全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 052340207
农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立
吴关庭1 ,2 　胡张华2 　郎春秀2 　陈笑芸2 　王伏林2
金　卫2 　陈锦清2 　夏英武1
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘 　要 :为建立农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens)介导高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. )遗传转
化体系 ,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料 ,通过 gus 基因瞬时表达检测 ,
研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明 ,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化
的适宜条件为 :愈伤组织在含BAP 和NAA 各 015mgΠL 的培养基上预培养 3d ;菌液浓度 OD600值
017 ,感染时间 15min ;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加 100μmolΠL 的乙酰丁
香酮 ;共培养温度 23 ℃,共培养时间 3d ,共培养基 pH值 512。不同浓度潮霉素筛选效果试验表
明 ,采用低浓度 (50mgΠL)潮霉素连续筛选 ,再生获得的转基因植株数最多 ,因此是最为可取的
筛选方式。
关键词 :高羊茅 ;农杆菌 ;遗传转化 ;影响因素 ;筛选效果
ESTABLISHMENT OF Agrobacterium2MEDIATED TRANSFORMATION SYSTEM FOR TALL FESCUE
WU Guan2ting1 ,2 　HU Zhang2hua2 　LANG Chun2xiu2 　CHEN Xiao2yun2
WANG Fu2lin2 　J IN Wei2 　CHEN Jin2qing2 　XIA Ying2wu1
(1. Institute of Nuclear2Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ;
2. Institute of Virology and Biotechnology , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang 　310021)
Abstract :In order to establish Agrobacterium2mediated transformation system for tall fescue ( Festuca arundinacea
Schreb. ) , the effects of multiple factors on transient expression of gus gene were investigated by using embryogenic
calli derived from mature seeds of turf2type cultivar‘Barlexas’as recipient materials. The results showed that the
appropriate conditions for the Agrobacterium2mediated transformation of the embryogenic calli were as follows : callus
pre2culture for 3d on medium containing BAP and NAA 015mgΠL ; bacterial suspension OD600 017 , infection time
15min ; addition of 100μmolΠL acetosyringone to Agrobacterium pre2culture and suspension media and co2culture
medium; co2culture temperature 23 ℃, co2culture time 3d , co2culture medium pH 512. It demonstrated that
continual selection with 50mgΠL hygromycin produced the most transgenic plants.
