全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 012023204
高粱茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究
张明洲1 , 2 　崔海瑞1 　舒庆尧1 　夏英武1
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ; 21 中国计量学院生命科学学院 ,浙江 杭州　310018)
摘 　要 :本文对高粱茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。不同基因型的茎尖再生频率有很大差
异 ,说明基因型是影响茎尖再生的一个重要因素。在 9 种不同的激素组合中 ,以 0125mgΠL KT、015mgΠL
BAP 和 0125mgΠL IAA 对茎尖的再生效果最好。在 MS 培养基的基础上 ,采用 B5 培养基维生素并添加
200mgΠL L2Asn ,10mgΠL 抗坏血酸和 100mgΠL PVP 可提高茎尖再生频率。对农杆菌介导高粱茎尖转化的
因子进行了优化 ,获得较高转化频率的条件为 :茎尖预培养时间 3d ,在 OD600值为 015 农杆菌菌液中感染
10min ,共培养 3d。
关键词 :高梁茎尖 ;离体培养 ;遗传转化 ;根癌农杆菌
REGENERATION SYSTEM AND INFLUENCING FACTORS FOR GENETIC
TRANSFORMATION OF SORGHUM SHOOT APEX
ZHANG Ming2zhou1 , 2 　CUI Hai2rui1 　SHU Qing2yao1 　XIA Ying2wu1
(11 Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029 ;
21 College of Life Science , China Jiliang University , Hangzou , Zhejiang , 310018)
Abstract : Regeneration system and influencing factors for genetic transformation of sorghum shoot apex were studied.
Regeneration frequency varied obviously with genotypes , suggesting that the genotype is one of the important factors to the
regeneration of shoot apex. Among 9 different combination of regulator tested , the 0125mgΠL KT combined with 015mgΠL BAP
and 0125mgΠL IAA was the best for the generation. The regeneration frequency of sorghum shoot apex was also increased by
the supplement of 10mgΠL ascorbic acid , 200mgΠL PVP , 100mgΠL L2Asn and vitamins as listed in B5 to the MS medium.
Factors affecting transformation of shoot apex mediated by Agrobacterium tumef acien were also optimized. The highest
transformation frequency indicated by transient expression of gus gene was detected under the conditions of pre2culture for 3
days and subsequently infection for about 10 minutes in Agrobacterium suspension with OD600 value about 015 followed by co2
culture for 3 days.
Key words :sorghum shoot apex ; in vitro culture ; genetic transformation ; Agrobacterium tumef acien
收稿日期 :200204205
基金项目 :国家自然科学基金 (30270273) ,浙江省自然科学基金 ( Y304463)
