全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032291205
短小芽孢杆菌 E601 传代和中子辐照后的菌落形态变化
陈晓明1 ,2 　魏宝丽1 　张建国1
(11 西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川 绵阳　621010 ;
21 西南科技大学核废物与环境安全国防重点实验室 ,四川 绵阳　621010)
摘 　要 :为研究短小芽孢杆菌 E601 不同形态菌落分布情况及中子辐照对其影响 ,对短小芽孢杆菌不同形
态菌落进行了反复传代 ,并采用 CFBR2Ⅱ快中子脉冲反应堆分别对不透明菌落进行了低、中、高剂量的
一次中子辐照和二次中子辐照 ,发现 : (1) 在正常传代条件下 ,E601 短小芽孢杆菌有半透明型和不透明
型菌落存在 ; (2)经反复传代 ,半透明菌落可产生各占一半的半透明型与不透明型两种菌落形态 ,而不透
明菌落基本不产生半透明菌落 ; (3)中子辐照对菌落分布影响较大 ,随着一次中子辐照剂量的升高 ,半透
明菌落所占的比例逐渐增加 ;当中子二次辐照剂量最高时 ,半透明菌落所占比例最大。因此认为 E601
短小芽孢杆菌之所以能产生两种不同形态菌落 ,主要是由半透明菌落的不稳定性决定的。在中子辐照
中 ,半透明菌落型菌株耐辐照能力高于不透明型菌落菌株。
关键词 :短小芽孢杆菌 E601 ( Bacillus pumilus) ;辐照灭菌 ;菌落形态
COLONY FORM VARIATION OF Bacillus Pumilus E601 AFTER CULTURED
AND NEUTRON IRRADIATION
CHEN Xiao2ming1 ,2 　WEI Bao2li1 　ZHANGJian2guo1
(11Life Science and Engineering College , Southwest University of Science and Technology , Mianyang , Sichuan 　621010 ;
21Defense Key Laboratory of Nuclear Wastes and Environmental Safety , Southwest University of Science and Technology , Mianyang , Sichuan 　621010)
Abstract :The distribution of two colony forms of Bacillus pumilus E601 and the effect of neutron irradiation on the colony form
were reported. The translucent and opaque colonies were cultured several generations to observe the proportion of two form
colonies. The spores of opaque colony were irradiated at 80 , 800 and 2000 Gy of fast neutron from CFBR2Ⅱpulse pile , and
the survivors of opaque colony were irradiated again at the same doses. The results showed that : (1) Bacillus pumilus E601
observed two types of colony form : translucent and opaque colony ; (2) the translucent colony could produce both translucent
and opaque colonies in equal , while the opaque colony couldn’t produce translucent colony generally ; (3) neutron irradiation
could affect the colony form distribution. The ratio of survival translucent colony was increased with the increase of the first
neutron irradiation doses , and the second neutron irradiation also increased the ratio of translucent colony. It was concluded
that the instability of translucent colony was the main reason to produce two colony forms of Bacillus pumilus E6011 The strain
of translucent colony had a stronger ability to resist neutron irradiation than the opaque colony.
