全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 032169205
转 CB F1 基因增强水稻的耐逆性
吴关庭　郎春秀　胡张华　陈笑芸　王伏林　金　卫　陈锦清
(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘 　要 :为改良水稻 ( Oryza sativa L. )的耐逆性 ,以来源于成熟种子的胚性愈伤组织为受体材料 ,通过农
杆菌介导法将拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)耐逆相关 CB F1 基因导入粳稻品种秀水 11 基因组 ,经 GUS 组
织化学染色、PCR 检测和 Southern 杂交分析验证 ,获得一批转基因植株。T1 代检测结果显示 ,所转基因
已遗传给后代 ,且大多数株系的分离比符合 3∶1。试验表明 ,在高盐与高渗胁迫下 ,转基因株系较非转
化对照具有显著或极显著生长优势 ,表现苗高负增长率较小 ,长出的根数较多 ,根长较长 ;经低温胁迫处
理后 ,转基因株系的叶片相对电导率显著或极显著低于对照。这些结果证明水稻转基因株系的耐逆性
得到了增强。
关键词 :水稻 ;根癌农杆菌 ;遗传转化 ; CB F1 基因 ;耐逆性
ENHANCEMENT OF STRESS TOLERANCE OF TRANSGENIC RICE WITH CB F1 GENE TRANSFORMATION
WU Guan2ting 　LANG Chun2xiu 　HU Zhang2hua 　CHEN Xiao2yun 　WANG Fu2lin 　J IN Wei 　CHEN Jin2qing
( Institute of Virology and Biotechnology , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang 　310021)
Abstract :In order to improve stress tolerance of rice ( Oryza sativa L. ) , Agrobacterium tumef aciens strain EHA105 carrying
plasmid pCMD containing stress tolerance2related CB F1 gene from Arabidopsis thaliana was used to transform mature seeds2
derived embryogenic calli of japonica variety Xiushui 11. More than one hundred transgenic plants were regenerated , which
were confirmed by histochemical detection of GUS activity , PCR assay and Southern hybridization analysis. The transgene was
inherited to T1 progeny and Mendelian 3∶1 segregation ratio was observed in most transgenic lines. Under high salinity and
high osmosis stresses , transgenic lines had significant ( P < 0105) or highly significant ( P < 0101) growth superiority
compared with non2transformed control , including smaller decrease in seedling height and formation of more and longer roots.
Additionally , relative electronic conductivity of low temperature2stressed leaves of transgenic lines was significantly or highly
significantly lower than that of the control . These results demonstrated that stress tolerance of transgenic rice lines was
enhanced.
Key words :rice ( Oryza sativa L. ) ; Agrobacterium tumef aciens ; genetic transformation ; CB F1 gene ; stress tolerance
