全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 03236926
水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究
刘宝业1 ,2 　梁国鲁2 　张增艳1
(1. 中国农业科学院作物科学研究所 ,农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 ,北京　100081 ; 2. 西南大学园艺园林学院 重庆　400716)
摘 　要 :利用 RT2PCR 反应 ,从纹枯菌诱导的水稻叶片 cDNA 中克隆了 1 个水稻几丁质酶基因 RC7 的全
长编码序列 (ORF) 。通过亚克隆方法 , RC7 与原核表达载体 p GEX24T21 上的 GST 融合 ,构建成 GST2RC7
重组蛋白的原核表达载体 pGST2RC7 ,然后 ,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基2β2D2硫代半乳糖苷
( IPTG)诱导 ,获得了以包涵体形式高效表达的 GST2RC7。经过洗涤、溶解 (变性) 、复性及纯化等处理 ,包涵
体中 GST2RC7 蛋白得到溶解、复性和纯化。纯化的复性 GST2RC7 蛋白具有几丁质酶活性。对 6 种重要作
物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明 ,RC7 可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、
棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长 ,说明 RC7 可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。
关键词 :水稻几丁质酶基因 ;表达 ;蛋白质纯化 ;复性 ;体外抑制真菌活性
PROKARYOTIC EXPRESSION, REFOLDING AND ANTIFUNGAL ACTIVITY
OF A RICE CHITINASE in vitro
LIU Bao2ye1 ,2 　Liang Guo2lu2 　ZHANG Zeng2yan1
(1. National Key Science Facility of Crop Gene Resources and Gene Improvement , Institute of Crop Science , Chinese Academy of
Agricultural Sciences , Beijing 　100081 ; 2. College of Horticulture and Landscape Architecture , Southwest University , Chongqing 　400716)
Abstract :The full open2reading frame (ORF) sequence of a rice chitinase gene RC7 was isolated from the rice leaf cDNA
induced by Rhizoctonia solani through subclone method. The RC7 was fused in frame to the ORF of Glutathione S2transferase
(GST) in the prokaryotic expression vector p GEX24T21 , in which the new recombinant vector p GST2RC7 , containing the
recombinant protein GST2RC7 , was constructed. Then the p GST2RC7 vector was transformed into cells of Escherichia coli .
After induced by isopropyl2β2D2thiogalactoside ( IPTG) , the recombinant protein GST2RC7 was highly expressed in the form of
inclusion bodies. The protein GST2RC7 in the inclusion bodies could be solubilized , renatured and purified by a serial of
treatments , including washing , denaturing and renaturing as well as purification. The renaturation protein possessed chitinase
activity. The results of antifungal assay in vitro showed that the chitinase RC7 exerted significant inhibition to the mycelia
growth of Rhizoctonia solani ( rice sheath blight) , Rhizoctonia cerealis (wheat sharp eyespot) , Verticillium dahliae (cotton
wilt) , Fusarium graminearum (wheat scab) and Alternaria longipes (tobacco brown spot) . RC7 could be useful for enhancing
fungal resistance in several crop species.
Key words :rice chitinase gene ; expression ; protein purification ; renaturation ; antifungal activity in vitro
收稿日期 :2008210214 　接受日期 :2009201215
基金项目 :国家转基因生物重大专项课题 (2008ZX080022001)和重点课题
作者简介 :刘宝业 (19812) ,男 , 山东青岛人 ,在读硕士生 ,主要从事小麦抗病分子育种研究。
通讯作者 :张增艳 (19632) ,女 ,河北保定人 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事小麦抗病分子育种研究。Tel : 010282108781 ; E2mail : zhangzy @mail .