作者简介 :张明洲 (1970-) ,男 ,浙江泰顺县人 ,副教授 ,主要从事植物生物技术研究 ,Email : zmzcjlu @cjlu. edu. cn。崔海瑞为通讯作者。
　　高粱的生物学产量和经济产量较高 ,是粮食、饲料
和酿酒业原料的重要来源 ,也是目前世界上第六大栽
培作物[1 ] 。利用转基因技术进行高粱品种改良已引起
了广泛关注。要将转基因技术用于品种改良 ,必须建
立受体植物良好的再生体系和转化体系。然而 ,与同
为禾谷类作物的玉米、水稻等相比 ,高粱转基因研究进
展相对缓慢 ,被认为是组织培养和遗传转化较难的植
物种类之一[2 ] 。
茎尖离体培养已被广泛地用于农作物和园艺植物
的脱毒和快速繁殖。Bhaskaran 等、Nahdi 等的研究结
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果表明 ,通过茎尖可以较快地获得高粱再生植株 ,可作
为农杆菌介导转基因的受体[3 ,4 ] 。在玉米、小麦、矮牵
牛、豌豆和水稻等植物中 ,利用农杆菌介导法或基因枪
法转化茎尖均获得了转基因植株 ,但在高粱中尚无这
方面的详细报道[5～10 ] 。本研究对高粱茎尖再生体系的
建立及农杆菌介导转化的影响因子进行了探讨。
1 　材料与方法
111 　材料
本研究所用的 14 个高粱品种为 KS034、鲁 1B、祁
粱 7 号、6066、抗四、314B、12B、622B、21B、7050B、8001、
115、0230 和熊杂 2 号。除抗四、熊杂 2 号是杂交种外 ,
其他均为纯系品种。所用农杆菌菌株为 EHA105 ,内含
p KUB 质粒 ,其 T2DNA 区携带 CaMV35S 引导的 npt Ⅱ、
hph、gus 基因及 Ubquitin 引导的杀虫结晶体蛋白基因
cry1Ab[11 ] 。
112 　方法
所用的培养基见表 1。其中 ,SA1～7 用于培养基
成分试验 ;SA2P 用于茎尖预培养 ;SA2I、SA2C 用于农杆
菌对茎尖的感染与共培养 ;SA2S 用于转化体的筛选。
取上述材料的健康种子用 011 %氯化汞进行表面
消毒 10～15min ,无菌水冲洗多次 , 25 ℃下萌发培养
3d。在解剖镜下分离约 110mm 的茎尖并接种到在不
同培养基上 ,于 (25 ±2) ℃和 18hΠ6h (光照Π黑暗) 条件
下进行培养 ,每 1 周继代培养 1 次。
农杆菌感染与 GUS 组织化学染色方法 :先用 YEP
液体培养活化农杆菌 ,然后在 SA2I 中振荡培养过夜 ,
离心收集菌体 ,并用 SA2I 配成不同浓度 (OD600为 011、
013、015、017)的悬浮液 ;将在 SA2P 培养基上预培养不
同天数 (0、1、3、5 和 7d)的茎尖在悬浮菌液中浸泡 5、10
或 15min ,取出茎尖于无菌滤纸上吸去多余的菌液 ,再
转移到 SA2C培养基上分别共培养 1、3、5 和 7d ;共培养
后的茎尖用无菌蒸馏水清洗 2～3 次 ,转移到 SA2S 培
养基上进行筛选培养 ,并参照 Reub 和 Hensgens 的方法
进行 GUS 组织化学染色 ,以染蓝茎尖数占测定茎尖数
的百分率来表示 gus 基因瞬时表达的频率[12 ] 。
表 1 　培养基及其成分
Table 1 　The composition of medium
培养基 medium 成分 composition
SA1 MS 无机盐 MS salts , 100mgΠL ; 肌醇 inositol , 40mgΠL ; 盐酸硫胺素 thiamine HCl , 011～015mgΠL ; 激动素 kinetin , KT , 30gΠL ; 蔗
糖 sucrose , 10gΠL ; 琼脂 agar , pH518
SA2 MS无机盐 MS salts , 100mgΠL ; 肌醇 inositol , 40mgΠL ; 盐酸硫胺素 thiamine HCl , 0125mgΠL’KT , 5mlΠL ; B5 培养基维生素
vitamins as listed in B5 , 30gΠL ; 蔗糖 sucrose , 10gΠL ; 琼脂 agar , pH518
SA3 SA2 ; 62苄氨基嘌呤 benzylaminopyrine , BAP , 0～110mgΠL ;吲哚乙酸 indoleacetic acid , IAA , 0～015mgΠL
SA4 SA3 ; BAP , 015mgΠL ; IAA , 0125mgΠL ; L2天门冬氨酸 L2asparagine , L2Asn , 200mgΠL
SA5 SA4 ;抗坏血酸 ascorbic acid , 10mgΠL
