全 文 ： 核 农 学 报 2004，18(1)：55 58
Acta A咖 l Ⅳ 妇叫∞ Sinica
文章编号：1000．8551(2oo4)m一055—04
长效促红细胞生成素的放射性标记
刘国霞 曾宪垠 包伦 徐贤坤 陈志渝 刘显义
(四川I农业大学原子能农业应用研究室，四川I雅安 625014)
摘 要：采用改进 的双相氯胺．T法对 LL EPO进行碘标记 ，使 用离心超滤法分 离纯化标记混合
物 ，对标记纯化的 LL．EPO经三氯 乙酸沉淀和 SDS PAGE法鉴定放化 纯度 ，通过 网织红 细胞法
对标记前后的蛋白生物活性进行鉴定。结果表明：1．改进的双相氯胺 T法标记 LL EPO，其标
记率为 89％，比放射性为 5．82×10 Bq·／xg 蛋白，放化纯度 >96％，SDS PAGE法鉴定标记产物
同原型蛋白电泳行为一致，Rf值分别为 0．28、0．49，网织红细胞法鉴定的标记蛋白与非标记蛋
白的生物活性无差异。2．离心超滤法得到的蛋白回收率为 95％以上 ，而凝胶过滤法得到的蛋
白回收率仅为 23．82％；前者得到的标记蛋白浓度远高于后者。
关键词：促红细胞生成素；放射性碘标记；标记蛋白纯化 ；TCA沉淀法 ；SDS PAGE；网织红细胞
RADIo．LABELLING oF LoNG-LAsTING ERYTHRopOⅡeT【N
LIU Guo·-xia ZENG Xian·-yin BAO Lun XU Xian·-kun CHEN Zhi· yu LIU Xian·-yi
(Iosotope Laboratory，Sichuan Agicultural University，Ya’al，Sichuan Pro 625014)
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Abstract： e study is designed to investigate the labeling of LL—EPO，purification of labeled compound，and
therefore，to prepare the labeled LL—EPo with high purity and biological activity．LL—EPo was labelled with 125 I by
the commonused chloramiBe T and the modifed two．phase chloramiBe．T method ． respectivety．The labelled
compound Was purified by both gel filtration and ultrafiltration method．respectively． e purity of the labeled LL—
EPO Was determined by both trichloroacetic acid(TCA)and SDS PAGE method，and the biologi【cal activity Was
determined by the reticulocyte counting method．The results demonstrated that the iodine incorporation and specifc
radioactivities were 89％ and 5．82×10’Bq‘ 一‘f0r LL—EPO labelled by the modified two—phase chloramine—T
method and were 20．65％ and 3．62×10’Bq· g一‘for LL．EPO labelled by the common used chlOramiBe—T method ，
respectively． e purity of labelled LL—EPO purified by both gel filtration and ultrafiltration were over 96％ with
TCA method purification．Th e labeled LL EPO showed two bands with Rf of0．28 an d 0．49，respectively，which iS
identical to that of standard LL EPO thmugh SDS—PAGE．There was no lOSS of biological activity of LL EPO after
labelling as determined by reticulocyte counting method．
