全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062511205
高静压对蜡样芽孢杆菌的致死与损伤效应
黄训端1 ,2 　潘　见1 　谢慧明1 　王海翔1 　杨　毅1 　王　武1
(11 合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心 ,安徽 合肥　230009 ; 21 安徽大学生命科学学院 ,安徽 合肥　230039)
摘 　要 :本试验采用响应曲面法的 Box2Behnken 设计 ,研究了高静压处理对蜡样芽孢杆菌生命活动的影
响。结果表明压力处理导致了蜡样芽孢杆菌的致死作用与损伤效应。利用 Design Expert 软件建立了致
死率的响应模型 , Y = 6218 + 2712 x1 + 713 x2 + 312 x3 + 110 x21 + 216 x22 + 110 x23 - 210 x1 x2 - 110 x1 x3 -
017 x2 x3 。方差分析表明模型达到极显著水平 ,模型的系数显著性检验提示压力、温度、时间以及压力与
温度的交互作用对致死率有显著影响。试验还运用 VITEK细菌鉴定方法快速检测了蜡样芽孢杆菌压
致生理生化损伤 ,结果证明压力导致菌体对外界营养分子利用以及药物敏感性等方面的特性发生了改
变。
关键词 :高静压 ;蜡样芽孢杆菌 ;响应曲面法 ;致死率 ;生理生化损伤
LETHAL AND DAMAGED EFFECTS OF HIGH HYDROSTATIC PRESSURE ON Bacillus cereus
HUANG Xun2duan1 ,2 　PAN Jian1 　XIE Hui2ming1 　WANG Hai2xiang1 　YANG Yi1 　WANG2Wu1
(11 Engineering Research Center of Bio2Process , Ministry of Education , Hefei University of Technology , Hefei , Anhui 　230009 ;
21 School of Life Sciences , Anhui University , Hefei , Anhui 　230039)
Abstract : The experiment was applied Box2Behnken design of response surface methodology to study the effects of high
hydrostatic pressure on Bacillus cereus . The results showed that high pressure could cause bacteria death and damage. Based
on experimental results , the response model of lethal rate was established , Y = 6218 + 2712 x1 + 713 x2 + 312 x3 + 110 x21 +
216 x22 + 110 x23 - 210 x1 x2 - 110 x1 x3 - 017 x2 x3 . Analysis of variance implied that the model was significant at 0. 01 level .
Tests of model coefficient indicated that pressure , temperature , time , and interaction between pressure and temperature were
significant factors to lethal rate. VITEK method were used to measure the physiological and biochemical damages , it was
verified that pressure could change Bacillus cereus utilization of nutrient material and sensitivity drug.
Key words : high hydrostatic pressure ; Bacillus cereus ; response surface methodology ; lethal rate ; physiological and
biochemical damages
收稿日期 :2006201204
基金项目 :安徽省教育厅重点科研项目 (2004kj004zd) ;农产品生物化工教育部重点实验室开放基金 (NKF2004005)