SA6 SA5 ; 聚乙烯吡咯烷酮 polyvinylpyrrolidone , PVP , 100mgΠL
SA7 SA6 ;活性炭 charcoal , 400mgΠL
SA2P SA3 ;乙酰丁香酮 acetosyringone , AS , 100μmolΠL
SA2I SA3 ; AS , 100μmolΠL ;葡萄糖 glucose , 36gΠL ;蔗糖 sucrose , 6815 gΠL ; 不加琼脂 no agar ; pH512
SA2C SA6 ; AS , 100μmolΠL ;葡萄糖 glucose , 10gΠL
SA2S SA6 ; 羧苄青霉素 carbenicillin , 250mgΠL ; 潮霉素 hygromycin , 25mgΠL
2 　结果与分析
211 　激素组合和培养基成分的影响
表 2 是高粱 KS034 茎尖在添加不同激素及浓度的
MS培养基的再生结果。结果表明 ,在 KT、BAP 和 IAA
激素的 9 种组合中 ,以 0125mgΠL KT , 015mgΠL BAP ,
0125mgΠL IAA 组合最佳 ,再生率可达 3118 %。
培养基中添加 B5 培养基维生素和 200mgΠL L2Asn
有助于高粱茎尖再生率的提高 (表 3) 。添加抗坏血酸、
PVP 或活性炭后 ,可以减轻高粱茎尖褐化现象的发生 ,
显著提高高粱茎尖的再生率 ,以 PVP 最优 (表 3) 。经测
试高粱茎尖在 0125mgΠL KT , 015mgΠL BAP , 0125mgΠL
IAA ,B5 培养基维生素 , 200mgΠL L2Asn , 10mgΠL 抗坏血
酸 , 100mgΠL PVP 的MS 培养基即 SA6 培养基上再生率
最高。
212 　不同基因型的表现
在以上培养基实验的基础上 ,选择再生频率最高
的 SA6 培养基 ,分析了不同基因型茎尖对离体培养的
反应 (表 4) 。在所采用的 14 种基因型高粱材料中 ,以
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抗四茎尖再生率最高 ,可达 6112 % ,而祁粱 7 号和 8001
的再生率较低 ,仅约 23 %。此结果表明 ,不同基因型
高粱茎尖在同一培养基上培养的再生表现差异很大 ,
在建立再生系统和遗传转化时都应注意选择基因型。
表 2 　不同激素组合对高粱 KSO34 茎尖再生的影响
Table 2 　The effect of different plant hormone on sorghum KSO34 shoot apexes regeneration
培养基
medium
KT
(mgΠL) BAP(mgΠL) IAA(mgΠL) 外植体数No. of explant 变褐数No. of browning 未形成茎叶数No. of died 再生数No. of regeneration 再生率Freq. of regeneration ( %)
SA2 011 010 010 176 115 31 30 1711
0125 010 010 228 130 42 56 2415
015 010 010 201 118 38 45 2214
SA3 0125 015 010 152 81 30 41 2710
0125 015 0125 153 78 27 48 3118
0125 015 015 156 79 46 31 1919
0125 110 010 146 87 28 31 2112
0125 110 0125 147 86 32 29 1917
0125 110 015 158 81 43 34 2115
表 3 　培养基成分对高粱茎尖培养再生的影响
Table 3 　The growth of sorghum shoot apexes in different medium
培养基
medium
外植体数
No. of explant
变褐数
No. of browning
未形成茎叶数
No. of died
再生数
No. of regeneration
再生率
Freq. of regeneration ( %)
SA1 192 154 26 12 613
SA2 228 130 42 56 2415
SA3 153 78 27 48 3118
SA4 248 118 36 94 3810
SA5 272 82 56 134 4912
SA6 256 68 58 130 5018
SA7 226 56 54 116 5011
注 :本表数据为所有参试材料的平均结果。
Note :Data in table is the average results based on data from all tested material .
