全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 012079206
外源 DNA 导入植物技术的发展及其
在作物育种中的应用
杨景成1 ,2 　于元杰1 3 　齐延芳3
(1 山东农业大学农学院植物遗传工程实验室　山东 泰安　271018 ;
2 中国科学院植物研究所植被数量生态学开放研究实验室　北京　100093 ;
3 山东省农业科学院原子能农业应用研究所　山东 济南　250100)
摘　要 :本文综述了 20 年多来外源 DNA 导入植物技术的研究进展 ,着重介绍了该技
术在作物育种中的应用及其可靠性和可行性的实验验证。
关键词 :外源 DNA 导入 ;植物 ;作物育种
收稿日期 :2001209211
基金项目 :山东省聊城市国家大型优质小麦基地项目 ,国家科技部和山东省科技厅“九五”重点资助项目 (962C012012022
12)资助
作者简介 :杨景成 , (1971～) ,男 ,中国科学院植物研究所在读博士 ,助理研究员3 通讯作者
通过远缘杂交 ,扩大基因库 ,弥补近交的局限性 ,日益成为作物育种工作的一项重要课题。
自 20 世纪 60 年代初 ,国内开始采用常规杂交技术进行粮食与其他作物的属间甚至科间的远
缘杂交。在研究水稻与玉米、高粱杂交的过程中发现 ,后代的染色体数目、形态与母体没有多
少差异。虽然子代在某些外观性状上能找到远缘亲本的某些特征 ,但基本属于母本类型 ,而株
型、穗型及其他经济性状往往明显不同于母本[1 ] 。玉米与摩擦禾杂交 ,后代染色体完全恢复为
玉米的染色体 (2n = 20) ,但性状上有摩擦禾的影响[2 ,3 ] 。周光宇针对这种远缘杂交现象提出了
DNA 片段杂交假说 ,为 DNA 导入技术应用于作物育种提供了理论依据。在此基础上设计了自
花授粉后外源 DNA 导入技术 (又称花粉管通道技术) ,应用该技术实现了棉花枯萎病抗性的转
移[4 ] 。应用外源 DNA 与玉米花粉混合授粉 ,得到高频率的胚乳基因转移[5 ] 。随着研究的深
入 ,外源 DNA 导人在方法、技术细则上不断丰富和完善。在花粉管通道技术的基础上 ,又提出
了浸泡法 (干胚和胚性愈伤组织) 、微量注射法、射击穿入法 (基因枪法、电击法) 。同时培育出
了一大批具有优良性状的作物新品种 (品系、种质) 。
1 　外源 DNA 导人植物技术的理论基础
111 　DNA片段杂交假说的提出及分子验证
在早期远缘杂交试验中发现 ,后代表型基本属于母本 ,只是少数性状发生了变异 (如玉米
稻、高粱稻) 。染色体组型分析发现 ,后代染色体数目、形态均与母本相同。周光宇认为 ,这种
远缘杂交应该是 DNA 片段杂交的结果。从整体上看 ,远缘亲本间的染色体结构是不能亲和
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的 ;但从进化的角度来讲 ,部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性。当远缘花粉中的基因
组进入母体 (受体)后 ,被分解成片段 ,大部分片段被受体降解 ,保存下来的某些 DNA 片段有可
能被整合进受体染色体 ,在子代中表达典型的或更多的是非典型的遗传变异。后者可能是外
源 DNA 参与受体性状基因表达的调控或数量遗传 ,影响了多基因表达体系 ,使子代出现变
异[6 ] 。由于插入的片段很小 ,光学显微镜下可能看不到因片段杂交引起的染色体形态结构上
的变异。因此 ,引起子代的性状差异只能是少数的 ,大部分仍是受体性状。
周光宇进行了高粱稻及其亲本的酯酶同工酶分析 ,发现高粱稻中有一条与高粱相同的酶
带。应用父本高粱 DNA 与母本水稻 DNA 进行分子杂交 ,除去高粱与水稻的同源顺序 ,然后利
