全 文 ：收稿日期 :2005212219
基金项目 :国家高科技发展计划 (863 计划) 2002AA241121
作者简介 :张华荣 (19802) ,男 ,浙江绍兴人 ,浙江大学硕士研究生 ,主要研究方向为病毒分子生物学。陈集双为通讯作者 ,Email :cjslab @zju. edu. cn
文章编号 :100028551 (2006) 052433205
侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星 RNA 的
32 P 分子标记杂交检测及分子鉴定
张华荣1 , 2 　陈集双2 　郭江峰2 　杜志游1 , 2 　廖乾生1 , 2 　陈燕飞2
朱为明3 　陈绍宁2 　张　　4
(11 浙江大学生命科学学院 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江理工大学生物工程研究所 ,浙江 杭州　310018 ;
31 上海农科院园艺所 ,上海　201106 ; 41 湖南农业大学生物安全科技学院 ,湖南 长沙　410128)
摘 　要 :2004 和 2005 年夏季 ,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害 ,并造成严重的产量
损失。分别以32 P 标记的 CMV 基因组 RNA3 部分序列和卫星 RNA 的 cDNA 探针对自然感病的番茄叶组
织和提纯的病毒粒子中提取的总 RNA 进行杂交检测 ,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有 CMV 及
卫星 RNA。dsRNA 分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒 (CMV) 基因及其卫星 RNA 条带。
以常规引物对感病植物的总 RNA 进行 RT2PCR 扩增 ,获得 CMV RNA3 全长克隆 ,经测序显示该 RNA3 序
列属于 CMV 亚组 Ⅱ; 通过在卫星 dsRNA 两端分别加上 15nt 的单链 DNA 接头 ,以接头互补序列为引物
进行扩增获得一个 383nt 的卫星 RNA 的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的 CMV 卫星 RNA
同源性为 7216 %～9915 % ,但其 3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定 ,CMV
及其卫星 RNA 变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在 ,可能对病害流行和新的症状出现产生
影响。
关键词 :番茄 ;病毒病 ;黄瓜花叶病毒 ;卫星 RNA ;上海
ISOTOPIC DIAGNOSIS AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF CUCUMBER
MOSAIC VIRUS AND SATELLITE RNA INFECTING TOMATO IN SHANGHAI
ZHANG Hua2rong1 ,2 　CHEN Ji2shuang2 　GUO Jiang2feng2 　DU Zhi2you1 ,2 　LIAO Qian2sheng1 ,2
CHEN Yan2fei2 　ZHU Wei2ming3 　CHEN Shao2ning2 　ZHANG Hen4
(11 College of Life Science , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
21 Institute of Bioengineering , Zhejiang Sci2Tech University , Hangzhou , Zhejiang 　310018 ; 31Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106 ;
41 College of Bio2Safety Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 　410128)
Abstract :In summer of 2004 and 2005 , typical viral disease symptoms were found on field tomato from Shanghai , which
remarkably reduced the yield of tomato. Total RNA of tomato leaves and purified virions were detected by hybridization with 32
P probes conducted with partial sequence of CMV RNA3 and full cDNA of CMV satRNA. Viruses were also confirmed by
analyzing dsRNA extracted from tomato leaves. Full sequence of CMV RNA3 was gained by RT2PCR and the result of
sequencing indicated that genomic RNA3 belongs to subgroup Ⅱ. Two 15nt complementary ssDNA primers were ligated into
double stranded satRNA. Complete sequence of satRNA was obtained by RT2PCR using these 15nt ssDNA as amplification
primers. Phylogenetic analysis showed that the identity of this 383nt satellite and some documented satRNAs was 7216 to
9915 % at the nucleotide level . Several mutation sites were found at the 3′terminus of the newly discovered satRNA. By
Isotopic diagnosis and molecular Identification , variation of CMV and its satRNA were found in tomato from Shanghai , which
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may influence the viral disease prevalence and the emergence of new symptom.