Key words：erythropoietin；radio—labelling；purification of the labelled protein；TCA；SDS—PAGE；reticulocyte
促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肾脏分泌的调节红细胞生成的酸性糖蛋白激素。当肾功能发
生障碍时，EPO分泌减少，并导致贫血 。重组促红细胞生成素(rhEPO)已广泛应用于临床治疗各种类
型的贫血。但限制EPO更广泛应用的因素是用药次数多(皮下或静脉注射，每周3次) ，这不仅使患者
治疗费用增高，而且带来很多痛苦。针对这一问题，有关单位正研发一种长效促红细胞生成素(
EPO)，在保证药效的前提下，以减少给药次数或给药量。但该长效 EPO还未正式注册，有必要对其进行
收稿 日期 ：2002．07一l5
作者简介：刘国霞(1977一)，女，山东武城人，硕士，现在山东农业科学院高新技术研究中心工作。
*通讯作者
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56 核 农 学 报 l8卷
临床前的有关研究工作(如 EPO的标记、纯化)，为药代动力学研究提供必要条件和保证。
1 材料与方法
1．1 材料
长效促红细胞生成素由国家医药总局四川I抗菌素工业研究所提供。Na I，放化纯度95％，NENTM
Life Science Products，Inc．产品。BALB／C小鼠(体重 18～22g)由国家医药总局四川I抗菌素工业研究所提
供。fq"．20087免疫探测器为西安二六二厂生产；高速台式离心机为上海安亭科学仪器厂生产；DYY一Ⅲ
28A型电泳槽为北京六一仪器厂生产 ；显微镜为 OLYMPUS产。
1．2 方法
常规氯胺．T法参照尹伯元法 。双相氯胺．T法参照 Tejedor法 并加以适当的改进。为使反应体
系密封性更好，取一约2ml带橡胶塞的玻璃瓶做标记反应瓶，用不锈钢丝穿过橡胶塞，弯曲成三角形，作
为滤纸架。其它步骤如滤纸处理、标记反应均同参考文献[5]。
柱层析法分离纯化标记物，预先经 1％BSA饱和的 Sephadex G．100层析柱(66×1cm)，用 0．5M PB
(pH7．6)洗脱，调整流出液速度为 0．85ml／2min，分部收集，每2min收集一管，直到所测放射性计数极低。
从各收集管分别取 10 ，用 fq"．20087免疫探测器测量放射性，绘制洗脱图谱。离心超滤法分离纯化标
记物参照《蛋白质技术手册》 J。
标记蛋白放化纯度的鉴定，①酸沉淀法：参照测定标记神经因子放化纯度的方法 ，取标记蛋白峰
各管流出液 10 ，加 175 蒸馏水、15 正常鼠血浆，混匀后加入 20％三氯乙酸(TCA)200／11，混匀，
3000rpm离心30min，用 fT-20087免疫探测器测定总放射性及沉淀放射性。②电泳法(SDS—PAGE)：参照
文献[6]的方法进行常规电泳。考马斯亮蓝 R．250染色、脱色后将标记 LL-EPO部分切割成 4mm宽的胶
条，在 fq"．20087免疫探测器上测定放射性，并绘制扫描图谱。③蛋白定量：采用考马斯亮蓝染色法 ，参
照 BradfordL8 及文献[6]的方法分别制定标准曲线来定量柱层析及离心超滤纯化的标记蛋白浓度。④生
物活性测定：采用网织红细胞法，按卫生部{rhEPO半成品质检规程》进行。将所得数据用统计学方法进
行处理，以平均数 ±标准差表示，用统计学 t检验进行差异显著性分析。
2 结果
2．1 放射性碘化标记
用常规氯胺一T碘标法标记 LL-EPO，经柱层析纯化，洗脱图谱见图 1，其中第 1峰为标记蛋白峰，第2
峰为游离的 I组分。计算出常规氯胺一T法标记的LL—EPO的标记率和标记 LL-EPO的比放射性分别是
20．65％和 3．62 X 105Bq·gtg一。双相氯胺．T法标记的LL．EPO，用三氯乙酸法测得的碘标记率为 89％，标
记 LL-EPO的比放射性为 5．82 X 105Bq·gtg～。
2．2 放化纯度鉴定
碘化反应液经柱层析的蛋 白峰各管用酸沉淀法测得的放化纯度均大于 97％，平均放化纯度为
99．1％。经离心超滤法纯化的 I-LL-EPO放化纯度平均为96．02％。SDS．PAGE电泳结果表明(图2)，标
记 LL-EPO的放射性检出位置与非标记 I工广EPo
的位置完全吻合，电泳图谱显示了两个条带，
值分别为 0．28、0．49，分子量高的条带显色浅、短
(约 4mm)，分子量 低 的显 色深，条带 长 (约
8mm)，说明标记前后的分子结构没有改变。在
I．LL．EPO的电泳扫描图谱上亦在同样的位置
有两个放射峰，且分子量低的蛋白峰放射性低，
分子量高的蛋白峰放射性高。以两个蛋白峰的
0 20 4o 6o 舳 100 120
No．／10pl
