;愈伤组织 ;组培苗 ;耐盐性
THE VARIATION OF SALT TOLERANCE INDUCED BY EMS FROM DIFFERENT
STRAWBERRY TISUES
LIU Yan2meng 　ZHANG Xue2ying 　GE Hui2bo
(11Agricultural University of Hebei , Baoding , Hebei 　071001 ;21 Forestry Bureau of Hebei Province , Shijiazhuang , Hebei 　050081)
Abstract :The optimum concerntration of EMS was studied for mutagenesis of salt tolerance under another callus and leaf of
strawberry in vitro culture. The results showed that the best combination of EMS concerntration and treatments time for callus
was 011 % + 115h and 012 % + 110h ; for leaf were (012 %～014 %) + (110～210h) ,respectively. It was found that the
callus was more sensitive to EMS , The salt injury index and rate of regenerated plant from callus were lower than that from
leaf , so the another callus was more suitabe for salt tolerance mutants.
Key words :strawberry ; EMS ; callus ; plantlets ; salt tolerance
收稿日期 :2008203219 　接受日期 :2008206203
基金项目 :河北农业大学 9816、博士启动基金 (200501)
作者简介 :刘艳萌 (19802) ,女 ,河北满城人 ,硕士 ,主要从事果树生物技术研究。E2mail :lymm
-
80 @sina. com
通讯作者 :张学英 (19722) ,女 ,河北迁西人 ,博士 ,副教授 ,主要从事果树生物技术研究。E2mail :zhxy97421 @yahoo. com. cn　　草莓是蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物 ,其浆果芳香多汁 ,营养丰富 ,在世界各种浆果中其栽培面积和产量居第 2 位。但是草莓对盐敏感 ,盐渍环境使草莓生长受到严重影响[1 ] 。因此草莓耐盐品种的选育 ,将对草莓的种植具有重要意义。植物组织培养技术与诱变育种相结合为耐盐育种开辟了一条新途径 ,它能有效避免嵌合体的形成和二倍体的选择 ,具有不受环境条件限制、节省大量人工财力和时间 ,能扩大变异谱、提高变异率等优点[2 ] 。1972 年Melcher 首次讨论了植物组织培养技术用于筛选耐盐突变体的优越性[3 ] , 随后 ,Zenk 又利用该技术获得耐盐细胞系[4 ] 。此后关于离体培养筛选植物耐盐突变体的研究逐年增加 ,研究的植物种类已近 40 种[5 ] 。但在离体条件下 ,通过诱变技术筛选草莓耐盐突变体的研究还未见报道。本试验以草莓品种全明星的花药愈伤组织及组培苗叶片为试材 ,用化学诱变剂甲基磺酸乙酯 ( EMS) 进行诱变处理 ,研究了不同离体组织对诱变剂的敏感性差异 ,并对不同诱变处理再生植株的耐盐性差异进行了比较 ,为进一步研究草莓耐盐突变体提供参考依据。
897　 核 农 学 报　2008 ,22 (6) :798～802Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1 　材料与方法
111 　材料
草莓品种全明星 (All Star)组培苗取自河北农业大
学园艺学院生物技术实验室 ;全明星草莓未成熟花蕾 ,
取自河北满城。诱变剂 :烷化剂 EMS 由美国 SIGMA 公
司生产。
112 　试验方法
11211 　基本培养基 　MS 培养基 ,附加蔗糖 30gΠL ,琼
脂粉 6gΠL ,植物生长调节剂在灭菌前加入培养基中 ,
pH值调至 518 ,在 121 ℃下高压蒸汽灭菌 20min。
11212 　试材预处理　取全明星草莓未成熟花蕾 ,用流
水冲洗后 ,置于铺有湿润滤纸的培养皿中 ,4 ℃预处理
48h。在超净工作台上 ,将花蕾放入 70 %乙醇中消毒
30s ,再转入 011 %HgCl2 溶液中消毒 7 - 9min ,无菌水冲
洗 3～4 次 ,剥取花药接种 ,每瓶接种 20～30 个花药 ,3
次重复。
11213 　愈伤组织诱导培养　诱导培养基为 MS + NAA