Key words :tomato ;virus disease ;cucumber mosaic virus ;satellite RNA ;Shanghai
　　黄瓜花叶病毒 (cucumber mosaic virus , CMV) 是世
界上发生最普遍、危害最严重的植物病毒之一 ;在我
国 ,该病毒是侵染茄科作物的主要病毒之一 ,其新变异
株系的出现和流行往往造成新的病害发生和流行。
CMV 为正义的三分体 RNA 病毒 ,属于雀麦花叶病毒科
( Bromoviridae) 黄瓜花叶属 ( Cucumovirus) ,其基因组包
含 RNA1、RNA2 和 RNA3 ,该病毒寄主范围非常广 ,可以
侵染多达 1000 多种单子叶和双子叶植物[1 ] ,一些 CMV
株系可以携带卫星 RNA。CMV 的卫星 RNA 为线性单链
RNA ,是伴随 CMV 复制的一种亚病毒因子 ,全长在 330
～405bp 间[2 ] ,不同的卫星 RNA 会对 CMV 的侵染产生
各种影响 ,如对 CMV 病毒复制量的强化和减弱 ,从而影
响 CMV 与寄主的互作 ,大部分卫星 RNA 因为与辅助病
毒竞争复制酶 ,表现为致弱卫星 ;但是 ,某些卫星则表现
为致死卫星 ,对寄主产生巨大的危害[1 ,3 ] 。
在我国 ,CMV 是侵染番茄作物的主要病毒之一 ,
冯兰香等从我国番茄主产区分离了近 60 个株系 ,包括
亚组 Ⅰ和亚组 Ⅱ,并获得了坏死株系[4 ] 。但是 ,以上工
作主要根据血清学差别来反映侵染番茄的 CMV 存在
与差异 ,尚未对自然侵染番茄的 CMV 进行序列比较和
卫星 RNA 的检测 ,尤其是后者的存在可能明显影响病
毒病症状的改变[1 ,3 ] 。同时 ,由于气候条件和栽培环境
的改变 ,尤其是大棚栽培措施的推广 ,作物病毒产生适
应性变异的可能性增加 ,长期以来 ,国内缺少对番茄病
毒病株系变化和适应性变异的系统研究 ,从而造成育
种和其他病毒控制措施的依据不足。2004 和 2005 年
夏 ,我们在上海大田里发现了典型的番茄病毒病 ,通过
dsRNA 分析初步确定有 CMV 及其卫星 RNA ,本文利用
杂交和分子克隆等方法对番茄中的 CMV 及其卫星进
行了检测并测定了相应序列 ,在进行序列比对的基础
上确定了 CMV 基因组 RNA3 的类型与卫星 RNA 变异
特征。
1 　材料与方法
111 　试验材料
自然感病的番茄材料于 2005 年 6 月底采自上海 ,
番茄品种为申粉 2 号。病叶 - 70 ℃冰箱保存备用 ,同
时通过汁液摩擦接种于烟草和番茄等寄主上。CMV2
382 ,CMV2Yi 及 Sat2382 分离自茄科辣椒 ,其中 CMV2382
的 RNA3 全长为 2220bp ,Sat2382 大小为 382bp ,为本实
验室保存。
RNA 抽提试剂盒购自上海生物工程公司 ,RT2PCR
(AMV) 试剂盒、PUC118 质粒及各种内切酶均购自
Takara 公司 ,连接酶购自 NEB 公司 ,T2easy vector 试剂
盒购自 Promega 公司 ,引物由上海生物工程技术服务
有限公司合成。
112 　方法
11211 　寄主植物 　采用常规汁液摩擦接种实验室的
健康番茄和烟草等寄主 (表 1) ,其中番茄品种为合作
903(含有 Tm22 杂合基因) ,烟草为 Nicotiana tabacum ,
供试植物在 20 ℃～28 ℃温室培养。
表 1 　CMV 的检测样品
Table 1 　CMV detection samples
样品号 sample code 样品名称 sample names
S1 接种 CMV 阳性对照 Yi 的心叶烟 Nicotiana glutinosa inoculated with positive control CMV - Yi
S2 健康番茄叶组织 leaf tissue of healthy tomato
S3 健康昆诺藜的叶组织 leaf tissue of healthy Chenopodium quinoa
S4 健康心叶烟的叶组织 leaf tissue of healthy Nicotiana glutinosa