图 1 I-LL-EPO层析分离纯化图
Fig．1 Purification of iodinated LL-EPO
with gel chromatography
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1期 长效促红细胞生成素的放射性标记 57
放射性总计数除以泳道全程的放射性总计数，即得到标记蛋白的放化纯度为 99．6％。可见上述标记和
分离纯化方法所获得的 I-LL-EPO放化质量满足药代动力学研究需要。
2．3 蛋白质定量
鉴于由两种不同纯化方法得到的标记蛋白浓度差异很大，试验采用两套方案制定标准曲线。按照
Bradford微量蛋白定量法 ，以 1腭 牛血清白蛋 白作为最低含量点 ，得到的标准曲线见图 3一A，用以定量
柱层析法纯化的标记 LL-EPO，其浓度为 1．81ug／ml；按照文献 的原则以 2．5tg牛血清白蛋白作为最低
含量点，制定标准曲线来定量由离心超滤法纯化的标记 LL EPO，得到的标准曲线见图3一B，标记 LL-EPO
的浓度为 807~g／ml。
A
90ooo0
8OOOo0
7OO0o0
6ll0O0o
5ooOoo
4ooO0o
3OOOo0
2ooOoo
lOOOo0
O
0 5 l0 l5 20
条带／,In
slicenumber
B
图 2 I-LL-EPO及非标记 EL-EPO电泳 图谱
Fig．2 SDS—polyacrylamide gel electrophoresis of I-LL-EPO and non．1abelled LL-EPO
A为 LL-EPO电泳图谱，1．非标记 LL-EPO，2．标记 LL-EPO；B为标记 LL-EPO电泳之后
切胶进行胶条 7计数得到的放射性扫描图谱
A shows the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the lion·labelled and labeled LL-EPO：
B showsthe radioactivity ofthe extrs~ from slicegels oflabelled LL-EPO．
2．4 蛋白回收率 0．3『r-o
．
0234x~4)．OII7 o‘6『y=jD．0252x+0．0293
根据标记时加入的总蛋白与纯化完成后得到 孑：iw - ． ：丢 ． 皇
： ． 同纯化方 的 皇 回 。 自含量， 蛋0自含5量胛．劬10 15 20 率柱层析法的回收率为
23．82％，离心超滤法纯化 A 。。 B ’。
的蛋白质回收率为 95．67％。 图3 考马斯亮蓝法蛋白定量标准曲线
2．5 生物活性鉴定 Fig
． 3 Standard curves forthe quantitati0n of
采用网织红细胞法鉴定改进双相氯胺一T法 protein by using the Coomassie Bfiliant
标记、离心超滤纯化后的标记 LL-EPO的生物活 BIue G250 assav
性，并与非标记 LL-EPO的生物活性进行了比较， A：凝胶过滤法纯化- I—LL-EPO；B：超滤法纯化， I．LL-EPO
结果见表 1。试验中发现标记 LL-EPO注射组中 1 A： I．L-EPO purifed with gelfiltrati。n；
只雌性小白鼠精神状态不好，血涂片检查时发现 B： l·LL-EPO purifed with ultraflltration
血细胞很少，网织红细胞少，只有 3～7个网织红细胞／1000个红细胞，其数值在本组数值的3倍标准差
之外，所以统计分析时将其剔除在外。经 t检验，标记 LL-EPO组的网织红细胞数与非标记 LL-EPO组的
网织红细胞数差异不显著(P>0．05)，说明改进双相氯胺一T法对 LL—EPO的生物活性没有影响。
表 1 注射 4IU非标记 LL-EPO、标记 LL-EPO小曩周围血网织红细胞计 数值 (1110~ 红细胞 l
Table 1 The number of reticulocyte in peripheral blood among non—labeled LL-EPO injection(4IU)
and labeled LL-EPO injection(4IU)mice(1／1 000RBC)
∞0_【、赫拳每疆
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3 讨论
Acta AgriculturaeNucleatae Sinica
2004，l8(1)：55—58
3．1 蛋白质多肽的碘标记方法
改进的双相氯胺．T法对 LL．EPO的碘标记率接近 90％，比常规氯胺．T法的标记率(20．65％)高，其