用已去除和水稻同源的高粱 DNA 为探针 ,与高粱稻 DNA 进行分于杂交 ,发现仍存在与高粱同
源的序列 ,表明高粱的部分 DNA 己存在于稳定的高粱稻基因组中[7 ] 。沈建华进行的水稻、高
粱、高粱稻重复序列 DNA 复性动力学分析发现 ,高粱稻基因组与水稻相比 ,部分中度重复序列
发生了变化 ,这一结果应是在杂交之后 ,远缘亲本高粱的 DNA 片段插入水稻基因组内造成
的[8 ] 。雷勃钧对野生大豆 DNA 导入栽培大豆的后代及供体、受体进行 RAPD 分析 ,后代中多
态性特异带与供体、受体 DNA 多态性相对应 ,证明外源 DNA 片段可通过花粉管通道导入受
体 ,引起基因组变异。供体、受体的 DNA 多态性并不都对应于后代的变异 ,推测后代基因组变
异可能是由于大片段供体 DNA 同源重组引起的。重组引起分隔或破坏某些片段的引物结合
位点 ,造成个别受体带在后代中消失[9 ] 。杨景成对外源λDNA 导入普通小麦获得的 D 型细胞
质雄性不育系进行了叶绿体 DNA 和核 DNA 的分子杂交 ,发现供体 DNA 已经整合进了不育体
核基因组和叶绿体基因组中 ,并且可以稳定遗传[10 ] 。对叶绿体 DNA 的 RAPD 分析发现 ,不育
系有一条与供体相同而在受体中不存在的特异带 ,另外有两条特异带在受体和杂种一代中存
在 ,而在不育系中消失 ,从而证明供体 DNA 片段可以整合进受体叶绿体基因组中 ,改变原有的
基因表达和调控 ,导致性状变异[11 ] 。
112 　外源 DNA导入的双重作用 ———基因转移和生物诱变
就外源 DNA 导入产生变异机制 ,万文举提出了双重作用假说 ,即外源 DNA 导入具有基因
转移和生物诱变作用[12 ] 。外源 DNA 导入可以达到基因转移的目的。其可靠性和可行性已经
在水稻、野生大豆外源 DNA 导入研究中得到验证[13～15 ] 。
外源DNA 导入的诱变作用属于生物诱变。外源DNA 片段导λ受体细胞 ,并整合 (插入)到
受体 DNA 中 ,引起基因突变和性状变异 ,这种变异能在后代中遗传。当整合的外源 DNA 片段
小于一个基因 ,甚至是若干个碱基插入受体 DNA 中时 ,将引起移码突变 ;较大的外源 DNA 片
段插入受体 DNA 也会引起突变。生物诱变具有一种“引发作用”,或“再启动作用”,使系统发
育中“潜在”的性状得以表达。
生物诱变与物理化学诱变的区别 : (1)引起突变的物质本身就是遗传物质 ,是由 4 种单核
苷酸 (A ,T ,G和 C)组成的 DNA 片段 ,而非异种物质 (非遗传物质) ,它能直接参与基因突变 ,成
为突变基因的组成部分 ; (2)不会产生大的有害性 (如致死突变) 。
2 　外源 DNA 导入植物的技术体系
211 　花粉管通道技术及其可靠性分子验证
为验证 DNA 片段杂交假说 ,探索外源 DNA 导入新途径 ,周光宇以 DNA 片段代替花粉进行
杂交 ,提出了模拟授粉杂交育种技术。受粉后部分远缘花粉的花粉管不能伸长 ,而在柱头上破
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裂 ,花粉内含物释放后 ,沿着花粉管通道进入胚囊 ;部分花粉可以在柱头上萌发 ,将精核带入胚
囊 ,由于不能精卵结合而被分解 ,幸存的 DNA 片段被整合到受体基因组中。由此设计了自花
授粉后外源 DNA 导入植物技术 ,即花粉管通道技术[16 ] 。植物正常授粉后 ,花粉在柱头上萌发
形成花粉管 ,穿过花柱进入子房 ,沿子房内壁或胎座继续生长直到胚珠 ,通常经珠孔进入胚囊 ,
以棉花为例 ,胚珠在授粉之前 ,珠心是一个封闭的体系 ,在花粉管到达前 ,从珠孔到胚囊的一些
珠心细胞退化形成一条便于花粉管生长的通道。利用这条通道可以使外源 DNA 进入胚囊 ,转
化受精卵或其前后的细胞 (卵、早期胚细胞) ,而自然发育成种子 ,观察后代变异。
