全 文 ：粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用
陈　明　　张　维　　林　敏
(中国农业科学院原子能利用研究所　北京　100094)
粪产碱菌 ( A aecalis f aecalis)在 L W 培养基下能产生植物激素 IAA。盆栽结果表
明 ,接种 A . f aecalis 显著提高了水稻的生长 ,接种 A1501 和 A1513 的水稻稻谷产量
分别比未接种提高了 815 %和 1013 % ,用15 N 同位素稀释法估测水稻地上部总氮中
来源联合固氮的百分率达 9100 %和 1115 % ,其结果与水稻地上部 (茎叶及稻谷)总氮
量的增加幅度 (816 %和 1116 %)基本一致。研究还表明 A1513 耐铵工程菌的产 IAA
作用以及对水稻的生长和产量、联合固氮作用均优于原始菌株 A1501。
关键词 :联合固氮 　水稻 　粪产碱菌
此文于 1999 年 9 月 8 日收到。
联合固氮作用通常被认为是水稻根际的固氮细菌所致。目前 ,从植物根际分离出许多种
固氮微生物 ,这类微生物大多可产生植物激素并具有与植物联合共生固氮的作用[1 ,2 ] ,因此 ,
对植物的生长和氮素提供起着重要作用。粪产碱菌 A1501 ( A lcaligenes f aecalis) 是从水稻根
系中分离的固氮菌株之一 ,广泛分布于我国水稻田中[3～5 ] ,该菌具有能促进水稻生长、增加水
稻生物产量[6 ,7 ]的作用。近年来 ,对该菌在根区的联合固氮作用有不少研究[3～6 ] ,由于其固氮
活性易受铵、氧及温度等环境因素的影响 ,其固氮效率不够稳定。本实验室在原始菌株的基础
上利用遗传工程手段构建了耐铵菌株 A1513 ,以提高固氮菌促植物生长和联合共生固氮能力。
本试验试图对粪产碱菌 A1501 与构建的耐铵菌株 A1513 进行比较 ,探讨接种对水稻的生长、
稻谷产量的作用 ,并用15N 同位素稀释法评估固氮菌与水稻联合固氮。
1 　材料与方法
111 　菌剂的制备与产生植物激素 IAA的测定
将粪产碱菌 ( A . f aecalis) A1501 及其构建耐铵菌株 A1513 用 L W 培养基 (葡萄糖 510g ,酵
母浸出液 110g , K2 HPO4 015g ,FeSO4·7H2O 0104g ,MgSO4·7H2O 012g ,CaCl2 012g ,Na2MoO4·
2H2O 519mg , H3BO3 0115mg , MnCl2 ·4H2O 01004mg , ZnSO4 ·7H2O 0111mg , CoSO4 ·7H2O
0107mg ,CuSO4·7H2O 010005mg ,H2O 1000ml p H710) 30 ℃摇瓶培养至静止期 ,每 ml 菌液的
活菌计数为 109 以上。取 1ml 离心菌液 ,定量分析 IAA 产量 ,测定方法见文献[8 ] 。
112 　盆栽试验
供试土壤为褐土 ,取自本所农场闲荒地 ,过筛后装入高 230mm ,直径 230mm 的塑料盆 ,每
盆装土 5kg。供试水稻品种为越富 ,由中国农业大学提供。种子发芽至出现 3 片叶时 ,挑选生
长状态一致的幼苗 ,分别用菌剂浸根 1h ,种植于塑料盆中 ,每盆种 4 穴 ,每穴种 3 株幼苗 ,施入
(15N H4) 2SO4 0108gN/ 盆 ( ( 15 N H4 ) 2 SO4 ,上海化工研究所生产 ,丰度 5 %) ,每盆再加入 2ml
373　核 农 学 报　1999 ,13 (6) :373～376Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
A1501 或 A1513 菌剂 ,对照处理加入 L W 培养液 ,重复 4 次。水稻成熟后测量株高 ,并将稻谷
和稻秆分别风干、称重。
113 　含 N量及固氮量的测定方法
样品磨碎后用凯式法测定总氮量 ,再用 MA T2251 质谱仪测定15 N 丰度。15N 同位素稀释
法测定水稻来自空气氮的百分率 ( %Ndfa)及固氮量 (Ndfa)的计算公式 :
　　%Ndfa = (1 - a/ b) ×100 % ;Ndfa = %Ndfa ×TN
其中 ,a ,b 分别为接种和不接种的水稻植株的15N 原子百分超 , TN 为水稻植株的总氮量。
以上数据经 F 检验显著后 ,用 Duncan’s 全复距多重比较进行统计分析。
2 　结 　果
211 　粪产碱菌对水稻根系的促进作用
图 1 　粪产碱菌的产 IAA 作用