caas. net . cn
　　几丁质酶广泛存在于自然界的各种植物、昆虫、真
菌和细菌中[1 ,2 ] 。植物几丁质酶分布于植物的茎、叶、
种子及愈伤组织中。几丁质酶是以几丁质为底物的水
解酶 ,主要水解几丁质多聚体中的β21 ,42糖苷键 ,生成
963　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :369～374Journal of Nuclear Agricultural Sciences
N2乙酰氨基葡萄糖寡体或单体。有些几丁质酶还具有
溶菌酶活性或能催化转糖基反应。根据等电点不同 ,
几丁质酶被分为酸性或碱性几丁质酶。据水解切口位
置不同 ,又分为内切几丁质酶和外切几丁质酶 ,前者水
解位点为同聚物内部β21 ,4 连键 ,后者则水解同聚物
线性末端β21 ,4 连键。因真菌细胞壁均含有几丁质 ,
而植物缺乏几丁质 ,故几丁质酶在植物防御病原真菌
侵害中具有重要作用。几丁质酶主要通过水解真菌菌
丝生长点初细胞壁中的几丁质 ,引起真菌细胞壁变薄 ,
最终导致真菌细胞溶解[3 ,4 ] 。因此 ,几丁质酶基因被认
为是植物重要的防卫基因 ,广泛用于植物抗病基因工
程[4 ,5 ] 。Anuratha 等从接种水稻纹枯病菌 ( Rhizoctonia
solani)的水稻中分离出 1 个几丁质酶基因 RC7[6 ] 。
Datta 等将 RC7 基因转入水稻品种中 ,获得了对纹枯病
抗性提高的 RC7 基因超量表达的转基因水稻[7 ] 。
为明确 RC7 基因是否有用于其他植物抗病基因
工程的潜力 ,本试验利用原核表达系统表达 RC7 基
因 ,获得有活性的几丁质酶 ,进行体外抑菌研究。但在
高效率的原核表达系统中 ,由于缺乏转录后加工及辅
助肽链折叠的酶系 ,表达产物极易形成无活性的包涵
体 ,需要有效的复性方法。因此 ,本文还研究了包涵体
获得较高活性蛋白的复性方法。
1 　材料与方法
111 　材料
水稻品种南京 11 号种子由中国农业科学院作物
科学研究所万建民教授课题组惠赠 ;小麦纹枯病菌
( Rhizoctonia cerealis)引自江苏省农业科学院 ,水稻纹枯
菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌购自中国农
业科学院植物保护研究所 ,水稻稻瘟菌由中国农业科
学院作物科学研究所雷财林博士惠赠。
112 　方法
11211 　RC7 的原核表达载体的构建 　据 RC7 基因
(U02286)序列设计特异引物 ,序列为 F :5′2TAAGCATGT
CGACGCCGA23′, R : 5′2ACTGCTCCGCCAACCCAA23′。从
经水稻纹枯菌处理 24h 的水稻南京 11 号叶片中提取
RNA ,反转录合成 cDNA ,以该 cDNA 为模板扩增得到
RC7 基因。PCR 扩增程序 :94 ℃5min ,1 个循环 ;94 ℃
1min , 64 ℃ 35s , 72 ℃ 90s , 8 个循环 ; 94 ℃ 1min , 62 ℃
35s ,72 ℃90s ,28 个循环 ;72 ℃延伸 9min。
将回收的目的基因 RC7 连接到 pMD182T 载体进
行测序。用含 RC7 序列正确的质粒 DNA (模板) 和 1
对新引物 (5′端分别有 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ酶切位点) ,通过
PCR扩增的方法在 RC7 基因的两端分别添加 BamH
Ⅰ、Sal Ⅰ酶切位点。回收经过 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切
的 RC7 基因片段和 p GEX24T21 载体的目的片段 ,用 T4
连接酶将 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切的 RC7 基因片段连接
到经过 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ酶切处理的 p GEX24T21 载体
上 ,即将 RC7 基因与 p GEX24T21 上 GST表达序列 3′端
融合 ,构建成重组蛋白 GST2RC7 的原核表达载体 ,测
序正确的重组载体命名为 p GST2RC7。
11212 　p GST2RC7 在大肠杆菌中的表达 　将重组蛋白
的原核表达载体 p GST2RC7 质粒转化到大肠杆菌 BL21
(DE3)感受态细胞中。将过夜培养的菌液按 1∶50 的比
例转接至 5ml LB 液体培养基 (含 50μgΠml Amp ) 中 ,
225rΠmin、37 ℃震荡培养 2～3h ,OD600达到 016～018 时 ,
加 入 异 丙 基2β2D2硫 代 半 乳 糖 苷 ( isopropyl2β2D2