S5 健康普通烟的叶组织 leaf tissue of healthy Nicotiana tabacum
S6 空白对照 blank
S7 上海番茄田间样品叶组织 field leaf tissue sample of Shanghai tomato
S8 上海番茄田间样品提纯的病毒粒子 RNA purified virions RNA from field sample of Shanghai tomato
11212 　dsRNA 提纯与分析 　取新鲜的田间感病番茄
叶组织 ,按常规方法提纯病毒 dsRNA[5 ] ,以实验室已有
的携带卫星的毒源 CMV2382 为阳性对照。用 1 %常规
琼脂糖凝胶电泳检测 dsRNA 的情况。
11213 　CMV 基因组 RNA3 全长引物设计和 RT2PCR 扩
增　按照 NCBI 数据库里已有 CMV 的 RNA3 序列设计
全长引物。
CMV 的 RNA3 全长上游引物 3F2BamH1 : 5′2
434 核　农　学　报 20 卷
AATCGGATCCGTAATCTTACCACTGTGTGTGTG23′; 反 向
引 物 3R2PstI : 5′2AATTCTGCAGTGGTCTCCTTTTGGA2
GGCC23′。
取田间新鲜番茄感病叶组织 011g ,抽提总 RNA 为
RT2PCR 模板 ;用 3R2PstI 为反向引物合成 CMV2R3 的
cDNA 第一条链 ,以该 cDNA 为模板进行 PCR 扩增反应。
反应体系为 (50μl) :10 ×PCR buffer 5μl ,引物 3F2BamH1
和 3R2PstI(10pmolΠul)各 1μl ,dNTP(215mmol) 4μl ,cDNA 第
一链合成产物 2μl 及 Taq 聚合酶 (5UΠμl) 1μl ,ddH2O 36μl。
反应条件 :94 ℃3min ;94 ℃20s ,58 ℃30s ,72 ℃3min ,10 个
循环 ; 94 ℃ 20s , 62 ℃ 30s , 72 ℃ 3min , 25 个循环 ; 72 ℃
20min。用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测 RT2PCR 产物 ,PCR
产物经过 BamHI 和 PstI 双酶切后 ,克隆到经过 pUC118
载体上并测序 ,测序重复两次。
11214　卫星 RNA 引物设计和 RT2PCR 扩增 　按照
NCBI数据库里已有 CMV 的卫星 RNA 序列设计全长引
物。上游引物 Fsat : 5′2GTTTTGTTTGTTGGAG23′; 下游
引物 Rsat : 5′2GGGTCCTGTAGAGGAATGTG23′。取新鲜
番茄感病叶组织 011g ,抽提总 RNA ,为 RT2PCR 模板 ,
用 Rsat 为反向引物合成卫星 RNA 的 cDNA 第一条链 ,
以该 cDNA 为模板进行 PCR 扩增反应。反应体系为
(50μl) :10 ×PCR buffer ,引物 Fsat 和 Rsat (10pmolΠμl) 各
1μl ,dNTP(215mmol) 4μl ,cDNA 第一链合成产物 2μl 及
Taq 聚合酶 (5UΠμl ) 1μl。反应条件 : 94 ℃ 3min ; 94 ℃
30s ,56 ℃30s ,72 ℃30s ,30 个循环 ,72 ℃10min。用 1 %
琼脂糖凝胶电泳检测 RT2PCR 产物。
11215 　dsRNA 末端连接方法扩增卫星 RNA 　通过在
回收的卫星 dsRNA 两端分别加上 15nt DNA 接头进行
扩增以获取卫星 RNA 的 PCR 产物。PrimerA :3′2NH22
GCTCCTTCCTGTGGGCTTCT2PO425′, PrimerB :5′2CGAGG2
AAGGACACCCGAAGA23′。( 1 ) 加接头反应 ( 10μl 体
系) :卫星 dsRNA 4μl ,primerA 1μl ,10 ×buffer (带 ATP)
1μl ,BSA 1μl (终浓度为 011 %) , PEG(分子量为 8000 ,