作者简介 :黄训端 (19682) ,男 ,安徽人 ,副教授 ,在读博士生 ,研究方向为高压生物科学与技术 ,Email :xiulingwww @163. com。潘见为通讯作者。　　蜡样芽孢杆菌 ( Bacillus cereus) 系革兰氏阳性芽孢菌 ,广泛存在于自然界 ,如空气、土壤、灰尘、水体等 ,可造成蔬菜、水果、米饭、乳类、肉类、水产品等污染。蜡样芽孢杆菌导致的食物中毒事件不断发生 ,有时呈规模暴发[1 ] 。随着人们生活水平的提高 ,食品微生物及其安全卫生问题引起了空前关注。近些年来 ,国内外学者采用高静压处理食物 ,创造了高压杀菌技术 ,成为 非热杀菌的主要手段之一 ,被誉为食品领域的十大高新技术。压力不仅可以用于杀菌 ,其功能还被拓展到酶类钝化、肉类嫩化、食品解冻、物料改性等多方面 ,以获得高品质的食品[2～7 ] 。高压在食品与生物材料的应用方面前景广阔[8 ] 。本试验以蜡样芽孢杆菌为对象 ,采用高静压处理 ,研究压力对菌体的致死作用 ,检测压力对菌体造成的
115　核 农 学 报　2006 ,20 (6) :511～515Journal of Nuclear Agricultural Sciences
生理生化损伤 ,旨在建立微生物压力致死模型 ,探讨压
力对生命体的影响机制 ,为科学、高效利用高压杀菌技
术提供依据。
1 　材料与方法
111 　试验菌种
蜡样芽孢杆菌[ CMCC(B) 63301 ] ,由安徽出入境检
验检疫局生物技术中心提供。37 ℃营养琼脂培养至对
数期 ,将菌体洗脱至无菌生理盐水中 ,试验时菌液浓度
为 115 ×108 cfuΠml。
112 　试验设计
采用响应曲面法的Box2Behnken 设计 ,试验因素水
平及编码见表 1 ,高静压处理后蜡样芽孢杆菌的致死
率 Y [ Y = (1 - logN iΠlogN0 ) ×100 % ,其中 N i 为处理
后存活菌数 , N0 为初始菌数 ]为响应值 ,假设由最小二
乘法拟合的二次多项式方程为 :
Y = B0 + B1 x1 + B2 x2 + B3 x3 + B11 x
2
1 + B22 x
2
2 +
B33 x
2
3 + B12 x1 x2 + B13 x1 x3 + B23 x2 x3 (1)
其中 Y 代表致死率 , B0 为常数项 , B1 、B2 、B3 分
别为线性系数 , B12 、B13 、B23 为交互项系数 , B11 、B22 、
B33为二次项系数。
表 1 　高静压处理蜡样芽孢杆菌的试验因素与水平
Table 1 　Experimental factors and levels of Bacillus cereus
treated with high hydrostatic pressure
因素
factor
编码值
coded 3 真实值actual 水平 level
- 1 0 + 1
压力 pressure (MPa) x1 X1 100 300 500
温度 temperature ( ℃) x2 X2 20 40 60
时间 time ( min) x3 X3 10 15 20
注 : 3 , x1 = ( X1 - 300)Π200 ; x2 = ( X2 - 40)Π20 ; x3 = ( X3 - 15)Π5
Note : 3 , x1 = ( X1 - 300)Π200 ; x2 = ( X2 - 40)Π20 ; x3 = ( X3 - 15)Π5
113 　微生物检测
按中华人民共和国食品微生物检验标准 ( GB47892
2003) ,采用菌落计数琼脂片 (美国 MMM 公司生产) ,
37 ℃培养 48h ,进行菌数计数。
114 　高静压设备
压力装置为本中心自行设计研制 ,容量 1L ,压力
范围为 0～600MPa ,工作温度 0 ℃～60 ℃,传压介质为
蓖麻油。
115 　VITEK检测
利用 VITEK快速检测蜡样芽孢杆菌的生化反应 ,
检测时使用 BAC(芽孢菌检测卡) ,上样前将菌液调至
012 麦氏浊度 ,用充填机将样品注入 BAC 中 ,启动真空
泵 ,以负压使菌液均匀进入每个生化反应小室 ,封口 ,
排除气泡。对 BAC 卡进行编号 ,置于 37 ℃恒温箱培
养 ,由 VITEK系统自动检测、数据分析并给出各个生
化反应结果。
2 　结果与分析
211 　高静压致死蜡样芽孢杆菌的响应曲面分析
21111 　高静压致死蜡样芽孢杆菌回归模型的建立
根据 Box2Behnken 响应曲面设计要求 , 开展了 17
组蜡样芽孢杆菌高静压处理实验 ,菌体致死率的测定
值和预测值见表 2 ,利用 Design Expert (version 710)进行
回归分析 ,得到多元二次回归模型 ,见方程 2。
表 2 　高静压处理蜡样芽孢杆菌的试验设计与响应
Table 2 　Experimental designs and responses of Bacillus
cereus treated with high hydrostatic pressure
序号
trial
No.