应用缺口翻译法将以3 H标记的棉花 DNA 分子 (50kb) ,于棉花自花授粉后 24h 从子房顶部
注入 ,取样 ,冰冻切片 ,放射自显影 ,观察到 30min 后胚囊内已有3 H2DNA 进入 ,2～4h 80 %以上
胚囊内已有3 H2DNA。除从珠孔到胚囊间的花粉管通道外 ,珠心的任何其他部位均无自显影斑
点 ,进入胚囊的花粉管内亦无同位素。这表明花粉管珠心通道是外源 DNA 从珠孔到胚囊的唯
一途径[17 ] 。应用 M13 (mp7 )为载体的海岛棉重复序列克隆 ,将其重组分子导入海岛棉 ,至胚发
育约 60d 后种子成熟 ,提取其 DNA ,采用 Southern Blot 法 ,以32 P 标记的 M13 (mp7 ) DNA 为探针 ,
研究结果表明 ,棉花 DNA 中存在 mp7 ,证明了应用该方法实现了枯萎病抗性基因转移[18 ] 。将
带 GUS 标记基因的质粒 pBm121 用花粉管途径转化普通小麦 ,选出 5 株转基因小麦 ,用荧光法
和 X2Gluc 染色法测试 ,检测到 Gus 基因的表达产物β2葡萄糖昔酸酶的存在 ,证明 Gus 基因已整
合到小麦植株中 ,并能在植物体中得到表达[19 ] 。用花粉管通道法将新疆大赖草DNA 导入普通
春小麦花培品系 761 ,经常规选育获得大穗、多粒的转化后代。以地高辛标记的 4 个大麦高度
重复序列克隆为探针 ,对供体、受体和转化后代进行Southern杂交分析 ,结果证明新疆大赖草
DNA 片段已整合到受体基因组中[20 ] 。
212 　外源 DNA浸胚法及其验证
于元杰以小牛胸腺DNA 浸渍小麦种子和幼苗 ,引起后代性状变异[21 ] 。任青梅用通北燕麦
草和慈利玉米 DNA 浸渍小麦胚性愈伤组织 ,获得了变异植株 ,同时提高了转化频率[22 ] 。DNA
浸渍法是一种有效的外源 DNA(基因) 导入技术 ,与花粉管通道技术相比 ,更适用于单子叶植
物 (如水稻、小麦等)分子育种。
周光宇对浸渍法的育种原理进行了探讨。单子叶植物 (如水稻)成熟种子胚的两端为可发
育成苗和根的分生组织细胞群。种子萌发生长过程中 ,茎端的分生组织细胞成为特定发育时
期生长分化的原始细胞 ,继续分裂形成特定的植物器官组织。顶端分生组织细胞不断分裂 ,提
供各生长发育时期的起始细胞 ,并随植物的生长发育 ,使分生组织细胞在生育的全过程存在茎
顶 ,最终形成繁殖器官 ,包括花粉和卵细胞。当外源 DNA 浸泡种子 (包括种胚、胚性愈伤组织)
时 ,若 DNA 进入并转化了分生组织细胞 ,则可能在当代表现其功能 ,也可以进入种胚细胞而遗
传[23 ] 。张学文等研究了外源DNA 在浸泡水稻种胚过程中的降解情况 ,发现水稻胚在浸泡中能
主动降解外源 DNA ,24h 后即有大部分分子完全被降解。据此提出外源 DNA 降解成分有利于
导入和诱变 ,外源DNA 降解成的核苷酸及其进一步水解产物不能在诱变中起很大作用[24 ] 。小
麦原胚细胞对外源大分子与不透膜物质有摄取作用 ,外源大分子物质可以非跨膜运输的方式
沿原胚基端的特定通道进入原胚细胞[25 ] 。该结果就解决了外源 DNA 导入种胚的通道问题。
刘春林对慈利玉米 DNA 浸泡后后代中选育的优良变异株系与受体、供体一起进行了酯酶
同工酶分析 ,发现 DNA 浸泡法能在保证受体及其后代基本酶带不变的前提下 ,改变其它酯酶
同工酶的表达类型 ,变异个体酯酶酶带出现与 DNA 供体玉米相同的酶带 ,或与供体玉米和受
18　1 期 外源 DNA 导入植物技术的发展及其在作物育种中的应用
体均不同的酶带。认为原因可能有两个 :一是玉米外源 DNA 中的某一完整的酯酶同工酶结构
基因整合到了受体基因组中 ;二是玉米的一段 DNA 调控序列整合到了受体基因组中 ,改变了
受体基因组原有的酯酶同工酶表达类型[26 ] 。
213 　射击穿入法