收稿日期 :2005212220
基金项目 :浙江省“151 人才基金”项目
作者简介 :吴关庭 (19632) ,男 ,浙江萧山人 ,博士 ,研究员 ,从事植物基因工程研究。Email : yznszdz @zaas. org。陈锦清为通讯作者。　　水稻是世界也是我国的主要粮食作物之一 ,全球半数以上人口以稻米为主食。低温、干旱、高盐等逆境条件不仅限制水稻的种植区域 ,而且每年导致产量的重大损失 ,因此 ,培育耐逆性强的水稻新品种对保持世界粮食产量与人口的同步增长、保障我国粮食安全具有重要意义。然而 ,采用常规育种方法改良水稻耐逆 性一直未能取得重大突破。近几年来 ,越来越多的耐盐、耐旱、耐冷相关基因的克隆及植物转基因技术的不断发展为选育耐逆水稻新品种提供了一种很有希望的技术途径。CB F 基因是几年前发现的一类耐逆相关基因 ,其所编码的转录激活因子能与 CRTΠDRE DNA 调控元件
961　核 农 学 报　2006 ,20 (3) :169～173Journal of Nuclear Agricultural Sciences
特异结合 ,促进启动子中含有这一调控元件的多个冷
诱导和脱水诱导基因的表达 ,从而引起植株耐逆性的
增强。转基因实验证明 , CB F 基因的组成型超表达不
仅提高了转基因植株的低温耐性[1～3 ] ,而且也使转基
因植株对干旱和高盐胁迫的耐受能力得到显著改
良[4 ,5 ] 。因此 , CB F 基因在提高植物耐逆性方面的效果
要优于单一功能基因的转化[1 ,5 ] 。本文通过农杆菌介导
法将拟南芥 CB F1 基因导入水稻 ,获得了转基因植株 ,
并对转基因遗传和转基因后代的耐逆性进行了研究。
1 　材料和方法
111 　材料
所用水稻 ( Oryza sativa L. )品种为粳稻秀水 11 ,由
本院作物与核技术利用研究所提供。根癌农杆菌
( Agrobacterium tumef aciens)菌株为超毒力型 EHA105 ,内
含质粒 pCMD ,由本实验室保存。pCMD 的 T2DNA 区携
带有拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)耐逆相关 CB F1 基因、
潮霉素磷酸转移酶基因 ( hpt ) 和葡糖苷酸酶基因
( gus) 。CB F1 基因长 642 bp ,与 CaMV 35S 启动子和胭
脂碱合成酶终止子共同构成表达框架 (图 1) 。
35Sp35SpHPTNOSRB CBF1 NOS
35SpGUSNOSLB
图 1 　质粒 pCMD 的 T2DNA 区图谱
Fig. 1 　Schematic diagram of T2DNA region
of plasmid pCMD
112 　农杆菌介导法转化水稻
农杆菌介导的水稻转化 ,包括来源于成熟种子的
胚性愈伤组织诱导、农杆菌感染与共培养、抗性愈伤组
织筛选和抗性植株再生 ,基本上参照章冰和卫志明[6 ]
以及黄健秋等[7 ]的方法进行。再生获得的抗性植株生
根并长至 10cm 左右高时 ,移栽于盆钵 ,在自然条件下
生长至成熟。
113 　抗性植株 GUS 组织化学染色
采用 Rueb 和 Hensgens[8 ] 改良的 GUS 组织化学染
色方法 ,剪取抗性植株的叶片和根段置于 X2Gluc 检测
液中 ,于 37 ℃保温过夜 (约 15h) ,吸干检测液后用无水
乙醇脱色 ,观察染色情况。
114 　抗性植株 PCR 检测
剪取抗性植株和非转化对照植株的叶片 ,小量提
取基因组 DNA[9 ] 。以提取的 DNA 为模板 ,根据 hpt 基
因序列设计合成 1 对特异引物 (5’2TAC ACA GCC ATC
GGT CCA GA23’和 5’2TAG GAG GGC GTG GAT ATG TC2
3’) ,采用常规方法进行 PCR 扩增。
115 　转基因植株 Southern 杂交分析
随机选取一部分独立来源的经 PCR 验证的 T0 转
基因植株和非转化对照植株大量提取基因组 DNA[9 ] 。
取 15μg 左右 DNA 用 Hind Ⅲ酶切后 ,在 018 %琼脂糖
凝胶上电泳分离 ,然后转移到 Hybond2N+ 尼龙膜上[10 ] 。
以 hpt 基因片段作为探针 ,探针标记、分子杂交和信号
检测采用 Amersham Pharmacia Biotech 公司生产的 ECL
试剂盒 ,方法依照操作手册。
116 　T1 代转基因遗传分析
以 T0 代经过 Southern 杂交分析的 T1 代转基因株
系为对象 ,通过 hpt 基因 PCR 检测 (方法同上) ,考察转
基因植株后代的分离情况并对分离比进行统计分析。
117 　转基因株系耐盐与耐渗透胁迫试验
将转基因已不再分离的株系 (均为上述 Southern
杂交分析和转基因遗传分析材料的后代) 和非转化对