thiogalactoside , IPTG,终浓度为 1mmolΠL) 继续培养 4h。
菌液经 8000 rΠmin ,离心 10min ,弃上清液 ,将沉淀重悬
于 1Π10 倍培养体积的 PBS Buffer 中 ,超声裂解 ,离心 ,
各取上清液和沉淀 10μl ,加入等体积的 2 ×SDS2PAGE
上样缓冲液 ,进行 SDS2PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色 ,
观察结果。
11213 　诱导目的蛋白的大量表达　将含有 p GST2RC7
的大肠杆菌BL21 菌液接种于 5ml 含 50μgΠml 氨苄青霉
素的 LB 培养液中 ,37 ℃、225 rΠmin震荡培养过夜。将
菌液按 5 %接种于 500ml 上述 LB 培养液中 ,37 ℃、225
rΠmin震荡培养 2～3h ,至 OD600 达到 016～018 之间 ,加
入诱导剂 IPTG 至终浓度为 1mmolΠL ,继续震荡培养
4h ,离心收集菌体。每升发酵菌以 100ml PBS Buffer 重
悬 ,反复超声裂解 ,以彻底破碎细菌。将破碎好的菌液
于 4 ℃、12000rΠmin 离心 15min ,分别收集上清液和沉
淀 ,各取少量进行 SDS2PAGE分析。
11214 　包涵体的复性及纯化　按照参考文献 [8～11 ]
描述的相关方法 ,将破碎后离心收集的沉淀用 3 倍体
积的包涵体洗涤缓冲液 (10 mmolΠL Tris2HCl ,pH718 ,
300mmolΠL NaCl ,1mmolΠL Na2 EDTA , 1 % TritonX2100 和
3molΠL Urea) 洗涤 1 次 ,室温放置 5min ,离心 ,弃上清
液 ,收集沉淀 (包涵体) 。所得沉淀用无菌水洗涤 5 次 ,
每次洗涤后均于 4 ℃以 12000rΠmin 离心 10min。再用
10 倍体积的包涵体溶解缓冲液 ( 50mmolΠL Tris2HCl
pH718 , 5mmolΠL MgCl2 , 215mmolΠL β2mercaptoethanol ,
011 % Tween20 ,8molΠL Urea)溶解包涵体 ,室温放置 1h。
于 4 ℃以 12000rΠmin 离心 20min ,收集上清液。
将上述包涵体溶解液逐滴加入到含 L2精氨酸的
改进复性液中 (014molΠL L2Arginine (L2精氨酸) ,2mmolΠ
073 核　农　学　报 23 卷
L DTT ,015molΠL NaCl ,50mmolΠL Tris2HCl , pH810) ,不断
搅拌直至无白色沉淀 ,4 ℃,放置 24h ,以使溶解、变性
的蛋白能够复性。4 ℃,12000rΠmin 离心 10min ,取上清
液于 PBS 中透析 (4 ℃) 过夜 ,以去除复性液中的变性
剂。复性后的蛋白过柱纯化 (MicroSpinTM G250 columns ,
Amersham Biosciences) ,并保存于 - 80 ℃冰箱中待用。
11215 　蛋白浓度与酶活性的测定 　采用考马斯亮蓝
染料结合法[7 ]测定纯化的复性 GST2RC7 蛋白浓度 ,以
BSA(牛血清白蛋白) 作标准曲线。复性 GST2RC7 中几
丁质酶活性的测定 ,参考《现代植物生理学实验指
南》[12 ] 。
11216 　纯化蛋白的体外抑菌 　按照 Kirubakaran and
Sakthivel[8 ]描述方法 ,将不同病原真菌菌丝分别接种于
PDA 培养基的中央 ,25 ℃倒置暗培养 3d ,待菌丝长至 3
～4cm ,将纯化的复性 GST2RC7 加于测试菌块一处菌
丝的边缘 (图 52B、C) ,同时另外一处菌丝边缘加入 PBS
(图 52A)以及 GST(未显示) 作为阴性对照 ,继续 25 ℃
倒置暗培养 24～48h ,观察对这些真菌菌丝生长的抑
制效果 ,测定抑菌圈半径 , 重复 3 次。
在均匀涂布 GST2RC7 蛋白的 PDA 培养基与涂布
PBS Buffer 的 PDA 培养基上接种小麦纹枯菌菌核 ,置
于 25 ℃暗培养箱倒置培养。观察小麦纹枯菌菌核的
萌发情况。
2 　结果分析
211 　RC7 的获得与原核表达载体的构建
通过 RT2PCR 方法 ,从纹枯菌侵染的水稻叶片
cDNA 中扩增到 RC7 基因的 ORF 序列 (图 12A) ,并插
入到原核表达载体 p GEX24T21 上 ,获得重组蛋白 GST2
RC7 的原核表达载体 p GST2RC7。对经 BamH ⅠΠSal Ⅰ
双酶切的重组蛋白表达载体质粒 p GST2RC7 进行琼脂
糖凝胶电泳检测 ,结果如图 12B 所示。酶切片段大小
约 1kb ,与预期值相符。DNA 序列分析表明 ,所插入的
基因序列基本符合从 NCBI 核酸数据库所检索的 RC7
基因 cDNA 序列。上述结果说明 ,重组蛋白 GST2RC7
的原核表达载体已构建成功。