Key words : tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) ; Agrobacterium tumef aciens ; genetic transformation ;
influencing factor ; selectable effect
收稿日期 :2005202204
基金项目 :浙江绿洲生态股份有限公司风险投资项目和浙江省“151 人才基金”项目
作者简介 :吴关庭 (1963 - ) ,男 ,浙江萧山人 ,博士 ,研究员 ,从事植物基因工程研究。陈锦清为通讯作者 ,Email : yznszdz @zaas. org
高羊茅是世界温带地区一种很重要的多年生冷季型草种 ,近几年来作为一种草坪草已在我国许多
省区广泛栽培[1 ] 。长期以来 ,高羊茅新品种培育基本上都是采用常规育种方法 ,转基因技术的发展为高
羊茅的遗传改良提供了一种很有潜力的手段[2 ] 。迄今为止 ,高羊茅遗传转化研究已有一些报道[3～11 ] 。
在这些研究中 ,所采用的转化技术主要是聚乙二醇 ( PEG) 法和基因枪法 ,而具有转化频率高、转基因拷
贝数低、导入片段确定性强、能够转化大片段 DNA、操作简便、费用低廉等优点的农杆菌介导法在高羊
043 核 农 学 报　2005 ,19 (5) :340～346
Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
茅遗传转化中的应用直到近年才有所进展[12 ] ,但其技术尚不成熟 ,有待进一步系统研究和完善。本研
究以草坪型高羊茅品种的胚性愈伤组织为受体材料 ,通过 gus 基因瞬时表达检测 ,探讨多种因素对农杆
菌介导转化的影响 ,并比较了不同浓度潮霉素对转化体的筛选效果 ,籍此建立农杆菌介导高羊茅胚性愈
伤组织遗传转化体系 ,为今后该草种转基因改良提供高效技术平台。
1 　材料和方法
111 　植物材料
以草坪型高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. ) 品种凌志的成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材
料。胚性愈伤组织的诱导参照胡张华等[13 ]的方法。
112 　菌株与质粒
所用农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens)菌株为 EHA105 ,内含 pCMD 质粒 ,由本实验室提供。pCMD 质
粒的 T2DNA 区携带有潮霉素磷酸转移酶基因 hpt、葡糖苷酸酶基因 gus 以及来自拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana)的转录激活因子基因 CB F1 (图 1) 。
图 1 　质粒 pCMD 的 T2DNA 区图谱
Fig. 1 　Schematic diagram of T2DNA region of plasmid pCMD
113 　农杆菌介导转化影响因素试验
挑取农杆菌单菌落接种在含有卡那霉素和潮霉素各 50mgΠL 的预培养基 ( YEP 液体培养基 + 乙酰
丁香酮 100μmolΠL ,pH 710)中 ,28 ℃振荡培养过夜。经离心收集的菌体用农杆菌悬浮培养基 (AA + 2 ,42
D 110mgΠL + 乙酰丁香酮 100μmolΠL ,pH 512)重悬成 OD600值为 015 的悬浮液。将经过预培养的高羊茅
胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中浸染 15 min ,之后弃去菌液并用无菌滤纸吸干 ,接种于共培养基 (MS
+ 2 ,42D 115mgΠL + 乙酰丁香酮 100μmolΠL ,pH 512)上 , 25 ℃暗培养 3d。经共培养的愈伤组织用无菌水
漂洗 5～6 次 ,洗去其表面的农杆菌 ,然后取较大的愈伤组织进行 GUS 组织化学染色 ,每处理 3 次重复 ,
每重复 30～40 块。按照以上程序和预设条件分别研究下列因素对 gus 基因瞬时表达的影响。
11311 　愈伤组织预培养基　包括 MSD(MS + 2 ,42D 210mgΠL) 、MS1 (MS + BAP 011mgΠL + NAA 011mgΠ
L) 、MS3 (MS + BAP 013mgΠL + NAA 013mgΠL)和 MS5 (MS + BAP 015mgΠL + NAA 015mgΠL)共 4 种。
11312 　愈伤组织预培养时间　设 0、1、3、5 和 7d 共 5 个时间。
11313 　菌液浓度　设 OD600值为 011、013、015、017 和 019 共 5 种浓度。