014 mgΠL + BA 210 mgΠL。接种后放入培养室进行暗培
养 ,2 周后移至光下培养。
11214 　EMS 诱变处理愈伤组织及离体叶片
1121411 　EMS 溶液浸泡处理愈伤组织 　取 011molΠL、
pH710 的磷酸缓冲液分装于 50ml 三角瓶中 ,高压灭
菌。用无菌枪头吸取抽滤灭菌的 EMS 原液加入到缓
冲液中 ,分别配成 011 %、012 %、013 %、014 %的 EMS 处
理液 ,以不加 EMS 的磷酸缓冲液为对照。选取继代培
养 15 - 20d 左右的新鲜愈伤组织 ,放入配制好的 EMS
溶液中 ,分别处理 015、110、115 和 210h (浸泡期间置于
摇床以 60rΠmin 的转速不停摇动 ,下同) ,之后用无菌水
冲洗干净 ,接种于再生培养基 (MS + TDZ310mgΠL +
NAA011mgΠL)上。共 20 个处理 ,每处理 5 瓶 ,每瓶接种
10 块愈伤组织。接种 50d 后统计愈伤组织的存活率
和再生率 ,从中选择 EMS 处理草莓花药愈伤组织适宜
的浓度。
1121412 　EMS 溶液浸泡离体叶片 　用 011molΠL、
pH710 的磷酸缓冲液 , 同上方法分别配制 011 %、
012 %、014 %、016 %的 EMS 处理液 ,以磷酸缓冲液为对
照。在继代培养 30d 左右的组培苗上选取新生小叶 ,
每叶用解剖刀横切数刀 ,作为一个接种单位叶盘[6 ] ,置
于 EMS 溶液中 ,分别浸泡 015、110、210 和 410h ,之后用
无菌水冲洗 3～5 遍 ,接种于叶片再生培养基 (MS +
TDZ110mgΠL + NAA0105mgΠL) 中。共 20 个处理 ,每处
理 5 瓶 ,每瓶接种 10 个叶盘。暗培养 15d 后移至光下
培养。叶盘接种 25d 后将芽丛进行切分 ,转至继代培
养基 (MS + BA 015mgΠL + IBA 011mgΠL + GA 0105mgΠL)
中。接种 50d 后进行数据调查。
存活率 ( %) = 存活块数 (叶盘数)Π接种总块数
(叶盘数) ×100 %
再生率 ( %) = 再生不定芽愈伤组织块数 (叶盘
数)Π接种总块数 (叶盘数) ×100 %
11215 　NaCl 胁迫处理　用筛选出的 EMS 适宜浓度和
时间再分别对各离体组织进行批量处理 ,将再生植株
转入继代培养基中扩繁 2 代后 ,转入含临界浓度 017 %
NaCl [7 ]的继代培养基进行耐盐筛选。筛选 2 代后 ,为
消除其对盐的适应性 ,在普通继代培养基中再培养 1
代 ,然后挑选健壮单株接种于含 017 %NaCl 的继代培
养基上。NaCl 胁迫 40d 时 ,调查各诱变处理再生植株
的受害情况 ,对植株的耐盐性差异进行比较。
盐害率 ( %) = 受害株数Π总株数 ×100 %
盐害指数 = [ ∑(盐害级值 ×株数) ] ×100Π(盐害
最高级值 ×总株数)
2 　结果与分析
211 　愈伤组织的培养
图 1 　易于再生的草莓花药愈伤组织类型
Fig. 1 　The type of strawberry anther
callus which is easy to regenerate
花药自接种后 10 - 12d 开始脱分化 ,出现愈伤组
织 ,30 - 40d 达到高峰期 ,诱导率可达到 8215 % ,之后
产生量逐渐减少。愈伤组织首先在花丝断口处出现 ,
有的从药壁产生 ,有的整个花药愈伤化。一般 1 个花
药产生 1 块愈伤组织。多数愈伤组织的形态特征为淡
绿色 ,块状或颗粒状 ,致密干燥 ,块状的表面有小突起
(图 1) ,经镜检观察 ,细胞多为近圆形 ,内含物较多 ,细
胞之间联系紧密。周春江、李卫东[8 ,9 ] 等曾报道 ,此种
类型的愈伤组织容易再生成植株。也有少数愈伤组织
997　6 期 EMS诱发草莓不同组培材料的耐盐性变异
呈浅黄色和灰白色 ,质地松软湿润 ,且易发生褐变。当
愈伤组织长至 3mm 左右时 ,将质地致密、色泽鲜明的
淡绿色愈伤组织转入愈伤组织继代培养基 (MS + 2 ,4
- D 015mgΠL + NAA 015mgΠL + ZT 011mgΠL)中进行继代
培养。
212 　EMS 对不同组培材料再生植株的影响
21211 　EMS 对愈伤组织再生植株的影响 　化学诱变
剂 EMS 的浓度与处理时间对愈伤组织损伤程度有很
大影响 (表 1) 。低浓度短时间的处理组合对愈伤组织
的损伤较小 ,随着处理浓度的增加和处理时间的延长 ,
对愈伤组织的存活率和再生率的影响也逐渐加大。
014 % + 210h 处理组合是愈伤组织的致死剂量 ,经处理 的愈伤组织在转入再生培养基后颜色慢慢变为黑褐色 ,随后逐渐死亡。011 % + 210h 和 012 % + 115h 的处理组合对愈伤组织生长的抑制作用分别达到了4912 %和 4817 % ,基本为半致死剂量 ,但在该浓度下 ,仅有很少一部分愈伤组织能够再生植株 ,再生率分别为 311 %和 412 %。而在 011 % + 115h 和 012 % + 110h的处理组合下 ,愈伤组织的存活率比半致死剂量下提高了将近 20 % ,而再生率则提高了 3 倍左右。因此 ,综合考虑存活率与再生率双重因素 ,认为 011 % + 115h和 012 % + 110h 是 EMS 诱变草莓花药愈伤组织的适宜处理组合 (图 2) 。