Key words : Bacillus pumilus E601 ; irradiation sterilization ; colony form
收稿日期 :2007208215 　接受日期 :2007210210
基金项目 :西南科技大学核废物与环境安全国防重点学科实验室基金项目 (07J GZB07) ;中物院预研基金项目 (052056) ;西南科技大学博士基金
作者简介 :陈晓明 (1970 2) ,女 ,四川遂宁人 ,博士 ,副教授 ,主要从事辐射微生物效应及机理研究。Tel :0816 - 6089530 ,Fax :0816 - 6089521 ; E2mail :
cxmhyx99 @163. com
　　短小芽孢杆菌 ( Bacillus pumilus) 为芽孢杆菌属 ,菌
体细杆状 ,一般为 016～017μm ×210～310μm ,革兰氏 阳性[1 ] 。在辐照灭菌研究中短小芽孢杆菌被广泛应用 ,是抗电离辐照较强的细菌。许多国家都把短小芽
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孢杆菌作为电离辐照灭菌的指示菌。我国 1991 年初
步确定将短小芽孢杆菌 E601 (ATCC 27142) 作为检测
电离辐照灭菌效果的指示菌[3 ] 。
中子辐照穿透力很强又携带高能量[4 ] ,很容易造
成生物体细胞内的 DNA 断裂而引起细胞以及菌体的
死亡[5 ] 。我们采用短小芽孢杆菌 E601 作为中子辐照
灭菌效果指示菌的研究中发现 ,短小芽孢杆菌 E601 有
两种不同的菌落形态 ,经中子辐照后菌落形态有不同
的变化。采用不同菌落形态的 E601 进行研究可能对
评估中子辐照灭菌的影响有差异 ,本文研究短小芽孢
杆菌的菌落传代变化及中子辐照对短小芽孢杆菌的菌
落形态的影响 ,旨在为进一步研究中子辐照灭菌机理
提供依据。
1 　材料与方法
111 　材料
菌株为短小芽孢杆菌 E601 ( Bacillus pumilus) ATCC
27142 ,购于美国 ATCC 菌种库。基本培养基 (营养肉
汁琼脂) 组成 :蛋白胨 5g ,牛肉膏 3g ,氯化钠 5g ,琼脂
25g ,蒸馏水 1000ml ,pH712。
112 　方法
11211 　原始菌落形态变化研究 　从原始斜面菌种中
挑取少许菌体进行稀释涂平板 ,记为 1 代 ,将平板放入
37 ℃恒温培养箱培养 48h ,记录两种菌落形态的分布
情况。再从 1 代平板中分别挑取半透明与不透明菌落
进行稀释涂平板 ,记为 2 代半透明与不透明。分别用
前 1 代的半透明菌落与不透明菌落进行传代 ,每 2d 传
代 1 次 ,共传至 4 代。
11212 　中子一次辐照　随机挑取 3 个不透明菌落 ,记为
菌落 1、菌落 2 和菌落 3 ,分别进行平皿扩大 ,于 37 ℃恒
温培养箱中培养 7 - 8d 左右 ,进行芽孢染色 ,检测芽孢
率。待芽孢率达到 95 %以上时 ,刮下菌苔 ,于装有 PBS
缓冲液的三角瓶中充分打散 ,混匀于 45 ℃水浴断链 24h ,
每隔 4h 摇晃 1 次 ,使芽孢分散成为单个个体。将芽孢
悬液充分混匀 ,每个样品分装于 2ml 冻存管中 ,存放于
4 ℃冰箱备用。每个样品 3 个重复。
备用样品在中国工程物理研究院核物理与化学研
究所的 CFBR2Ⅱ快中子脉冲反应堆上 ,按辐照剂量低、
中、高原则分别采用 80、800 和 2000Gy 进行快中子辐
照 ,辐照剂量率为 714GyΠmin ,照射时间分别为 11、108
和 270min。
11213 　中子二次辐照 　从一次中子辐照后存活平板
中随机挑取 3 个不透明菌落 ,记为菌落 1、菌落 2 和菌
落 3 ,分别进行平皿扩大 ,放在 37 ℃恒温培养箱中培
养。待培养 7 - 8d 左右进行芽孢染色检测芽孢率。以
后的操作同一次辐照。并同样按辐照剂量低、中、高原
则分别采用 80、800 和 2000Gy 剂量对样品进行二次中
子辐照。
11214 　辐照后样品处理　将辐照后的样品取 100μl 倍
比稀释到适当浓度 (通常做 2 个稀释度) ,取 100μl 涂
平板 (每个稀释度涂 3 个平板) ,然后将平板放入 37 ℃
恒温培养箱培养 48 h 后记数 ,以菌落数在 30～300 之
间为有效数据 ,统计两种形态菌落分布情况。
2 　结果
211 　原始菌落传代过程中的形态变化
21111 　原始菌落的形态　由图 1 可看出 ,原始菌株中
存在两种菌落形态 ,不透明菌落呈乳白色、光滑、菌落
较小 ,占大部分。半透明菌落只约占 16 % ,菌落呈米
黄色 ,光滑 ,湿润。随着时间的增加 ,不透明菌落边缘