11314 　感染时间　设 5、10、15、20 和 25min 共 5 个时间。
11315 　乙酰丁香酮浓度　设 0、50、100、150 和 200μmolΠL 共 5 种浓度。
11316 　乙酰丁香酮添加方式　共设 5 种方式 ,A 为只在农杆菌预培养基中添加 ;B 为仅在农杆菌悬浮培
养基中添加 ;C为农杆菌预培养基和悬浮培养基中都添加 ;D 为只在共培养基中添加 ; E为 3 种培养基中
均添加。
11317 　共培养温度　设 21、23、25、27 和 29 ℃共 5 种温度。
11318 　共培养时间　设 1、2、3、4 和 5d 共 5 种时间。
11319 　共培养基 pH值 　设 418、512、516、518 和 612 共 5 种 pH值。
114 　不同浓度潮霉素筛选效果试验
采用上述影响因素试验的程序及所确定的适宜条件转化高羊茅胚性愈伤组织。共培养愈伤组织经
无菌水漂洗 5～6 次后 ,用无菌滤纸吸干 ,转移到潮霉素浓度分别为 50、100、150、200 和 250mgΠL 的筛选
培养基 (MS + 2 ,42D 210mgΠL + 羧苄青霉素 250mgΠL) 上 ,在 25 ℃黑暗处选择培养。4 周后记录长出的
143　5 期 农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立
抗性愈伤组织数并将其转移到新的含相同浓度潮霉素的筛选培养基上继代筛选。此后每隔 3 周转继一
次 ,连续转继 3 次 ,每次转继时 ,记录存活的抗性愈伤组织数 ,并从每一抗性愈伤组织取一部分进行 GUS
组织化学染色。
将第四轮筛选后的抗性愈伤组织分成 GUS+ 和 GUS - 两类 ,转移到含BAP 210mgΠL、KT 015mgΠL、NAA
015mgΠL、潮霉素 50mgΠL 的MS 培养基上进行高渗预分化和分化[13 ] 。再生小植株长到 3～4cm 高时 ,转入
含 NAA 014mgΠL、IBA 014mgΠL、潮霉素 50mgΠL 的 1Π2 MS 培养基中生根。长根小苗经炼苗后移栽于土中 ,
待植株成活并生长一段时间后 ,取样进行 PCR 检测和 Southern 杂交分析。
115 　愈伤组织 GUS 组织化学染色
经共培养的愈伤组织和筛选获得的抗性愈伤组织用无菌水充分漂洗后 ,参照 Rueb 和 Hensgens[14 ] 的
方法 ,并稍作修改进行 GUS 组织化学染色 :将愈伤组织置于 115ml 离心管中 ,加入 X2Gluc 检测液至所有
愈伤组织都被浸没 ,置 37 ℃下保温过夜 (约 15h) ,吸干检测液后目测统计染色愈伤组织块数 (凡染成蓝
色的记为 GUS+ ,未染色的记为 GUS - ) ,并计算其频率 :
gus 基因瞬时或稳定表达频率 ( %) = ( GUS+ 愈伤组织数Π检测愈伤组织数) ×100 %
116 　转基因植株 PCR检测
参照卢扬江和郑康乐[15 ]的方法 ,小量提取转化植株和非转化对照植株的基因组 DNA。根据潮霉素
磷酸转移酶基因 hpt 序列设计一对特异引物 :
上游引物 :5’TAC ACA GCC ATC GGT CCA GA 　3’;
下游引物 :5’TAG GAG GGC GTG GAT ATG TC 　3’。
利用这对引物对提取的 DNA 进行 PCR 扩增 ,鉴定转化植株中是否存在外源基因。
117 　转基因植株 Southern 杂交分析
随机选择一部分独立来源的经 PCR 验证的 T0 转化植株和非转化对照植株大量提取基因组
DNA[15 ] 。取 15μg 左右 DNA 用 Hind Ⅲ酶切后 ,在 018 %琼脂糖凝胶上电泳分离 ,然后转移到 Hybond2N+
尼龙膜上。以潮霉素磷酸转移酶基因 hpt 片段作为探针 ,探针标记、分子杂交和信号检测采用 Amersham
Pharmacia Biotech 公司生产的 ECL 试剂盒 ,方法依照操作手册。
2 　结果与分析
211 　农杆菌介导转化影响因素
21111 　愈伤组织预培养
图 2 　愈伤组织预培养对 gus 基因瞬时表达的影响
Fig. 2 　Effects of callus pre2culture on
transient expression of gus gene
MSD : MS + 210mgΠL 2 ,42D ; MS1 : MS + 011mgΠL
BAP + 011mgΠL NAA ; MS3 : MS + 013mgΠL BAP + 013mgΠL
NAA ; MS5 : MS + 015mgΠL BAP + 015mgΠL NAA高羊茅胚性愈伤组织经农杆菌感染并经 3d 左右共培养后 ,转化细胞中的 gus 基因得到瞬时表达。转化前将高羊茅胚性愈伤组织接种于 MSD、MS1、MS3 和 MS5 培养基上预培养 ,研究其对 gus 基因瞬时表达的影响 ,结果如图 3a 所示。该图显示 ,MS3和MS5 的 gus 基因瞬时表达频率较MSD 有一定提高 ,表明预培养基中以较高浓度的BAP 和 NAA 来代替 2 ,42D ,有利于提高农杆菌介导高羊茅转化效率 ,在本试验中 ,以添加 015mgΠL 的 BAP 和 NAA 效果最好。