照的米粒灭菌后接种于不含激素的 MS 培养基上培养
无菌苗 ,待苗长至 15cm 左右高时 ,去根并量取苗高 ,转
接至分别含有 115 % NaCl 和 10 % PEG6000 的生根培
养基上 ,在 25 ℃的自然光照条件下培养 ,观察植株生
长情况。两试验均设 5 次重复 ,每重复 30 株。6 周后
统计存活幼苗数并考查记录存活幼苗的苗高、根数和
根长 ,由培养前后两次量取的苗高计算出苗高相对增
长率 ,获得的试验结果进行统计分析。
118 　低温处理叶片相对电导率测定
上述用于耐盐与耐渗透胁迫试验的转基因株系和
非转化对照的种子在正常温度下播种育苗 ,待幼苗长
至三叶一心期时 ,转至 4 ℃条件下低温处理 3d ,然后剪
取叶片测定相对电导率[11 ,12 ] 。每处理 3 次重复 ,每重
复测定 3 次电导值 ,取平均值并进行统计分析。
2 　结果与分析
211 　转基因植株的获得
从粳稻品种秀水 11 成熟种子诱导获得的胚性愈
伤组织经携带质粒 pCMD 的根癌农杆菌 EHA105 感染
并共培养后 ,转移到含潮霉素的筛选培养基上进行选
择培养 ,大约 3 周后 ,从部分褐化的愈伤组织表面长出
乳白色至黄色的抗性愈伤组织 ,这些抗性愈伤组织经
3～4 轮继代筛选后转移到含潮霉素的分化培养基上
进行植株再生。本研究共转化胚性愈伤组织 915 块 ,
获得抗性愈伤组织 117 块 ,从其中 73 块再生出 139 株
抗性植株 ,移栽至盆钵后成活 114 株。成熟后观察表
071 核　农　学　报 20 卷
明 ,各抗性植株之间在熟期、结实率等性状上存在较大
差异 ,多数植株的株高低于未转化对照植株 ,分蘖数也
较少。
212 　转基因植株 GUS 染色和分子鉴定
再生获得的 139 株抗性植株在移栽至盆钵前 ,剪
取叶片和根段进行 GUS 组织化学染色 ,结果有 127 株
呈蓝色反应 ,其中移栽成活的 114 株植株中 ,呈蓝色反
应的有 103 株 (图 2) ,说明这些植株中 gus 基因得到了
稳定表达。小量提取 114 株移栽成活植株的基因组
DNA 进行 hpt 基因的 PCR 检测 ,共有 107 株扩增出与
　　　　
图 2 　水稻转基因植株 GUS组织化学分析
Fig. 2 　GUS histochemical analysis of transgenic rice plants
A :转基因植株叶片 ;B :对照植株叶片 ;
C :转基因植株根段 ;D :对照植株根段
A : leaves of transgenic plants ; B : leaves of non2transformed plants ;
C : roots of transgenic plants ; D : roots of non2transformed plants
阳性对照一致的 832bp 的目标条带 ,而该条带在未转
化对照植株中不存在 (图 3) 。在 114 株移栽成活植株
中 ,GUS 染色和 hpt 基因 PCR 检测呈双阳性的有 103
株 ,另有 4 株能扩增出 hpt 基因片段但无 GUS 活性。
以上结果初步表明 ,本研究已获得外源基因整合进受
体品种基因组的转基因植株。
图 3 　水稻转基因植株 hpt 基因 PCR 检测
Fig. 3 　PCR assay of hpt gene in transgenic rice plants
M:DNA 分子量 ;P :质粒 pCMD(阳性对照) ;CK:非转化植株
(阴性对照) ;1～8 :转基因植株
M: DNA marker ; P : pCMD plasmid as positive control ; CK:
non2transformed plant as negative control ;
1～8 : transgenic plants
　　为进一步确证外源基因已整合到水稻基因组中 ,
随机选择 8 株独立来源的经 PCR 验证的 T0 转基因植
株提取基因组 DNA ,经 Hind Ⅲ酶切电泳后以 hpt 基因
片段为探针进行 Southern 杂交分析。结果表明 ,8 株转
基因植株中都出现了杂交条带 ,且均为单拷贝插入 ,而
在非转化对照植株中未检测到任何条带 (图 4) 。
图 4 　水稻转基因植株 hpt 基因 Southern 杂交分析
Fig. 4 　Southern analysis of hpt gene in transgenic rice plants
M:DNA 分子量 ;P :质粒 pCMD(阳性对照) ;CK:非转化植株 (阴性对照) ;1～8 :转基因植株
M: DNA marker ; P : pCMD plasmid as positive control ; CK: non2transformed plant as negative control ; 1～8 : transgenic plants