原因可能是常规氯胺．T法为减少氧化剂对蛋白的损伤，反应时间短，碘不能充分得到利用，而双相氯胺．
T法氧化作用较缓和，反应时间长，反应充分跟 Tejedor用双相氯胺．T法标记蛋白 A、溶解酵素和核糖体
的标记率 相近，比从玉文 用双相氯胺．T法标记重组 EPO的标记率(20．7％)高。其原因可能是：(1)
因为当投入的放射性碘量一定时，加入的蛋白量多，能获得高碘利用率n。。；(2)反应体系密封性好，氧化
剂氯气的浓度高；(3)蛋白质的结构、分子组成的不同可以造成标记效率的差异。该方法的标记率比其
它标记方法如乳过氧化物酶法、联接标记法高，与 IMogen法接近。范我等¨¨ 用联接标记法对白介素．8
进行碘标记，标记率为57％，Salacinski等 ¨用乳过氧化物酶法标记亮氨酸．脑啡肽的标记率为 40％，高
云朝等 用 IMogen法标记纤维蛋白原的标记率为 86％ 95％。
经放化纯度及生物活性鉴定，标记蛋白放化纯度高，生物活性好，说明该方法对蛋白损伤小，与
Tejedor等 、从玉文等 报道的结果一致。其原因可能是由氯胺．T跟水在 cl一存在的条件下反应产生
的 Cl：分子从滤纸条上扩散并慢慢溶解到水相中，而且 Cl 的氧化能力 比氯胺．T弱 ，跟 I．反应产生的活
性碘( I )浓度低，能够更加特异性的置换分子表面苯环上的氢，而深入到分子 内部跟其它基团反应的
几率降低，从而对蛋白质氧化损伤减小。Tejedor等 曾就氧化损伤做过试验，反应体系中不加 Na I，除
去碘置换反应造成蛋白活性损伤的可能性，那么对蛋白活性的影响因素只剩下氧化剂，则双相氯胺．T
法对溶解酵素活性无损伤，而常规氯胺．T法使溶解酵素大部分失活。说明双相氯胺．T法氧化损伤小。
改进的双相氯胺．T法具有以下优点：操作简单，反应温和，常温下进行，条件易于控制；标记效率
高 ；氧化剂用量可以灵活调整；对蛋白生物活性影响小。至于该方法是否可以用于其它生物活性蛋白的
标记 ，尚需进一步研究。
3．2 标记蛋 白的分离纯化方法
本试验采用凝胶过滤层析方法纯化 了标记 LL．EPO，取得了较满意的结果 ，标记蛋白与游离碘能较
好的分开。但是该方法的突出缺点是费时(完成整个层析过程大约需要 2d的时间)、费力，标记蛋白稀
释严重，最后体积达到5ml，蛋白浓度仅为 1．81tg／ml，使蛋白定量困难。而且蛋白回收率低，标记蛋白大
量损失。离心超滤法作为近年来发展起来的一种新方法，可以克服柱层析的上述缺点，最适于生物大分
子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活
性，回收率高等优点。国外已经用此法来纯化浓缩尿中的EPO_l ，或浓缩 EPO样品便于保存 ¨，说明本
法不会损伤 EPO的活性。但是尚未看到离心超滤法用于标记混合物的分离，本试验尝试了用此法分离
标记蛋白与游离碘，取得了较好的结果，证明此方法快速，简便，蛋白回收率高，适合于纯化标记蛋白。
离心超滤法的关键是滤器的选择。根据 目的蛋 白的大小，选择合适分子截 留量的滤器 ，通过离心 ，
小的游离碘及断裂的小肽透过滤膜，而大的标记蛋白留在滤膜上。本法的可能不足之处是若反应液中
存在大的蛋白聚合物，则不能区分聚合物与原型蛋白。不过从理论上讲，改进双相氯胺．T法反应温和，
不会使蛋白形成大的聚合物。而且，由电泳结果看，这种聚合物是不存在的。
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(下转第 35页)
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Acta Agricuhurns Nucleatae Sinica
2004，18(1)：33～35
3 小结
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3．1 辐照酱排骨灭菌剂量越高，灭菌效果越明显。灭菌剂量与细菌残存对数值成线性相关。根据试验
结果可以看出肉品的初染菌数越高，所需辐照杀菌剂量越大。所以在加工和销售过程中要严格控制产
品的初菌数，使之符合国家规定的熟肉制品卫生标准。
3．2 3种致病菌在酱排骨中耐辐照性较差，用 <2kGy的剂量即可全部被杀灭。其耐辐照性的强度顺序
为：金黄葡萄球菌 >沙门氏菌 >大肠杆菌。
3．3 本实验条件下酱排骨的 D．。和 D值分别为 6．23和3．75 kGy。在选定最终的吸收剂量时即可以细
菌总数的D值作为依据。微生物数量低于 100cfu／g，在今后的贮存期中不会有有意义的增殖 。考虑
其安全性，酱排骨的推荐辐照剂量可定为4kGy。符合辐照食品卫生国家标准(GB14891．1．97)中辐照熟
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