212 　重组蛋白 GST2RC7 的小量表达分析
SDS2PAGE电泳分析重组蛋白 GST2RC7 表达的小
量样品。结果表明 (图 2) ,经过 IPTG诱导 4h 后 ,含有
p GST2 RC7 的 E. coli BL21 培养物沉淀中明显有一条
约 60kD 的蛋白表达带 ,而含 p GEX24T21 对照培养物无
此 60kD 左右的蛋白带 ,说明经 IPTG诱导的大肠杆菌
细胞中 GST2RC7 基因得到了表达。但诱导表达的
图 1 　pGST2RC7 重组表达载体的构建
Fig. 1 　Construction of p GST2RC7 expression vector
A :水稻 RC7 基因的扩增产物 ;B :p GST2RC7 载体 DNA 的酶切片段
A :Amplification product of rice RC7 gene ;
B :The restriction digesting fragments of p GST2RC7 DNA
GST2RC7 完全分布在沉淀中 ,上清液中几乎没有 GST2
RC7 ,说明表达的 GST2RC7 以包涵体的形式存在。而
且不同的 IPTG浓度对表达量的影响不明显 ,最低浓度
为 011mmolΠL (图 3) ,表明一定范围内 , IPTG 浓度对
GST2RC7 蛋白的表达量没有影响。凝胶扫描分析表
明 ,目的蛋白质的表达产率约占总蛋白质的 50 %。
图 2 　在大肠杆菌中表达的 GST2RC7 重组
蛋白的 SDS2PAGE分析
Fig. 2 　SDS2PAGE analysis of GST2RC7 expression
in E. coli BL21 (DE3)
1、2 : 1mmolΠL IPTG 诱导含 p GEX24T21 细胞的沉淀和上清液 ; 3、4 :
1mmolΠL IPTG诱导含 p GEX2RC7 细胞的沉淀和上清液 ;M:蛋白质分
子量标准
1 ,2 :Precipitation and Supernatant of p GEX24T21 culture with 1mmolΠL IPTG
induction; 3 , 4 : Precipitation and supernatant of p GST2RC7 culture with
1mmolΠL IPTG induction ; M:Protein molecular weight marker
213 　重组蛋白 GST2RC7 的复性和纯化
采用 SDS2PAGE电泳分析包涵体中重组蛋白 GST2
RC7 被溶解、复性和纯化的效果 (图 4) 。结果表明 ,洗
涤后包涵体的纯度有了较大提高 ,有利于下一步的复
性与纯化。经过包涵体中蛋白的溶解与复性处理后 ,
复性 GST2RC7 蛋白的纯度得到进一步提高。如图 4 所
示 ,过柱纯化产物只有重组蛋白的单一条带 ,未见其他
173　3 期 水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究
图 3 　SDS2PAGE检测不同浓度 IPTG诱导
GST2RC7 蛋白表达的结果
Fig. 3 　SDS2PAGE analysis of GST2RC7 expression
induced by different concentrations of IPTG
1、2 :未诱导 p GST2RC7 细胞的沉淀和上清 ;3、4 :011mmolΠL IPTG诱导
含 p GST2RC7 细胞的沉淀和上清 ;5、6 :015mmolΠL IPTG诱导含 p GST2
RC7 细胞的沉淀和上清 ;7 :蛋白质分子量标准 ;8、9 :1mmolΠL IPTG诱
导含 p GST2RC7 细胞的沉淀和上清 ; 10、11 : 1mmolΠL IPTG 诱导含
p GEX24T21 细胞的沉淀和上清
1 ,2 :Precipitation and supernatant of p GST2RC7 without IPTG induction ; 3 ,
4 :Precipitation and supernatant of p GST2RC7 after induction with 011mmolΠL
IPTGfor 4h ;5 ,6 :Precipitation and supernatant of p GST2RC7 after induction
with 015mmolΠL IPTG for 4h ; 7 : Protein molecular weight marker ; 8 , 9 :
Precipitation and supernatant of p GST2RC7 after induction with 1mmolΠL
IPTGfor 4h ;Lane 10 ,11 : Precipitation and supernatant of p GEX24T21 after