50 %)1μl , T4RNA 连接酶 1μl , T4DNA 连接酶 1μl。在
37 ℃条件下反应 4h。(2) 两端补平 :在连接产物中加
入 10 ×PCR buffer 115μl , Taq 酶 015μl 和 dNTP 3μl ,68 ℃
反应 20min。经过 PCR 产物清洁获得加接头的连接产
物。(3) RT 反应 (20μl 体系) :连接产物 2μl ,primerB
3μl ,DMSO 3μl , dNTP 4μl , 5 ×RT buffer 4μl ,AMV 1μl ,
Inhibitor 1μl ,DTT 2μl ,42 ℃反应 1h ,99 ℃灭酶活 ,置冰
上。(4) PCR 反应 (50μl 体系) :cDNA 4μl ,primerB 4μl ,
dNTP 4μl , 10 ×buffer 5μl , Taq 酶 015μl , 加 ddH2O
3215μl。反应条件 :94 ℃3min ;94 ℃10s ,56 ℃10s ,72 ℃
30s ,35 个循环 ,72 ℃10min。用 1 %琼脂糖凝胶电泳检
测 RT2PCR 产物 , PCR 产物经过割胶回收后连接到
p GEM2T easy vector 并克隆测序 ,对每个克隆的测序均
重复两次。
11216 　用32 P2探针检测病毒 RNA 和卫星 RNA 　以
CMV2RNA3 的阳性克隆和卫星 RNA 全长 cDNA 质粒为
模板 ,利用 Random Primer DNA Labeling Kit 标记 PCR 产
物作为杂交探针 ,32 P2dCTP 代替常规 dCTP。从田间样
品的叶组织和提纯的病毒粒子中制备总 RNA 并点样
到 NC膜上 ,按照常规同位素膜杂交方法进行检测[6 ] 。
11217 　序列同源性分析 　采用 DNAstar 软件 (www.
bio2soft . net)进行序列分析。
2 　结果与分析
211 　田间症状与病毒接种结果
田间自然感病的番茄主要表现为植株矮化和果实
的坏死症状 ,部分显示花叶 ;用汁液摩擦接种健康番茄
苗产生坏死、矮化和轻花叶症状 ,但是接种烟草产生枯
斑。
212 　dsRNA分析
从田间采取的感病番茄叶组织中提取 dsRNA ,其
dsRNA 大小分别约为 7000、3500、3000、2200 和 400bp
(图 1) ,说明上海番茄样品中有 CMV 侵染 ,并且可能
带有卫星 RNA。其中 7000bp 的显示可能有 ToMV 或
相关病毒侵染。
图 1 　dsRNA 抽提结果
Fig. 1 　Result of dsRNA extraction
A : Marker ;B : 阳性对照 CMV2382 和 Sat2382 的 dsRNA 抽提结果 ;
C :上海番茄 dsRNA 抽提结果
A : Marker ; B : CMV2382 and Sat2382 as positive control ;
C : dsRNA extraction from field samples of natural2infected tomato leaves
213 　同位素杂交检测
用32 P 标记的 CMV 基因组 RNA3 部分序列和 CMV
卫星 RNA 全长基因组序列作为标记探针 ,从自然侵染
的番茄样品中检测到 CMV 基因组 RNA 和卫星 RNA ,
通过抽提接种病毒粒子中的总 RNA 进行杂交 ,确定接
种番茄的叶组织中含有 CMV 和卫星 RNA(图 2、图 3) 。
534　5 期 侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星 RNA 的 p32分子标记杂交检测及分子鉴定
214 　CMV基因组 RNA3 全长克隆和序列分析
从自然感病的番茄叶组织中提取总 RNA ,通过
RT2PCR 扩增到预期的 2200bp 左右的条带 ,通过测序
确定其核苷酸序列为 2163bp ,经 BLAST比较和序列同
源性分析证实为 CMV2RNA3 片段 ,并命名为 CMV TSH2 RNA3 , GenBank 登录号为 DQ249298。经与来自 NCBI的部分序列进行同源性比较 (图 4) ,确定 CMV TSH2RNA3 属于亚组 Ⅱ,其序列与 CMV 标准株 FNY 的RNA3 同源性只有 7415 % ,与亚组 Ⅱ的其他株系同源性达到 9519 %以上 ,为高度同源。