表 4 　不同基因型对茎尖离体培养的反应
Table 4 　The regeneration of different genotype sorghum shoot apexes
基因型
genotype
外植体数
No. of explant
变褐数
No. of browning
未形成茎叶数
No. of died
再生数
No. of regeneration
再生率
Freq. of regeneration ( %)
KS034 256 68 58 130 5018
鲁 1B Lu 1B 220 111 46 63 2816
祁粱 7 号 Qiliang No. 7 200 97 56 47 2315
6066 192 102 42 48 2510
抗四 Kangsi 196 46 30 120 6112
314B 223 66 50 107 4810
12B 236 77 51 108 4518
622B 231 73 41 117 5017
21B 221 87 56 78 3513
7050B 206 73 65 68 3310
8001 209 106 55 48 2310
115 197 68 38 91 4612
0230 203 63 41 99 4818
熊杂 2 号 Xiongza No. 2 198 81 55 62 3113
213 　几种因子对农杆菌介导茎尖转化频率的影响
为了建立农杆菌介导的高粱转化体系 ,本试验以
高粱 KS034 等 3 种基因型的茎尖为外植体 ,以 gus 基
因瞬时表达的频率为指标 ,研究了外植体预培养时间、
菌液浓度、感染时间、共培养天数等因素对转化频率的
影响 (表 5) 。预培养处理能有效提高高粱茎尖分生组
织细胞中的 gus 基因瞬时表达频率 ,预培养 3d 是最佳
处理 ;未预培养和预培养 1d 的茎尖 ,共培养后褐化现
象比较严重 ,说明茎尖伤口未愈合易受农杆菌的侵害 ;
而预培养时间超过 5d , gus 基因瞬时表达频率明显下
降 ,可能由于此时茎尖伤口细胞已不能提供足够的诱
导农杆菌贴壁的受体 ,或由于茎尖分生组织细胞的分
52　1 期 高粱茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究
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裂速度减缓 ,进入细胞核的 T2DNA 量减少。菌液浓度
对高粱茎尖分生组织细胞中的 gus 基因瞬时表达频率
影响显著 ;随着菌液浓度的提高 , gus 基因瞬时表达频
率逐渐升高 ,最佳菌液浓度 OD600值为 015。菌液浓度
过低或过高都不利于高粱茎尖的转化 ,菌液浓度过低 ,
接菌量不足引起共培养时农杆菌生长量少 ;而菌液浓
度过高 ,共培养时茎尖受过量生长的农杆菌的伤害 ,因
此都造成 gus 基因瞬时表达频率较低。感染时间对
gus 基因瞬时表达频率无明显影响。共培养时间对高
粱茎尖分生组织细胞中的 gus 基因瞬时表达频率影响
也较显著。共培养 3 d , gus 基因瞬时表达频率达到最
高 ,之后随着共培养时间的延长 , gus 基因瞬时表达频
率逐渐下降。这可能由于高粱茎尖分生组织细胞受到
过度增殖的农杆菌的伤害而逐渐褐化死亡 ,从而引起
gus 基因瞬时表达频率的下降。基因型对 gus 基因瞬
时表达频率的影响不明显。
因此在农杆菌介导的高粱茎尖遗传转化中 ,适宜
的条件为茎尖预培养处理 3d ,农杆菌菌液浓度以OD600
为 015 ,感染时间约 10min ,共培养时间为 3d。
表 5 　不同处理因素对 gus 基因瞬时表达频率的影响
Table 5 　Effects of different factors on transient expression frequency of gus gene ( %)
基因型
genetype
处理因素 factors tested
预培养时间
preculture time (d)
菌液浓度
bacterial density(OD600)
感染时间
infection
time (min)
共培养天数
coculture days(d)
0 1 3 5 7 011 013 015 017 5 10 15 1 3 5 7
KS034 1411 1319 4115 3118 1917 1418 2816 5912 3812 5617 5918 6312 3019 5413 3213 2518
抗四 Kang 4 1519 1914 3915 3218 1711 1215 2714 5710 4313 5910 5710 5511 3414 5715 3917 2710