induction with 1mmolΠL IPTGfor 4h
图 4 　原核表达、复性、纯化的 GST2RC7 蛋白
Fig. 4 　GST2RC7 protein was expressed ,
refolded and purified
1、2 :011mmolΠL IPTG诱导 p GST2RC7 培养物的上清液和沉淀 ;
M:蛋白质分子量标准 ;3 :洗涤的包涵体 ;4 :复性的蛋白 ;
5 :纯化的蛋白
1 ,2 :Supernatant and precipitation of p GST2RC7 after induction
with 011mmolΠL IPTG; M:Protein molecular weight marker ; 3 :Washed
inclusion bodies ; 4 :Refolded protein ;5 :Purified protein
条带 ,说明已得到纯化的目的蛋白 ,应该是重组蛋白
GST2RC7 ,因为使用的亲和纯化柱只会纯化、洗脱出含
GST的蛋白。
几丁质酶活性测定结果表明 ,纯化的目的蛋白确
实具有几丁质酶活性 ,而纯化的 GST则没有几丁质酶
活性 ,进一步证明纯化的目的蛋白确实为 GST2RC7。
214 　体外抗菌活性
测试了纯化的 GST2RC7 对 6 种重要作物病原真菌
菌丝生长的影响。结果如图 5 所示 ,PBS 液加样处周
围的真菌能正常生长 (图 52A) ,而加含 018 单位 (U) 和
116 单位 (U) 几丁质酶的 GST2RC7 加样处周围 (图 52
B、C)的小麦纹枯菌、水稻纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄
萎菌、烟草赤星的菌丝生长受到了明显抑制 ,形成了较
显著的抑菌圈 ,如对小麦纹枯菌的抑菌半径平均为
112cm (018U 几丁质酶)和 210cm (116U 几丁质酶) ,对
水稻纹枯菌的抑菌半径平均为 210cm(018U 几丁质酶)
和 412cm(116U 几丁质酶) , 而源于 p GEX24T21 培养液
的 GST 对上述 6 种农作物病原真菌没有任何抑制作
用 ,表明 RC7 对 5 种病原真菌具有抑制作用 ,其中对
水稻纹枯菌、小麦纹枯菌抑制作用最强 ( + + + + ) ,对
小麦赤霉菌 ( + + + ) 、烟草赤星菌 ( + + + ) 抑制作用
次之 ,对棉花黄萎菌 ( + )抑制作用最弱 ,但对水稻稻瘟
菌无抑制作用 ( - ) 。
在均匀涂布纯化的 GST2RC7 (116 单位几丁质酶)
的 PDA 培养基 (图 62B) 上接种小麦纹枯菌菌核 ,无几
丁质酶的 PDA 培养基上 (图 62A)同样也接种小麦纹枯
菌菌核 ,置于 25 ℃暗培养箱倒置培养。结果表明 ,在
加有该蛋白的培养基上 ,小麦纹枯菌在接种 48h 后仍
没有生长 ,说明纯化的几丁质酶抑制小麦纹枯菌菌核
的萌发 ,进一步证明该几丁质酶 RC7 对小麦纹枯菌具
有抑制作用。
3 　讨论
本研究结果表明 ,纯化的水稻几丁质酶 RC7 对水
稻纹枯菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草
赤星菌等 5 种病原真菌具有较强的抑制作用 ,表明该
几丁质酶对植物病原真菌的拮抗作用具有一定的广谱
性 ,可作为上述植物病害抗性分子育种的重要候选基
因 ,也可能被人们用来构建转几丁质酶基因的生防工
程菌应用于农业生产。但是 RC7 蛋白对水稻稻瘟菌
无抑制作用 ,说明水稻纹枯菌和水稻稻瘟菌的细胞壁
结构及致病机制有所不同。
为了得到大量表达的目的蛋白 ,本研究将 RC7 基
因的完整编码序列插入到原核表达载体 p GEX24T21 的
多克隆位点中 ,构建成重组蛋白 GST2RC7 的原核表达
载体。测序分析表明 ,目的基因 RC7 的读码框正确 ,
原核表达载体构建是成功的。将构建好的重组载体转
化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中 ,用 IPTG诱导 GST2
273 核　农　学　报 23 卷
　　
图 5 　几丁质酶 RC7 对不同病原菌的抑制作用
Fig. 5 　Inhibitory activity of the rice chitinase RC7 to different pathogenic fungi
1 :小麦纹枯菌 ;2 :水稻纹枯菌 ;3 :小麦赤霉菌 ;4 :棉花黄萎菌 ;5 :烟草赤星菌 ;6 :稻瘟菌 ;
A :PBS对照 ;B :018U RC7 蛋白 ;C :116U RC7 蛋白
1 : R . cerealis ; 2 : R . solani ; 3 : F. graminearum ; 4 : V . dahliae ; 5 : A . alternata ; 6 : P. oryzae .