开始皱缩 ,呈锯齿状。这种情况与美国 ATCC 库指明
的菌落形态一致。
图 1 　原始菌株菌落形态
Fig. 1 　The colony forms of original Bacillus pumilus
21112 　半透明菌落传代情况 　用半透明菌落进行传
代分离 ,得到的两种菌落形态基本各占一半 (见图 2) 。
从图 2 可看出 ,半透明菌落传代后 ,所产生的半透明菌
落米黄色 ,湿润 ,边缘不规则 ,呈锯齿状 ;不透明菌落比
半透明菌落小 ,光滑 ,颜色比原始不透明菌落的颜色偏
黄 ,随着时间的增加 ,菌落中间略皱缩突起。
21113 　不透明菌落传代情况 　由不透明菌落进行传
代分离得到的半透明菌落非常少 ,而且随着传代次数
的增加而减少 ,到了第 4 代就基本没有半透明菌落产
生 (见图 3) 。从图 3 可看出 ,不透明菌落传代后 ,传代
分离的前 2 代只产生 1 %左右的半透明菌落 ,且菌落
没有由半透明菌落传代得出的半透明菌落大 ,边缘呈
锯齿状 ,呈米黄色 ,湿润。不透明菌落小 ,呈乳白色 ,但
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图 2 　半透明菌落传 1 代 (a)和 2 代 (b)的菌落观察
Fig. 2 　The first (a) and second (b) generation cultured from translucent colony
图 3 　不透明菌落传 1 代 (a)和 2 代 (b)的菌落观察
Fig. 3 　The first (a) and second (b) generation cultured from opaque colony
比原始不透明菌落偏黄 ,光滑 ,突起。
综上所述 ,可将原始菌株传代过程中菌落形态变
化情况归纳为图 4。由图 4 可大致推出 ,短小芽孢杆
菌之所以能产生两种不同形态菌落 ,主要是由于半透
明菌落的不稳定性决定的 ,而不透明菌落基本保持稳
定。
212 　中子辐照对菌落形态的影响
21211 　中子一次辐照对菌落形态的影响　经过中子
一次辐照后的不透明菌落初始光滑、湿润 ,随着时间的
增加 ,有些菌落变得亮白 ,呈不透明状 ,菌落中间开始
皱缩 ,边缘出现褶皱 ;有些则呈半透明状 ,颜色比不透
明菌落黄 ,光滑。随着时间的增加 ,菌落边缘呈锯齿
状。中子一次辐照对菌落的影响见表 1 ,以半透明菌落
为统计指标。
由表 1 可以看出 ,随着一次中子辐照剂量的升高 ,
半透明菌落所占比例也逐渐增加 ,远远超过原始菌株
传代时的 1154 %(见图 4) 。 表 1 　中子一次辐照不透明菌落后对两种菌落比例的影响Table 1 　The effect of first neutron irradiationon colony proportion from treated opaque colony中子剂量neutron irradiation dose ( Gy) 半透明菌落比例translucent colony proportion ( %)0 115480 1151800 91372000 1410821212 　中子二次辐照对菌落形态的影响　经过中子二次辐照后不透明菌落容易皱缩 ,变得干燥 ;半透明菌落光滑 ,随着时间的增加 ,边缘也开始皱缩 ,呈锯齿状。中子二次辐照对菌落的影响见表 2 , 以半透明菌落为统计指标。由表 2 看出 ,当中子一次和二次辐照剂量均为最大值 2000 Gy 时 ,半透明菌落所占比例最大 ,且随中子一次辐照剂量的增加 ,二次中子辐照的各剂量中 ,半透
明菌落所占比例也逐渐增加 ,且都远远高于原始菌株
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图 4 　原始菌株传代 4 过程中的菌落变化
Fig. 4 　The colony variation cultured from the originality Bacillus pumilus for 4 generations
图中半透明菌落表示用半透明菌落进行传代分离 ,不透明菌落则表示用不透明菌落进行传代分离。
图中括号中的数值均以传代后半透明菌落占总菌落比例来表示。
The word“translucent colony”means passage is processed with this colony , and so does opaque colony.
In this figure , the value in the parentheses is represented by translucent colony proportion.