622B 1215 1111 4012 2912 1419 1415 2811 5816 3914 5418 6118 5711 4215 5118 4017 2311
平均值±标准差
mean ±SE
1412
±
117 1418±412 4014±110 3113±119 1714±214 1319±113 2810±016 5813±111 4013±217 5618±211 5915±214 5815±412 3519±519 5415±219 3716±416 2513±210
注 :表中数据为 gus 基因瞬时表达频率 ( %) 。
Note : The data in the table is the transient expression frequency of gus gene in different varieties( %) 。
3 　讨论
再生体系的建立是获得转基因植株的前提。本试
验通过对培养基成分、激素配比、基因型等影响因素的
研究 ,建立了高粱茎尖再生植株的培养体系。结果表
明 ,基因型、培养基成分、激素配比对高粱茎尖的离体
培养反应都具有很大的影响。在所用的 14 个高粱材
料中 ,由茎尖培养直接获得再生植株能力的表现明显
不同 ,高低相差近 3 倍 ;在 Nahdi 等的报道中[3 ] ,11 个
高粱品种的茎尖再生频率变化于 0～91 %之间 ,不同
基因型间相差更大 ,说明基因型对高粱茎尖的再生有
非常重要的影响。激素配比也是影响茎尖再生的重要
因子 ,在本试验中以 0125mgΠL KT、015mgΠL BAP 和
0125mgΠL IAA 的组合效果较好。本研究的结果还表
明 ,在培养基中添加抗氧化剂 ,如抗坏血酸 (10mgΠL) 、
PVP(100mgΠL) ,可以减轻培养中茎尖的褐化 ,有利于提
高茎尖的再生率 ,这与 Zhao 等的报道结果是一致
的[1 ] 。此外 ,在采用 B5 培养基维生素和添加 200mgΠL
L2Asn 也可以促进茎尖的再生。
在植物遗传转化中 ,以原生质体、悬浮细胞或愈伤
组织为受体时 ,获得转基因植株都需经过再分化过程 ,
不但周期长 ,而且在长期继代中易产生无性系变异 ;以
茎尖为转化受体则不需经过再分化过程 ,可缩短获得
转基因植株的周期 ,减少无性系变异。此外 ,取材也不
受时间限制。Bhaskaran 等[3 ] 、Nahdi 等[4 ] 、Seetharama
等[13 ]以及我们的研究结果都表明 ,通过茎尖培养可以
较好地建立高粱的再生体系 ,说明茎尖可以用于进一
步的转化研究。但在高粱中尚未见农杆菌介导转化茎
尖的报道[5～9 ] 。本研究通过对外植体预培养、菌液浓
度、感染时间和共培养时间等因素的试验 ,以 gus 基因
瞬间表达频率为指标 ,对农杆菌介导高粱茎尖转化的
条件进行了优化。试验结果表明 ,在以农杆菌介导的
高粱茎尖遗传转化中 ,获得较高转化频率的条件为 :将
110mm的茎尖在 SA2P 培养基上预培养 3d ,转入 OD600
值为 015 的农杆菌菌液中感染约 10min ,共培养 3d 后
进行筛选。
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照小得多。唐掌雄等[3 ,4 ] 用质子和软 X 射线辐照冬小
麦种子观察到的 M1 代幼苗叶绿素条状缺失现象在本
试验中也观察到 ,这种现象与后代的遗传突变之间存
在何种关系尚需继续探讨。
李文建等[14 ]提出了离子束 Bragg 峰在麦粒中定位
的自由基探针技术 ,为小麦定点定位诱变提供了技术
支持。杨俊诚等[15 ]对7Li 离子注入小麦耔粒径迹的研
究表明 ,7Li 离子束在生物体中的注入深度与注入离子
能量有关。依据前人的研究结果和本试验中不同辐照
能量的12 C和16O离子束对玉米、小麦造成的辐射损伤程
度存在很大差异的结果 ,我们初步推断 ,离子注入深度
与生物体受到的辐射损伤程度及诱变效果存在一定的
相关性。
玉米属大粒种子作物 ,由于受辐照面积的限制 ,本
项研究中所用样本容量较小 ,只得到了初步的试验结
果 ,今后如果条件允许 ,应加大样本容量并在 16～
45MeVΠu 之间增加几个辐照能量的深入研究。尽管如
此 ,本研究结果仍然可以说明 MeV 级12 C离子束和 16O
离子束是农作物种子辐照诱变的有效技术方法 ,采用
适宜的辐射能量和离子通量是提高农作物辐射诱变效
率的重要手段。
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