Fig. 1 　IAA produced by A . f aecalis
与大多联合固氮菌一样 ,粪产碱菌可产生
植物激素。在 L W 培养基中培养的 A1501 及
A1513 均产生植物激素 IAA ,其 IAA 产量随着
培养时间的增加而增加 (图 1) 。培养 24h ,产生
的 IAA 分别达 3194mg/ L 和 6184mg/ L 。其
中 ,A1513 所产生的 IAA 量明显高于 A1501 原
始菌株。
212 　联合固氮菌对水稻生长的作用
接种粪产碱菌后稻谷的生长、生物产量有
明显的增加 (表 1) 。A1501 及 A1513 菌处理的
水稻植株 ,其株高、秸秆干重均显著高于未接种处理 ( P < 0105) 。稻谷产量分别提高了 8153 %
和 10129 %。
表 1 　接种固氮菌对水稻生长、生物产量的影响
Table 1 　Effect of inoculated A . f aecalis on growth and biomass of rice
处理
Treatment
　
株高
Plant height
(cm)
秸秆干重
Dry weight of shoot
(g/ pot)
稻谷产量
Yield of grain
(g/ pot)
生物产量
Biomass
(g/ pot)
A1501 7612 a 32183 a 22114 ab 54197 ab
A1513 7612 a 33105 a 22105 a 55156 a
培养基 Medium 7119 b 29192 b 20140 b 50182 b
　　注 :数据后不同字母表示在 5 %水平上差异显著 ,下同。
Note :Different letters indicate the significant difference at 5 % , the same as the following.
　　水稻氮产量的测定结果 (表 2)同样表明 ,接种粪产碱菌 A1501 及 A1513 ,水稻茎叶氮产量
以及稻谷氮产量均高于对照处理。其中 ,A1513 处理的稻谷氮产量为 22616 mg/ 盆 ,显著高于
对照 (19415 mg/ 盆) ( P < 0105) ,提高了约 16150 %。对水稻植株地上部全氮 (总 N 量) 的统计
分析表明 ,经粪产碱菌菌液处理后 ,水稻的氮产量有显著的提高。
由此可见 ,粪产碱菌对水稻的生长、生物产量有明显的促进作用。尤其是经遗传修饰的
A1513 有效强的增产作用。
473 核　农　学　报 13 卷
213 　粪产碱菌与水稻的联合固氮作用
15N 同位素稀释法测定水稻固氮百分率及固氮量的结果 (见表 3) 表明 ,联合固氮菌在水
稻生长季节内能固定一定数量的空气氮 ,并被水稻植株所利用 ,水稻地上部通过联合固氮作用
获得的氮量占总氮的 10 %左右。如 A1513 菌液处理的水稻稻谷中来源于大气氮的氮量达
12153 %。
表 2 　接种固氮菌对水稻氮产量的影响
Table 2 　Effect of inoculated A . f aecalis on N yield of rice
处理
Treatment
茎叶 N 含量
N in shoot (mg/ pot)
稻谷 N 含量
N in grain (mg/ pot)
总 N 量
N yield (mg/ pot)
A1501 19115 a 21216 ab 40411 a
A1513 18910 a 22616 a 41516 a
培养基 Medium 17810 a 19415 b 37215 b
表 3 　接种固氮菌对水稻联合固氮的影响
Table 3 　Effect of inoculated A . f aecalis on nit rogen fixation associated with rice
处理
Treatment
茎叶 Shoot
( %Ndfa)
稻谷 Grain
( %Ndfa)
总计 Sum
%Ndfa Ndfa (mgN/ pot)
A1501 9106 ±2186 9120 ±5155 9100 ±4149 3616 ±619
A1513 10177 ±2126 12153 ±5182 11146 ±4111 4711 ±417
3 　讨 　论
已分离到的联合固氮菌株大多具有分泌植物激素 ( IAA , GA3) 的作用 ,而这种产植物激素
作用被认为是促植物生长 ,特别是促根系生长的重要原因之一[1 ,11 ,12 ] 。Okon 等在对巴西固氮