213 　转基因遗传分析
将上述经过 Southern 杂交分析的 8 个 T0 转基因植
株的种子种成 T1 代株系 ,通过 hpt 基因 PCR 检测的方
法 ,考察所转基因在后代的分离情况。结果所有株系
均有部分植株扩增出了目标条带 ,表明所转基因已遗
传至后代。从表 1 可见 ,6 个株系的 hpt 基因符合孟德
尔 3 :1 的分离比 ,只有 TR4 和 TR7 两个株系例外 (χ2
测验中 P < 0105) 。由于 Southern 杂交分析表明 ,这两
个转基因株系都是单拷贝插入 ,故认为其分离比属于
异常。
171　3 期 转 CB F1 基因增强水稻的耐逆性
表 1 　转基因水稻 T1 代遗传分析
Table 1 　Genetic analysis of T1 generation of transgenic rice
T1 株系
T1 line
hpt 基因 PCR 检测
PCR assay of hpt gene
PCR 阳性植株数
No. of PCR positive plants (P)
PCR 阴性植株数
No. of PCR negative plants (N)
分离比
segregation ratio (PΠN) 3 :1 分离比3 :1 segregation ratioχ2 值
χ2 value
P 值
P value
TR1 40 12 3. 3 0. 026 0. 87
TR2 32 16 2. 0 1. 361 0. 24
TR3 38 10 3. 8 0. 250 0. 62
TR4 30 19 1. 6 4. 252 0. 04
TR5 36 15 2. 4 0. 320 0. 57
TR6 39 11 3. 5 0. 107 0. 74
TR7 29 20 1. 5 5. 721 0. 02
TR8 41 10 4. 1 0. 529 0. 47
214 　转基因株系耐逆性鉴定
从来源于 Southern 杂交分析和转基因遗传分析材
料的后代中选择 5 个转基因已不再分离的株系经重新
编号后与非转化对照一起培养无菌苗 ,然后转接至分
别含有 115 % NaCl 和 10 % PEG6000的生根培养基上培
养 ,研究比较转基因株系和对照对高盐与高渗胁迫耐
受能力的差异。培养 6 周后观察表明 ,转基因株系和
对照的幼苗叶片都表现一定程度的黄化 ,但前者的黄
化程度要轻于后者。从表 2 可以看出 ,在高盐与高渗
胁迫下 ,转基因株系和对照的幼苗存活率基本不受影
响 ,但幼苗不仅停止生长 ,而且由于细胞失水收缩而使
苗高呈现负增长。转基因株系的苗高负增长率都小于
对照 ,根数多于对照 ,根长均比对照长。经统计分析 ,5
个转基因株系的苗高相对增长率、根数和根长绝大多
数与对照有显著或极显著差异。以上结果表明 ,水稻
转基因株系的耐盐与耐渗透胁迫能力得到了增强。
表 2 　高盐与高渗胁迫对转基因水稻幼苗存活与生长的影响
Table 2 　Effects of high salinity and high osmosis stresses on survival and growth of transgenic rice plantlets
材料
material
高盐胁迫 high salinity stress 高渗胁迫 high osmosis stress
幼苗存活率
plantlet survival
rate ( %)
苗高相对增长率
relative increase in
shoot height ( %)
根数
No. of roots
per plantlet
根长
root length
(cm)
幼苗存活率
plantlet survival
rate ( %)
苗高相对增长率
relative increase in
shoot height ( %)
根数
No. of roots
per plantlet
根长
root length
(cm)
TR1 100 - 21. 1 12. 1 2. 3 100 - 17. 9 9. 1 1. 5
TR2 100 - 24. 2 11. 6 1. 9 100 - 23. 2 8. 2 1. 3
TR3 100 - 19. 8 12. 2 2. 1 100 - 10. 4 10. 1 1. 6
TR4 100 - 17. 5 12. 5 2. 4 100 - 14. 6 9. 6 1. 4
TR5 100 - 25. 3 11. 9 1. 8 100 - 20. 7 8. 6 1. 1
CK 98. 7 - 42. 3 9. 9 1. 4 100 - 37. 3 6. 9 0. 8
注 :TR1～TR5 为转基因株系 ;CK为非转化对照。
Note : TR1～TR5 indicate transgenic lines ; CK represents non2transformed control .