受体材料预培养除了培养基以外 ,培
养时间也是一个重要的影响因素。将高羊茅胚性愈伤组织接种于 MS5 培养基上预培养不同天数 ,然后
在相同条件下转化 ,结果表明 ,与不经预培养相比 ,预培养 1～7d 的 gus 基因瞬时表达频率都有提高 ,其
中以预培养 3d 的最高 ,超过 3d 后 gus 基因瞬时表达频率逐渐下降 (图 2b) 。因此 ,高羊茅胚性愈伤组织
转化前的预培养时间以 3d 较为合适。
243 核　农　学　报 19 卷
21112 　农杆菌感染条件
高羊茅胚性愈伤组织预培养后 ,用 OD600值为 011～019 的农杆菌悬浮液侵染处理同样的时间 ,然后
在相同条件下共培养 , GUS 染色结果显示 ,OD600值在 017 以下时 , gus 基因瞬时表达频率随菌液浓度的
增加明显提高 ,并在 017 时达到最高 ,超过 017 后 , gus 基因瞬时表达频率开始下降 (图 3a) 。该结果说
明 ,在本试验中 OD600值 017 是农杆菌介导转化最为合适的菌液浓度。
农杆菌感染的另一个重要条件是感染时间。从图 3b 可以看到 ,高羊茅胚性愈伤组织用相同浓度的
菌液感染处理 5～25min , gus 基因瞬时表达频率以 15min 的最高。感染时间只有 5min 时 , gus 基因瞬时
表达频率明显要低一些 ,而将感染时间延长到 20min 以后 ,可能因为对受体细胞产生了较重的伤害 ,导
致 gus 基因瞬时表达频率逐渐降低。根据以上结果 ,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化时 ,感染时间
以 15min 左右较为适宜。
图 4 　添加乙酰丁香酮对 gus 基因瞬时表达的影响
Fig. 4 　Effects of acetosyringone addition on transient
expression of gus gene
A :只添加于农杆菌预培养基 ;B :仅添加于农杆菌悬浮培养基 ;C :农杆菌预培养
基和悬浮培养基中都添加 ;D :只添加于共培养基 ; E :3 种培养基中均添加
A : addition to Agrobacterium2precultured medium ; B : addition to Agrobacterium2
suspended medium ; C: addition to Agrobacterium2precultured and 2suspended media ; D :
addition to co2culture medium ; E: addition to all the three media图 3 　农杆菌感染条件对 gus 基因瞬时表达的影响Fig. 3 　Effects of infection conditions with Agrobacteriumon transient expression of gus gene
21113 　乙酰丁香酮添加
乙酰丁香酮为农杆菌转化单子叶植
物所必需 ,高羊茅作为一种单子叶植物也
不例外。由图 4a 可知 ,培养基中不加乙
酰丁香酮时 ,高羊茅胚性愈伤组织很难被
转化 ,一旦加入了乙酰丁香酮 , gus 基因
瞬时表达频率就显著提高 ,表明乙酰丁香
酮在农杆菌介导高羊茅遗传转化中起着
至关重要的作用。而在添加的 4 种乙酰
丁香酮浓度中 , gus 基因瞬时表达频率以
100μmolΠL 的最高 ,说明在添加乙酰丁香
酮时 ,浓度也不宜过高 ,否则反而达不到
最佳效果。
在培养基中添加乙酰丁香酮 ,除了浓
度以外 ,还与其添加方式有关。本试验研
究比较了单独或同时在农杆菌预培养基、
农杆菌悬浮培养基和共培养基中添加
100μmolΠL 乙酰丁香酮的 5 种方式对高羊
茅转化效率的影响 ,结果见图 4b。该图
表明 ,只在农杆菌预培养基 (方式 A) 或悬
浮培养基 (方式 B) 中添加乙酰丁香酮 ,对
转化的促进作用有限。当这两种培养基
中均添加乙酰丁香酮时 (方式 C) ,效果要
好一点 ,但还是远不及方式 D 即仅在共
培养基中添加。这说明 ,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化时 ,共培养是一个相对关键的时期 ,此时
添加乙酰丁香酮对提高农杆菌侵染受体细胞能力具有非常重要的作用。同时还可看到 ,在上述 3 种培
养基中都添加乙酰丁香酮 (方式 E) ,使 gus 基因瞬时表达频率达到最高 ,显然 ,这是最为可取的乙酰丁