螺菌的研究中 ,发现接种巴西固氮螺菌比接种其 IAA 缺失菌株 (对照) 对植物根系的生长有明
显的促进作用[1 ] ;Dubrovsky 等的研究结果表明 ,施用外源植物激素与接种联合固氮菌具有相
类似的效应[13 ] 。多年来 ,我们对 A caligenes f eacalis 的研究中 ,发现该菌具有分泌 IAA 以及
GA3 的功能 ,实验室条件下证实了接种水稻根毛增多加长 ,且对幼根发育有明显的刺激作
用[9 ,10 ,14 ] 。从本研究结果看 ,接种 A . f eacalis 后水稻的株高、秸秆及稻谷产量均显著高于未
接种对照 ,与上述研究结果相符。此外 ,A1513 产 IAA 量高于 A1501 ,相应接种的水稻株高、
产量和固氮等指标也较高 ,两者间可能存在一定的相关性 ,因此 ,对联合固氮菌的产植物激素
与植物生长及与固氮作用的关系和机理方面还有待于进一步研究。
15N 同位素稀释法是目前测定接种水稻的联合固氮的最有效和最直接的方法 ,通常所估
测的结果不一 ,特别在测定田间固氮作用时误差较大[6 ] ,本实验采用盆栽进行实验 ,以利于管
理 ,减少各因素对估测的偏差。从试验结果看 ,15N 同位素稀释法估测的 %Ndfa 与水稻植株的
含氮量增加百分率的结果一致。
根据本试验的研究初步得到以下结果 :11 接种 A caligenes f eacalis 显著地促进了水稻生
长 ,提高了作物产量和水稻的联合固氮作用 ;21 15N 同位素技术测定水稻联合固氮量的结果与
接种水稻的氮含量的增量一致 ,水稻可获得占植株总氮约 10 %的联合固氮产物 ;31 遗传工程
573　6 期 粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用
菌 A1513 对水稻生长及联合固氮作用上显示出其优势。
参 考 文 献
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ASSOCIATION NITROGEN FIXATION OF RICE INOCULATED WITH AMMONIA
RESISTANT ENGINEERING STRAIN( Alcaligenes f aecalis)
Chen Ming 　Zhang Wei 　Lin Min
( Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , CA A S , Beiji ng 　100094)
ABSTRACT
It showed that Alcaligenes f aecalis could produce plant hormone ( IAA) in LW medium.
The pot experiment results showed that inoculation with A1501 and A1513 could promote the
growth and grain yield of rice. Comparison with the non2inoculation , the grain yeild of rice
treated with A1501 and A1513 increased by 815 %and 1013 %respectively. And %Ndfa of rice
shoot and grain estimated by 15 N2isotope dilution method was 9100 %and 1115 %, respectively ,
which was consistent with the increment of the total N( 815 % and 1116 %, respectively) . The
study indicated that ammonia resistant engineering strain A1513 had more stimulative effect on
the growth of rice and grain yield than A1501.
Key words :Associative nit rogen fixation , rice , A lcaligenes f aecalis
673 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (6) :373～376