传代时的 1154 %。
表 2 　经二次中子辐照的不透明菌落的菌落形态分布
Table 2 　The colony form distribution of opaque colony
after two times neutron irradiation ( %)
一次中子辐照剂量
first neutron irradiation
dose ( Gy)
二次中子辐照剂量
second neutron irradiation dose ( Gy)
80 800 2000
80 3. 36 2. 73 5. 11
800 17. 11 3. 11 17. 91
2000 10. 46 10. 25 19. 25
注 :表中数据皆以半透明菌落所占比例计。
Note :The data in the table mean theproportion of translucent colony.
从表 1 、表 2 的数据可看出 ,中子辐照对短小芽孢
杆菌两种菌落的损伤程度不同。不透明菌落的耐辐照
能力逊于半透明菌落 ,且这种差异在中子二次辐照时
表现更明显。
3 　讨论
本试验结果表明 ,在未辐照情况下 ,短小芽孢杆菌
的半透明菌落能产生半透明的光滑型菌落和不透明的
光滑型菌落 ,且所占比例基本相近 (图 2) 。而不透明
菌落在前 3 次传代过程中只产生少许的半透明菌落 ,
第 2 代中半透明菌落比例只有 1154 % ,第 3 代中却只
产生了 0173 %的半透明菌落 ,到了第 4 代不产生半透
明型菌落。在培养过程中发现 ,两种菌落初始的颜色
形态相同 ,都表现为光滑 ,湿润 ,呈米黄色 ,随着时间的
增加 ,菌落逐渐变大 ,不透明菌落从米黄色变为乳白
色 ,而半透明菌落颜色不变 ,菌落边缘开始皱缩 ,随着
时间的再增加 ,菌落中央也开始皱缩。在伴放线放线
杆 菌 ( Actinobacillus actinomycete mcomitans , Aa ) 和
Escherichia coli K212 的固体培养中也存在类似的报
道[7 ,8 ] 。但关于辐照对不同菌落分布的影响至今还未
见报道。从本研究中得知 ,辐照对短小芽孢杆菌两种
菌落形态的菌株损伤程度不同 ,半透明菌落菌株耐辐
照能力稍强 ,因此 ,在讨论电离辐照灭菌的可行性时 ,
有必要注明采用的短小芽孢杆菌的不同菌落菌株的分
布情况 ,以便更可靠、准确地进行灭菌效果的评估。
Haase 等[9 ]最近描述了 Aa 液体培养的形态学变
化。本研究主要考察了固体培养条件下菌落形态的变
化 ,有关液体培养条件下的情况还有待考察。由于中
子辐照的样品来源均为不透明菌落 ,研究中子辐照对
半透明菌落的影响可能将对研究辐照损伤机理提供更
大依据。同时电离辐射也是引起微生物变异的重要因
素[10 ] ,考察中子辐照对菌落形态的变化有利于进一步
阐述电离辐射对微生物的影响。
短小芽孢杆菌是抗电离辐射较强的细菌 ,常作为
检测电离辐射灭菌效果的指示菌。已有报告显示多种
因素可影响电离辐射灭菌效果 ,如初始菌含量、剂量
率、温度、介质等[11 ] 。从本研究可看出 ,短小芽孢杆菌
的不同菌落形式的菌株数量也可能会对灭菌效果造成
影响。为了使辐照灭菌指示菌在灭菌过程中的应用标
准化、规范化 ,保证灭菌质量 ,在确定辐照灭菌剂量时
应考虑到这一点[12 ,13 ] 。
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由于短小芽孢杆菌存在半透明型和不透明型两种
不同的菌落形态 ,对两种菌落分别进行传代 ,半透明菌
落能产生半透明和不透明型菌落 ,且基本各占一半。
而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌
落 ,且传至第 4 代时半透明型菌落消失。因此认为短
小芽孢杆菌之所以能产生两种不同形态菌落 ,主要是
由于半透明菌落的不稳定性决定的 ,而不透明菌落基
本保持稳定。中子辐照对短小芽孢杆菌的菌落形态分
布有较大的影响 ,半透明菌落型菌株耐辐照能力高于
不透明菌落型菌株。
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