因素 factor 响应 response Y
x1 x2 x3
实验值
experimental ( %)
预测值
predict ( %)
1 0 0 0 6312 6218
2 0 1 - 1 7116 7111
3 - 1 0 - 1 3313 3314
4 - 1 - 1 0 3018 2918
5 0 0 0 6413 6218
6 1 1 0 9718 9818
7 - 1 0 1 4112 4117
8 0 - 1 - 1 5411 5511
9 0 - 1 1 6213 6219
10 1 0 1 9413 9412
11 0 0 0 6210 6218
12 - 1 1 0 4810 4815
13 0 1 1 7712 7612
14 1 - 1 0 8817 8812
15 0 0 0 6215 6218
16 1 0 - 1 9011 8916
17 0 0 0 6119 6218
注 : x1 、x2 和 x3 ,分别代表压力、温度和时间因素
Note : x1 , x2 and x3 , represents pressure , temperature and time , respectively
　　 Y = 6218 + 2712 x1 + 713 x2 + 312 x3 + 110 x21 +
216 x22 + 110 x23 - 210 x1 x2 - 110 x1 x3 - 017 x2 x3 (2)
对模型进行方差分析和显著性检验 ,结果见表 3。
由表 3 可以看出 : 模型 F = 527198 > [ F0101 (9 ,4) =
14166] ,模型 P < 010001 ,表明模型极显著 ,不同处理
会引起不同响应。F失拟 = 1190 < [ F0105 (9 ,3) = 8181 ] ,
失拟项 P = 012713 > 0105 ,模型失拟度不显著。模型
决定系数 R2 = 019985 ,调整决定系数 Adjusted R2 =
215 核　农　学　报 20 卷
019966 ,表明模型可以解释 99166 %的响应值变化 ,模
型拟合度高。因此 ,所建模型可用于蜡样芽孢杆菌压
致死亡效应的分析和预测。
表 3 　高静压处理蜡样芽孢杆菌回归模型的方差分析表
Table 3 　Analysis of variance for regressive equation of
Bacillus cereus treated with high hydrostatic pressure
方差来源
source
平方和
sun of
squares
自由度
DF
均方
mean
square
F 值
F value
P 值
P value
模型 model 6493135 9 721148 527198 < 010001 33
x1 5918172 1 5918172 4331130 < 010001 33
x2 430171 1 430171 315119 < 010001 33
x3 83185 1 83185 61136 010001 33
x1 x2 16140 1 16140 12100 010105
x1 x3 3142 1 3142 2150 011575
x2 x3 1169 1 1169 1124 013028
x
2
1 4109 1 4109 2199 011274
x
2
2 27159 1 27159 20119 010028 33
x
2
3 3188 1 3188 2184 011358
残差 residual 9157 7 1137
失拟 lack of Fit 5162 3 1187 1190 012713
误差 pure Error 3195 4 0199
总和 total 6502192 16
决定系数 determination coefficient R2 = 019985 ;
调整决定系数 adjusted determination coefficient R2 = 019966
注 : 33 表示极显著水平 ( P < 0101)
Note : 33 indicates significance at 0101 level
　　从系数项的 P 值来分析 , x1 、x2 、x3 、x1 x2 达到极
显著水平 ( P < 0101) ,提示压力、温度和时间 ,以及压
力与温度的交互作用对蜡样芽孢杆菌的致死作用产生
了极显著影响。
21112 　压力与温度对蜡样芽孢杆菌致死率的曲面响
应　根据 21111 建立的模型 ,可进一步考察蜡样芽孢
杆菌的压力致死作用。图 1 为固定时间为 15 min 的条
件下 ,压力与温度因素的响应曲面和等高线 ,该图反映
了压力 ( P < 0101) 、温度 ( P < 0101)及两者交互作用 ( P
< 0105)对蜡样芽孢杆菌压力致死效应产生的显著影
响。由图可知 ,在相同的温度下 ,压力越高致死率越
高 ,经计算 ,每增加 100MPa ,致死率增加 14 %～15 % ;
在相同的压力下 ,温度越高致死率越高 ,每增加 10 ℃,
致死率提高 2 %～3 %。在上述两因素的共同作用下 ,