A :PBS buffere pH714 ; B :018 Unit of RC7 ; C:116 Unit of RC7
图 6 　几丁质酶 RC7 对小麦纹枯菌的抑制作用
Fig. 6 　Effect of purified rice chitinase RC7 on the germination of R . cerealis sclerotia
A :小麦纹柘菌菌核在 PDA 培养基对照上萌发、生长 (接种 48h) ;
B :小麦纹枯菌菌核在添加 116 单位的几丁质酶 RC7 的 PDA 培养基上不能萌发 (接种 48h)
A :Control sclerotia germinated at PDA plus PBS medium for 48h ; B : R . cerealis sclerotia did not germinate
at PDA plus 116 unit of the rice chitinase RC7 medium for 48h.
373　3 期 水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究
RC7 融合蛋白的表达。研究发现 ,用 3 种不同浓度的
IPTG诱导 ,对 GST2RC7 重组蛋白表达量的影响不明
显 ,而且重组蛋白 GST2RC7 均以包涵体形式表达。众
多研究表明 ,在高效率的原核表达系统中 ,许多重组蛋
白的表达产物往往会形成无活性的包涵体[8 ] 。包涵体
是指细菌中表达的蛋白在细胞内凝集、形成的无活性
固体颗粒[8 ,10 ] 。为了使包涵体中蛋白变性从而得到溶
解 ,再将变性蛋白进行复性从而得到有活性的蛋白 ,本
文摸索了包涵体溶解液中变性剂如尿素、复性液成分
与复性方法 (稀释复性法和透析复性法)等条件。结果
发现 ,含有 3mmolΠL 尿素的包涵体洗涤液的洗涤纯化
效果好于含 1mmolΠL 的包涵体溶解液的。比较用稀释
复性法 (本文)和透析复性法[8 ]获得复性蛋白的产量和
活性 ,结果发现稀释复性法获得复性蛋白的产量和活
性较用透析复性法的更高 ,但缺点是操作的样品体积
较大 ,稀释速度要控制好 ;透析法的好处是不增加体
积 ,通过降低外透液浓度来控制变性剂的去除速度 ,但
由于操作时间较长 (4 ×12h) ,易形成蛋白质聚集 ,使复
性蛋白的产量和活性降低 ;添加 014molΠL L2精氨酸的
复性稀释液的效果较未添加 L2精氨酸的复性稀释液
的更好。最终 ,本文建立起一套简便、实用的复性体
系 :用含 3mmolΠL 尿素的包涵体洗涤液先洗涤包涵体 ,
再用含 8molΠL 尿素的包涵体溶解缓冲液溶解包涵体 ,
最后加 L2精氨酸的改进复性液进行稀释法复性 ,成功
地获得具有几丁质酶活性的复性目的蛋白 GST2RC7。
该蛋白复性方法 ,可以被广泛应用于其它以包涵体形
式表达的蛋白复性上 ,对于在蛋白质水平研究基因功
能 ,如抗菌蛋白的体外抑菌活性与蛋白质生化特性等
的研究以及制备抗体 ,均非常重要。
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