　　正常温度下培育的上述 5 个转基因株系和非转化
对照的幼苗转至 4 ℃条件下低温处理 3d 后剪取叶片
测定相对电导率 ,结果如图 5 所示。从该图可以看出 ,
各转基因株系的叶片相对电导率都比对照低 (为对照
的 5511 %～7613 %) ,经统计分析 ,其差异均达显著或
极显著水平 ,说明水稻转基因株系的细胞膜在低温胁
迫下能保持比对照更强的稳定性。
3 　讨论
植物耐逆性属于复杂的数量性状 ,是体内多种耐
逆性机制共同作用的结果 ,采用常规育种方法进行改
图 5 　转基因水稻株系经低温胁迫处理后的
叶片相对电导率
Fig. 5 　Relative electronic conductivity of low temperature2
stressed leaves of transgenic rice lines
CK:非转化对照 ;TR1～TR5 :转基因株系
CK: non2transformed control ; TR1～TR5 : transgenic lines
271 核　农　学　报 20 卷
良难以取得大的突破。CB F 基因的组成型超表达能
够诱导植物体内多个冷诱导和脱水诱导基因的表达 ,
激活体内的多种耐逆性机制 ,从而使转基因植株的耐
逆性得到综合改良[4 ,5 ] 。作者曾用拟南芥 CB F1 基因
转化草坪草高羊茅获得了耐逆性增强的转基因植
株[13 ] ,本研究在此基础上用该基因转化水稻 ,又使获
得的转基因后代的多种耐逆性得到了提高。基因工程
改良耐逆性是目前水稻遗传转化研究的热点 ,本研究
成功获得一批耐逆性增强的转基因材料 ,相信对培育
耐逆水稻新品种具有一定意义。
在植物遗传转化研究中 ,转基因植株有潮霉素抗
性而没有 GUS 活性的现象已有不少报道[6 ,7 ,14 ,15 ] ,本研
究结果也有类似现象 ,4 株转基因植株能扩增出 hpt 基
因片段而 GUS 染色呈阴性。作者推测 ,产生这一事件
的原因之一可能是发生了转基因沉默。转基因沉默是
一种比较常见的现象[16 ] ,一般认为 ,它的发生多数与
同源序列的插入有关[17 ] 。本研究所用质粒上目标基
因 CB F1、筛选基因 hpt 和报告基因 gus 均以 CaMV 35S
为启动子、NOS 为终止子 ,这可能就是导致转基因沉默
发生的根源所在[6 ,7 ] 。由此建议 ,在构建植物表达载体
时 ,对于多个不同的基因应尽量选用不同的启动子和
终止子序列 ,以避免同源序列插入引起转基因沉默的
发生[6 ] 。当然 ,在本研究中 ,也不能排除在 T - DNA 整
合过程中发生了重组而导致 gus 基因不能正常表达的
可能性。
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