致死率迅速增加 , 图 1 显示两因素最高水平即
500MPa、60 ℃时 ,致死率的理论值为 9815 % ,基本杀灭
菌体。
21113 　压力与时间对蜡样芽孢杆菌致死率的曲面响
应 　图 2 为固定温度为 40 ℃的条件下 ,压力和时间因
素的响应曲面和等高线。由图 2 可知压力 ( P < 0101)
和时间 ( P < 0101)是蜡样芽孢杆菌的致死率显著影响
图 1 　处理时间 15min 时压力与温度对蜡样芽孢杆菌致
死率影响的响应曲面和等高线
Fig. 1 　Response surface and contours of pressure and
temperature effect of on lethal rate of Bacillus
cereus at the treated time 15min
因素 ,但两者交互作用 ( P > 0105) 不明显。在时间固
定不变的情况下 ,随着压力的增加 ,致死率增加 ,处理
时每增加 70MPa 左右 ,致死率提高 10 % ;在压力固定
不变的情况下 ,随着时间的增加 ,致死率增加 ,但增加
的幅度较小。
图 2 　40 ℃压力与时间对蜡样芽孢杆菌致死率
影响的响应曲面和等高线
Fig. 2 　Response surface and contours of pressure and
time effect of on lethal rate of Bacillus cereus at 40 ℃
21114 　温度与时间对蜡样芽孢杆菌致死率的曲面响
应 　图 3 为固定压力为 300MPa 的条件下 ,温度与时间
对蜡样芽孢杆菌致死率的影响。致死率随着温度的增
加而增加 ,但不同时间水平 ,增加的幅度不同 ,低水平
阶段比高水平阶段增加快 ;致死率随着时间的增加而
增加 ,但增加的幅度明显低于温度因素。温度 ( P <
0101)与时间 ( P < 0101) 均能显著影响致死作用 ,但两
者交互作用不明显 ( P > 0105) 。在中等压力水平下 ,
温度与时间因素处于最高水平时能杀灭 75 %的菌体 ,
若要再提高致死效果 ,必须增加处理压力。
21115 　单因素对蜡样芽孢杆菌致死率的影响 　图 4
为单因素对蜡样芽孢杆菌致死率影响的响应曲线 ,即
315　6 期 高静压对蜡样芽孢杆菌的致死与损伤效应
图 3 　压力为 300MPa 时温度与时间对蜡样芽孢杆菌
致死率影响的响应曲面和等高线
Fig. 3 　Response surface and contours of the effect of
temperature and time on lethal rate of Bacillus
cereus at pressure of 300MPa
将其他两个因素固定在中等水平的条件下 ,每个独立
因素对致死率变化的影响。从图 4 明显可以看出 ,压
力对致死率的影响幅度最大。在本试验条件下 ,压力
的作用从最低水平到最高水平 ,可使致死率的预测值
提高54 % ,而温度、时间的影响 ,分别可使致死率的预
测值提高 14 %、7 %。
图 4 　单因素对蜡样芽孢杆菌致死率的影响
Fig. 4 　Effect of single factor on
lethal rate of Bacillus cereus
21116 　模型的验证 　将各因素置于高水平 ,选择以下
3 组试验来检测菌体致死情况 ,处理参数 : 500 MPa、
60 ℃、18min ;500 MPa、58 ℃、20 min ; 490 MPa、60 ℃、20
min ,结果证明菌体完全致死。将以上 3 组参数代入方
程 2 ,通过计算 ,致死率的理论值达到 100 %。由此可
以验证所建模型是有效可信的。
212 　高静压对蜡样芽孢杆菌生理生化损伤的检测
为检测压力对菌体造成的损伤 ,课题组开展了 1
组实验 ,对象为蜡样芽孢杆菌 (1010 CFUΠml) ,处理条件
为室温下施压 15min ,压力分别为 100、300、500MPa ,以
未处理的菌株为对照 ,利用 VITEK微生物自动鉴定手
段 ,输出各处理样品的 31 个生理生化反应结果 ,见表
4。通过逐项比较 ,压力导致蜡样芽孢杆菌生理生化指
标发生了变化 ,分别是 :100MPa 发生变化的有葡萄糖、
甘露糖、棉子糖、水杨素、淀粉、氰化钾、7 %氯化钠、乙
酸钠、植病链菌素等 9 项 ;300MPa 有肌醇、半乳糖、木
糖、甘露糖、棉子糖、腭糖、淀粉、氰化钾、乙酸钠、植病
链菌素等 10 项 ;500MPa 有肌醇、半乳糖、阿拉伯糖、木
糖、甘露糖、棉子糖、腭糖、淀粉、氰化钾、乙酸钠、植病
链菌素等 11 项。从这些生化项目分析 ,压力处理影响
蜡样芽孢杆菌对大分子糖类的利用 ,如 100MPa 以上就
不能利用淀粉 ,而压力处理后对小分子糖的利用能力
增加 ;在药物抗性方面 ,压力处理后蜡样芽孢杆菌能在
氰化钾上生长 ,对植病链菌素敏感。
表 4 　高静压对蜡样芽孢杆菌生理生化反应的影响
Table 4 　Effects of high hydrostatic pressure on