表 1 　EMS对草莓花药愈伤组织再生植株的影响
Table 1 　Effect of EMS on regeneration of anther callus of strawberry ( %)
时间
time
(h)
CK
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
EMS浓度
EMS concentration ( %)
011 012 013 014
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
015 100a 3215a 9014a 2114a 8513a 1711a 6514a 516a 3516a 111a
110 100a 3018ab 8512b 1514b 6918b 1114b 4812b 118b 1718b 0b
115 100a 2914b 6715c 918c 5113c 412c 2517c 0c 915c 0b
210 100a 2615c 5018d 311d 2015d 0d 1116d 0c 0d 0b
注 :表中数据的差异显著性采用LSD 法进行测验 ,相同字母表示差异不显著。下表同。
Note : The LSD method was used for analyzing data in the table. The same letter means no significant difference. The same as following tables.
图 2 　012 % + 115h EMS溶液处理下草莓
花药愈伤组织再生情况
Fig. 2 　The regeneration of strawberry anther
callus treated with EMS solution (012 % + 115h)
21212 　EMS 对离体叶片植株再生的影响 　研究结果
表明 (表 2) :经诱变处理的草莓组培苗离体叶片存活
率和再生率均低于对照 ,并且随 EMS 浓度的升高和处
理时间的延长而下降。016 %的 EMS 溶液处理 4h 是
叶片致死浓度和时间的处理组合。EMS 对叶片再生的
抑制作用明显强于对叶片存活的影响。一般在诱变育
种中 ,通常以半致死剂量作为最佳剂量 ,但在实际应用
中还要考虑到诱变剂对培养材料的损伤 ,若诱变剂浓
度较高 ,处理时间较长 ,会产生严重的损伤 ,失去选择
机会 ;而浓度较低 ,处理时间短 ,则不会产生明显的变
异 ,不利于耐盐变异体的筛选。因此 ,综合考虑叶片存
活率和再生率两方面因素 , 本试验确定 ( 012 %～
014 %) + (110～210h) 为 EMS 诱变草莓组培苗离体叶
片的适宜浓度和时间范围 (图 3) 。
图 3 　012 % + 2h 的 EMS溶液处理下草莓叶片的再生情况
Fig. 3 　The regeneration of strawberry
leaf treated with EMS solution (012 % + 2h)
008 核　农　学　报 22 卷
表 2 　EMS对草莓离体叶片再生的影响
Table 2 　Effect of EMS on regeneration of Stra wberry leaves in vitro ( %)
时间
time
(h)
CK
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
EMS浓度 EMS concentration ( %)
011 012 014 016
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
存活率
survival
rate
再生率
regeneration
rate
015 100a 71143a 100a 63164a 100a 52117a 100a 45112a 100a 41167a
110 100a 65145ab 100a 61182a 100a 42175b 77155b 31125b 75186b 0100b
210 100a 59146bc 100a 60100a 82159b 33133c 69170c 0100c 8133c 0100b
410 100a 53166c 100a 48148b 70172c 5141d 5171d 0100c 0100d 0100b
213 　不同离体材料对诱变剂敏感性的差异
以上结果表明 ,愈伤组织 EMS 诱变处理的适宜浓
度为 011 % + 115h 和 012 % + 110h ,显著低于离体叶片
的适宜诱变浓度 (012 %～014 %) + (110h～210h) 。说