图 2 　CMV 基因组 RNA3 膜杂交检测结果
(样品名称详见表 1)
Fig. 2 　Results of CMV RNA3 hybridization
detection (sample’s names are listed at Table 1)
图 3 　卫星 RNA 杂交检测结果 (样品名称详见表 1)
Fig. 3 　Result of satellite RNA hybridization
detection (sample’s names are listed at Table 1)
图 4 　CMV TSH2RNA3 核苷酸与来自 NCBI的部分 CMV RNA3 序列同源性的比较
Fig. 4 　Phylogenetic tree of CMV TSH2RNA3 nucleic acid sequence compared with published
CMV RNA3 (sequences from NCBI)
215 　CMV 卫星 RNA扩增和克隆
根据已有序列设计 CMV 卫星 RNA 全长序列扩增
引物 ,经过多次 RT2PCR ,没有扩增到预期卫星 RNA 条
带。根据卫星 RNA 末端可能存在变异的情况 ,在两端
分别加上 15nt DNA 接头进行 RT2PCR 扩增 ,成功获得
400bp 左右的预期片段 ,通过克隆测序 ,获得了 PCR 产
物的序列 (图 5) ,经过 BLAST比较和序列同源性分析 ,
确定该片段为 CMV 卫星 RNA ,并命名为 TSH2SAT ,序
列长度为 383bp , GenBank 登录号为 DQ249297 ,与已报
道的序列进行序列同源性比较后 ,发现 TSH2SAT 与杭
州 1 个卫星株 SAT2382 最为接近 , 其同源性达到
9516 % ,为高度同源。但是 TSH2SAT 的 3 (末端在第
364、365 和 375 位发生了 3 个碱基的突变 (图 6) 。
根据以上结果 ,我们从自然感病的番茄上获得了
图 5 　卫星扩增结果
Fig. 5 　Sat2RNA amplification result
A : Marker ;B : 空白对照 ;C :番茄样品中 dsRNA 双链
加两个 15nt 的 ssDNA 接头后 PCR 扩增结果
A : Marker ;B : CK; C: result for PCR of satellite
RNA with dsRNA ligatted with two15nt ssDNA primers
变异较大的 CMV 卫星 RNA ,同时 ,CMV 基因组 RNA3
的序列符合 CMV 亚组 Ⅱ,它们可能是番茄表现严重危
害的病原因子之一。
634 核　农　学　报 20 卷
图 6 　TSH2CMV 的卫星 RNA 与其它卫星 RNA 的比较后的 3′末端序列变异分析 (斜体字母为突变的碱基 ,‘ - ’为缺失的碱基)
Fig. 6 　Variation analysis of TSH-CMV satRNA 3 ( end compared with other CMV satRNA
(The italic letters means the mutation bases ,‘ - ’represents absent bases)
3 　讨论
尽管国内外研究报道侵染番茄的病毒种类达 20
多种 ,但是我国常见造成番茄严重损失的主要是 CMV
和 Tobomovirus(以前归为 TMV ,后来将侵染番茄的 TMV
类似物独立为 ToMV) [7 ] 。CMV 和 ToMV 复合侵染的情
况也比较普遍 ;我们也曾发现番茄乌心果病与一种
TMV类似病毒有关 ,但是该病毒不引起番茄植株坏
死。至今没有关于 ToMV 单独引起番茄严重坏死的报
道[8 ] 。早在上世纪 70 年代 ,就有报道显示法国番茄因
为感染 CMV 致死性株系而导致大面积坏死 ,进一步研
究显示其致死因子是 CMV 坏死卫星 RNA 变异株[9 ] 。