physiological and biochemical reactions of Bacillus cereus
生理生化反
physiological and
biochemical reactions
压力 pressure (MPa)
0 100 300 500
阴性对照 NEG 2 2 2 2
蔗糖 SUC + + + +
红四氮唑 TZR 2 2 2 2
塔格糖 TAG 2 2 2 2
葡萄糖 GLU + 2 + +
肌醇 INO 2 2 + +
半乳糖 GAL 2 2 + +
阿拉伯糖 ARA 2 2 2 +
木糖 XYL 2 2 + +
甘露糖 MAN 2 + + +
棉子糖 BAF 2 + + +
水杨素 SAL 2 + 2 2
苦杏仁苷 AGA 2 2 2 2
菊糖 INU 2 2 2 2
核糖 RIB 2 2 2 2
苹果酸 MLT + + + +
海藻糖 TRE + + + +
腭糖 PLA 2 2 + +
山梨醇 SOR 2 2 2 2
N2乙酰葡萄糖胺 NAG + + + +
淀粉 AMY + 2 2 2
氰化钾 KCN 2 + + +
7 %氯化钠 7NC 2 + 2 2
苯乙醇酸 MEN + + + +
竹桃霉素 OLD 2 2 2 2
乙酸钠 NAA 2 + + +
阿糖醇 ARB 2 2 2 2
植病链菌素 PAS + 2 2 2
萘啶酸 NAE 2 2 2 2
七叶苷 ESC + + + +
嗜热性 THRM 2 2 2 2
415 核　农　学　报 20 卷
3 　结论与讨论
311 　压力作为独立的热力学因素 ,可对生命体以及生
命活动产生直接影响。压力对微生物的作用过程相当
复杂 ,产生的影响是全方位、多角度的。归纳起来 ,主
要有两个方面 :一方面是压力对生命体的破坏作用 ,如
机械作用 (加压剪切力、卸压膨爆等) 、分子弱作用力的
断裂、生物大分子结构的破坏等 ,这些作用可能导致生
物膜破裂、胞内物泄漏、蛋白质变性或解聚、细胞质凝
胶化、酶活改变以及生理代谢障碍等 ,从而引起生命体
的损伤 ,甚至致死 ;另一方面是生命体对压力损伤的修
复作用 ,生物对压力有一定的适应能力 (如海洋生物可
承受几十至几百 MPa 压力) ,通过产生应激蛋白、抗压
蛋白等来应对环境变化 ,受到损伤生命体可进行生理
性修复 ,不可修复的则会导致突变 ,甚至死亡。压力不
同对生命活动影响程度不同 ,压力高 ,损伤加重 ,致死
率提高 ,因此 ,从理论上说 ,足够高的压力强度可完全
杀灭任何微生物。然而 ,在施压过程中 ,随着压力的增
加 ,运行成本 (能耗、压力釜寿命、磨损折旧等) 呈指数
增加。为了使这项技术具有经济性和实用性 ,一般应
尽量采用较低的压力。本试验采用了 500MPa 以内的
压力处理 ,同时辅以温度、时间因素协同 ,结果显示 ,高
静压造成了微生物的死亡或生理生化损伤 ,并在三因
素处于高水平时 ,完全杀灭了菌体。“高静压杀菌”作
为一项“冷杀菌”新技术 ,是对传统热力杀菌的重大变
革。由于设备成本较高 ,在生产上可用于热敏性的食
品或物料杀菌 ,这样既达到了杀菌目的 ,又防止了因物
料的热分解而导致品质变化 ,从而提高产品的市场竞
争力。
312 　不同压力处理 ,蜡样芽孢杆菌的死亡率不同。本
文利用响应曲面法分析 ,对蜡样芽孢杆菌压力致死效
应进行分析 ,快速建立了致死率响应模型。经方差分
析 ,所建立的模型显著、拟合度高 ,从而为开发高效的
杀菌工艺提供参考。模型系数显著性检验表明 ,压力、
温度、时间以及压力与温度的交互作用对致死率产生
显著影响。在本试验条件下 ,压力影响致死率的幅度
最大 ,温度次之 ,时间最小。压力与温度的交互作用显
著 ,提示在非热力杀菌过程中 ,适当提升温度具有协同
作用 ,有利于杀菌效果的提高。
313 　由于检测手段的限制和损伤的复杂性 ,高静压处
理后细菌生理生化损伤的检测成为一大难题。VITEK
是国际上最先进的微生物自动鉴定系统 ,主要用于微
生物种类鉴定、生化反应检测以及药敏实验[9 ,10 ] 。本
试验首次将 VITEK方法运用到压致损伤的检测上 ,结
果证明压力导致蜡样芽孢杆菌对外界营养分子利用以
及药物敏感性等方面的特性发生了改变 ,据此推测压
致损伤或损伤累积可能是死亡的原因之一。如压力导
致蜡样芽孢杆菌对多糖利用度的下降 ,为适应环境菌
体增加了对单糖及小分子糖的利用 ,但周边可利用的
小分子糖总是有限的 ,最终会使菌体得不到营养而死
亡。
314 　影响高静压致死微生物的因素很多 ,如不同类型
(革兰氏阳性与阴性菌、芽孢菌与非芽孢菌等) 和种类
的微生物对压力的耐受能力不同 ;微生物的不同生长
发育阶段 (对数期、稳定期等)对压力敏感性也不同 ;菌
液的 pH值、组成成分、菌液浓度等 ,以及施压技术 (动
态与静态施压等)和参数 (压力、温度、时间、加压与卸
压速度等)对致死效应都有重要影响。为此 ,课题组将
深入研究 ,以进一步阐释压力致死微生物的一般规律
与作用机制。
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