明草莓花药愈伤组织对诱变剂 EMS 更为敏感。
214 　诱变再生植株对 NaCl 胁迫的耐受性
由表 3 可以看出 ,NaCl 胁迫 40d 时 ,对照植株的盐
害率及盐害指数最高 ,表明受害最严重。经 EMS 诱变
处理的离体叶片再生植株的受害程度次之 ,花药愈伤
组织再生植株的盐害症状最轻 ,对盐渍环境的耐受性
最强。
表 3 　NaCl 胁迫对诱变再生植株受害率和受害指数的影响
Table 3 　Effect of NaCl stress on injury rate and
injury index of regenerative plantlets
材料处理
material
盐害最高级别
highest degree of
salt injury
盐害最低级别
lowest degree
of salt injury
级值
grade
value
株数
No. of
plant
级值
grade
value
株数
No. of
plant
盐害指数
salt injury
index
盐害率
salt injury
ratio ( %)
CK 5 4 1 15 0148 100
叶片 leaf 5 1 0 4 01385 90
愈伤 callus 4 4 0 10 01358 75
注 :植株盐害分级标准[10 ]为 ,0 级 :无盐害症状 ;1 级 :轻度盐害 ,约 1Π3
的叶尖和叶缘呈失水萎蔫状 ;2 级 :中度盐害 ,约 1Π2～2Π3 的叶尖和叶缘
失水萎蔫并有焦枯 ;3 级 :重度盐害 ,2Π3 以上的叶尖及叶缘焦枯面积约
达 1Π3 ;4 级 :极重度盐害 ,所有叶片的叶尖及叶缘焦枯面积达 1Π2 以上 ;5
级 :植株叶全部枯死。
Note : The standard of salt injury is graded into 6 grades : [10 ] level : Zero no
symptoms ; grad one : slight salt injury , about 1Π3 leaf tip and margin dehydrated
as wilting ; grad two : medium salt injury , about 1Π2～2Π3 leaf tip and margin
dehydrated as wilting and even drying out ; grade three :severe salt injury , more
than 2Π3 leaf tip and margin dried out about 1Π3 ; grade fours : extreme severe salt
injury , all of the leaf tip and margin dried out more than 1Π2 ; grade five : all
leaves of the plant died.
3 　讨论
诱变材料的选择在离体诱变育种中占有重要地
位 ,首先应从育种的目的出发 ,选用合适的基因型 ,同
时考虑离体材料再生植株的难易。有研究表明 ,植物
生殖器官的敏感性高于营养器官 ,这可能与细胞的分
化程度有关。不同组织之间 ,分生组织的敏感性大于
成熟组织。一般来讲原生质体 > 性细胞 (花粉等) > 悬
浮细胞 > 愈伤组织 ,但林音[11 ] 等在对菊花不同器官的
辐射敏感性进行研究时发现 ,其敏感性次序为 :叶 > 茎
> 愈伤组织 > 丛生芽 > 生根小苗 > 扦插枝条 > 种子 ,
并且各器官之间的辐射敏感性差异最大可达 20 倍左
右。梁国平[12 ] 等对红掌的不定芽和愈伤组织进行辐
射诱变时 ,发现愈伤组织对射线更为敏感。此外 ,郭建
辉[13 ]等研究发现 ,不同大小的天宝香蕉组培芽尖及其
纵切分离体对辐射的敏感性也有明显差异。本试验分
别对全明星草莓花药诱导的愈伤组织以及离体叶片进
行 EMS 诱变处理 ,结果表明 ,花药愈伤组织对诱变剂
更为敏感 ,与多数研究者所得结论一致。
自 1953 年 Klmaek 首次报告了 EMS 对突变诱导的
有效性[14 ]以来 ,EMS 作为植物最有效的化学诱变剂之
一 ,已成功地应用于多种植物的诱变育种 [3 ,15 - 22 ] 。
EMS 的诱变效应可用两高一广来评价 ,即效率高、频率
高和范围广[23 ] 。EMS 诱变产生点突变的频率较高 ,而
染色体畸变相对较少 ,可以对植物的某一种特殊性状
进行改良。与其他诱变剂相比 , EMS 诱变后不仅产生
的突变频率高 ,而且多为显性突变体 ,便于突变体的筛
选[24 ] 。本试验利用 EMS 对离体培养的全明星草莓进
行诱变处理 ,分别得出了离体叶片和花药愈伤组织的
适宜诱变浓度 ,并获得了具有一定耐盐性的初选植株 ,
可为以后利用组织培养和诱变育种相结合的手段选育
草莓新品系提供有效途径。
108　6 期 EMS诱发草莓不同组培材料的耐盐性变异
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