国内方中达等报道 ,从南京郊区分离到强毒株 CMV2
TN 株系能使番茄大面积坏死 ,并且该株系也携带有卫
星 RNA[10 ] 。我们在从上海田间坏死的番茄中也分离
到 TSH2CMV 和卫星 RNA ,它们可能是引起番茄大面积
坏死的原因之一 ,但是 ,本研究的 dsRNA 分析还检测
到类似 ToMV 的条带 ,说明 ToMV 的株系也可能是复合
侵染的病毒因子之一。因此 ,上海番茄大面积坏死病
害的出现也可能是 CMV 属和 ToMV 或 Tobamovirus 共
同侵染所致。本研究阐明了上海番茄大面积坏死的病
毒中 CMV 及其卫星 RNA 的存在 ,并进一步确定了其
分子变异和基因组 RNA 归类 ,为进一步研究新的条件
下番茄病毒病病原和控制的依据提供了分子生物学基
础。但是 ,究竟是 CMV 还是因为卫星 RNA 的作用或
有其他病毒 ,如 ToMV 新株系存在或复合侵染从而导
　　　
致番茄寄主坏死 ,还需要对 CMV 及卫星 RNA 进行全
长侵染性克隆的构建 ,并与 ToMV 共同接种番茄进行
验证。
致谢 :感谢浙江大学原子核农业科学研究所为研
究提供相应的试验仪器支持。
参考文献 :
[ 1 ] 　Peter P , Fernando G2A. Cucumoviruses. Adv Virus Res , 2003 , 62 ,
241～323
[ 2 ] 　Roossinck M J , Sleat D , Palukaitis P. Satellite RNAs of plant viruses :
structures and biological effects. Microbiol Rev , 1992 , 56 (2) : 265～
279
[ 3 ] 　Roossinck M J , Igor K, Peter P. Support of a cucumber mosaic virus
satellite RNA maps to a single amino acid proximal to the helicase
domain of the helper virus. J Virol , 1997 , 71 (1) : 608～612
[ 4 ] 　冯兰香 , 杨翠荣. 中国番茄黄瓜花叶病毒血清组的鉴定. 园艺学
报 , 2000 , 27 (6) : 418～422
[ 5 ] 　陈集双 , 冯明光 , 张耀洲. 黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星 RNA
的克隆及其与 12 个卫星 RNA 核甘酸序列的比较. 浙江大学学
报 (农业与生命科学版) , 2001 , 27 (3) : 249～254
[ 6 ] 　陈洁云 , 陈集双 , 柴立红 , 等. 两种葫芦科病毒的分子检测和致
病性研究. 植物病理学报 , 2003 , 33 (5) : 449～455
[ 7 ] 　孙炜敏 , 张华峰 , 康　慧 , 仪　宏. 基因工程在番茄抗病毒病育
种中的应用. 自然杂志 , 2003 , 25 (3) : 136～139
[ 8 ] 　盛方镜 , 陈集双 , 等. 番茄乌心果病的进一步研究. 浙江农业大
学学报 , 1993 , 19 (3) : 331～334
[ 9 ] 　Putz C , Kuszala J , Kuszala M , et al . Variation du pouvoir pathogine des
isolates du virus de la mosaiquec du concombre associe a la necrose , de
la tomate. Ann. Phytopathol . 1976 , 6 : 139～154
[10 ] 　程宁辉 , 濮祖芹 , 方中达. 引起番茄坏死病的黄瓜花叶病毒 TN
分离物的研究. 中国病毒学 , 1994 , 9 (2) : 144～150
734Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2006 ,20 (5) :433～437