射击穿入法是近来兴起的一种外源基因导入方法。明小天等使用电击法分别将 CAT 和
Gus 基因与 CaMV35S 启动子构成的两种嵌合基因转移到水稻、玉米、烟草、胡萝卜等的原生质
体中 ,均得到了瞬间表达 ,且表现出明显的基因活性[27 ] 。Paul 用基因枪法直接将外源抗除莠
剂基因转移到水稻幼胚中 ,植株表达抗除莠剂特性 ,并能遗传给后代 ;用 Southen 印迹杂交法检
测出外源抗除莠剂基因己转移到水稻 DNA 中[14 ] 。
3 　外源 DNA 导入引起变异的遗传特性
外源DNA 直接导入受体 ,产生变异植株(或转化植株) ,涉及的变异有以下几方面特点 :
11 变异频率较高。外源 DNA 导入的转化成株率 (DNA 转化植株/ DNA 处理胚珠数) 为 l %
～10 %[23 ] 。与其他分子育种方法相比 ,这一变异频率是相当高的。而转化成株率与供体类型
和导入方法有关。
21 性状变异范围广泛。外源DNA 直接导入所引起的变异性状 ,几乎涉及到作物的各类质
量性状和数量性状 ,主要包括株型、叶色、生育期、育性、光温反应、抗病性、抗旱性、抗盐碱性、
抗除草剂、品质及产量构成性状等方面[28 ] 。
31 变异性状重演性好 ,稳定较快。于元杰将牛胸腺 DNA 导入普通小麦 ,后代出现矮秆变
异株 ,以后连续几年重复导入 ,均出现了矮杆变异。且该变异稳定较快 ,一般 3～4 代即稳
定[21 ] 。这一特点有利于缩短育种年限 ,提高育种效率。
41 变异性状的遗传规律较为复杂。变异性状一般出现在 D1 代 ,少数到 D2 、D3 代出现。
变异性状大多来自供体 ,但也有双亲所不具有的 ;多数性状可以遗传。变异性状在后代存在稳
定遗传和继续分离两种趋势。部分后代性状分离符合盂德尔遗传规律 ,但多数不符合[21 ] 。
4 　外源 DNA 导入育种技术应用现状
外源 DNA 导入技术创立以来得到广泛的应用。供体、受体范围不断扩大。供体已不仅仅
局限于种、属、科间的远缘亲本 ,有的甚至用动物 DNA 处理受体。而受体也由小麦、水稻、棉
花、大豆等粮食作物、经济作物和油料作物 ,扩展到蔬菜、瓜果、林木等植物。黄骏麒等将耐黄
萎病的海岛棉 DNA 导入抗枯萎病陆地棉 ,选育出耐黄萎病兼抗枯萎病的新品种 3118 棉 ,在长
江中下游累计种植 5000hm2 以上 ,大田增产达 15 %。还将苘麻 DNA 导入海岛棉 ,得到高产长
绒棉。吴小月将中棉 DNA 导入陆地棉 ,培育出湘棉 12 号 ,已通过品种鉴定。于元杰等将罗布
麻 DNA 导入陆地棉 ,选育出高抗盐碱的棉花新品系 91011 ;将小牛胸腺 DNA 导入普通小麦培
育出高产、高蛋白、优质小麦新品系 D041 ,累计推广 20 多万 hm2 。万文举等应用浸胚法将玉米
DNA 导入水稻 ,从变异后代中选出高产新品系 GER21。广西农科院将野生稻 DNA 导入栽培
稻 ,选育出耐旱、耐瘠薄、抗早衰、高产的糯稻桂 D1 号 ,已得到大面积推广 ,并获广西自治区科
技进步二等奖。另外许多育种单位在外源 DNA 导入育种方面取得了很大进展 ,获得了一大批
优良作物新类型、新种质 ,大大丰富了作物种质资源。
28 核　农　学　报 17 卷
5 　外源 DNA 导入育种技术的评价
511 　外源 DNA导入育种方法的优点
与常规及其他分子育种方法相比 ,外源 DNA 导入育种具有以下几方面的优点 :
11 方法简便。可以于大田、盆栽、温室中进行 ,一般常规育种工作者易于掌握。花粉管通
道技术利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化外源 DNA ,不需细胞、原生质体组织
培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。浸泡法同样易于掌握。同时 ,费用大大降低 ,尤
其符合现阶段作物育种的现实情况。
21 缩短育种年限 ,提高育种效率。应用这一育种技术筛选到稳定的棉花和水稻新品系只
需 3～4 年。这主要是因为只有部分外源 DNA 片段进入到受体基因组 ,避免了供体基因与受
体基因组可能进行的全面重组 ,易于稳定。
31 可以任意选择生产上的当家品种进行外源DNA 导入操作 ,以实现目的基因的转移。这
样既可保留当家品种的大部分优良性状 ,又能够转移供体的部分优良性状 ,改良其个别不良性
状。
41 该技术同样可以应用于重组 DNA 分子的导入。如将卡那霉素抗性基因重组分子导入
水稻 ,在后代中得到整合、遗传和表达。二者的结合既可更充分的验证外源 DNA 导入技术的
可靠性和可行性 ,同时可以促进分子育种技术的发展。
512 　应用该技术应注意的问题
外源 DNA 导入育种已经取得了很大成效 ,但还存在一系列需要进一步解决的技术问题。
11 强化导入。为提高育种效率 ,须加大外源 DNA 导入强度 ,这包括不同方法之间的结合 ,DNA
处理浓度和处理次数的增加 ,以胁迫受体更有效地吸收整合外源遗传物质 ,提高转化频率。21
结合细胞筛选。在加强变异体整株选择的同时 ,开展细胞水平上的筛选 ,使早期、微小的变异
能通过体细胞无性系繁殖加以筛选 ,并尽快稳定下来。31 完善导入程序。根据不同作物的遗
传特性和育种目标 ,制定相宜的外源 DNA 导入技术程序 ,包括供体的选择、受体状态、导入时
间和方法、后代选择、杂种鉴定等。使这项育种新途径趋于规范化、常规化。41 与常规育种、
分子遗传学、分子生物学进一步结合 ,一方面提高育种效率 ,另一方面更深入的探讨外源 DNA
导入的确切机制。
6 　结 　语
自外源 DNA 导入技术创立以来 ,已经得到越来越多的认同和采用 ,取得了一批有价值的
研究成果。但该技术在理论上仍然存在一系列问题 ,如外源 DNA 导入以后 ,到底有多少和什
么 DNA(基因)在起作用 ? 其作用的确切机理是什么 ? 如何将这些基因 (DNA 片段) 进行识别
和分离 ? 而植物基因工程的难点就在于基因的识别和分离 ,以致形成了植物基因工程发展的
一个关键。目前分离的可用于农业的基因 ,主要来源于微生物 ,真正来源于植物的很少。另外
如何减少外源 DNA 导入的盲目性 ,提高育种的针对性也是这一技术急需解决的问题之一。如
果能利用分子生物学和基因工程的理论和技术 ,来探索外源 DNA 导入后代的基因识别和分
离 ,可能对二者的发展均有很大的推动作用 ,而对于外源 DNA 导入植物育种技术的进一步发
展更是具有不可估量的意义。
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ADVANCES OF EXOGENOUS DNA INJECTION TO PLANT AND ITS APPLICATIONS
IN CROP BREEDING
YANGJing2cheng1 ,2 　YU Yuan2jie1 　QI Yan2fang3
(11Academy of Agronomy , Shandong Agricultural University , Taian , Shandong prov. 　271018 ;
21Laboratory of Quanititative Vegetation Ecology , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 　100093 ;
31 Institute of Atomic Energy Application , Shandong Academy of Agricultural Sciences ,Jinan Shangdong prov. 　250100
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