香酮添加方式。
21114 　共培养条件
由于共培养在农杆菌介导转化中起着十分重要的作用 ,所以与之有关的共培养条件都会对转化效
率产生程度不一的影响 ,共培养温度即是其中之一。经农杆菌浸染处理的高羊茅胚性愈伤组织在 21～
29 ℃的温度下共培养 , gus 基因瞬时表达频率以 23 ℃的最高 ,超过这一温度后 , gus 基因瞬时表达频率逐
渐下降 (图 5a) 。该结果表明 ,高羊茅胚性愈伤组织经农杆菌感染后 ,共培养宜在 23 ℃的温度下进行。
影响农杆菌介导转化的另一个共培养条件是共培养时间。高羊茅胚性愈伤组织经农杆菌感染后在
343　5 期 农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立
相同温度下共培养 1～5d ,GUS 染色结果如图 5b 所示。图中显示 ,共培养 1d 时 ,因农杆菌生长量和侵染
时间不足 , gus 基因瞬时表达频率较低。当共培养 3d 时 , gus 基因瞬时表达频率达到最高值 ,而共培养
时间延长到 4d 和 5d , gus 基因瞬时表达频率虽仍保持较高水平 ,但已呈下降趋势。因此 ,农杆菌介导高
羊茅胚性愈伤组织转化时 ,共培养时间以 3d 最佳。
图 5 　共培养条件对 gus 基因瞬时表达的影响
Fig. 5 　Effects of co2culture conditions on transient expression of gus gene
共培养基 pH值也是一个对转化效率有明显影响的共培养条件。经农杆菌感染的高羊茅胚性愈伤
组织在 pH值为 418～612 的共培养基上共培养 , gus 基因瞬时表达频率以 pH 512 的最高 ,pH 值达到和
超过 516 以后 , gus 基因瞬时表达频率明显降低 ,而 pH 值为 418 时 ,可能因为对农杆菌的侵染或愈伤组
织的生长更为不利 ,导致 gus 基因瞬时表达频率更低 (图 5c) 。该结果说明 ,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤
组织转化时 ,共培养基 pH值以 512 最为合适。
212 　不同浓度潮霉素筛选效果
基于上述农杆菌介导转化影响因素试验结果 ,采用合适的转化条件对供试品种凌志的胚性愈伤组
织进行转化 ,转化后的愈伤组织转移至含有 50、100、150、200 和 250mgΠL 潮霉素的培养基上进行 4 轮选
择培养 ,研究比较不同浓度潮霉素对高羊茅转化体的筛选效果。结果表明 ,潮霉素浓度为 50 和 100mgΠL
时 ,第一轮筛选得到的抗性愈伤组织数较多 ,其频率分别为 1413 %和 618 % ,但在随后的 3 轮筛选中 ,抗
性愈伤组织数逐轮减少 ,而且 GUS 染色显示 ,存活的抗性愈伤组织中只有部分呈阳性 ,这说明 ,在较低
的选择压下 ,会有非转化细胞的逃逸 ,它们当中的一部分在随后的几轮筛选中逐渐消亡。当潮霉素浓度
提高到 150mgΠL 及以上后 ,非转化细胞的逃逸基本消失 ,此时第一轮筛选获得的抗性愈伤组织数明显减
少 ,在后续筛选中也少有变化 ,且 GUS 染色全部呈阳性 (表 1) 。
表 1 　不同浓度潮霉素对高羊茅转化体的筛选效果
Table 1 　Screening Effects for transformants with different concentrations of hygromycin in tall fescue
潮霉素浓度
hygromycin
(Hyg)
concentration
(mgΠL) 转化愈伤组织数No. of callitransformed(A) 第 1 轮筛选后after screening for one time 第 4 轮筛选后after screening for four times 抗性愈伤组织分化differentiation ofHyg2resistant calli抗性愈伤组织数No. of Hyg2
resistant
calli
(B)
抗性愈伤
组织频率
Hyg2resi2
stant callus
frequency
(BΠA , %) 抗性愈伤组织数No. ofHyg2resi2stant calli(C) GUS + 愈伤组织数No. ofGUS +calli (D) GUS + 愈伤组织频率GUS + callusfrequency(DΠC , %) GUS - 愈伤组织分化数No. ofregeneratedGUS - calli GUS + 愈伤组织分化数No. ofregeneratedGUS + calli( E) 再生转基因植株数No. oftransgenicplants (F) 转化频率transformationfrequency(FΠA , %)
50 412 59 14. 3 23 10 43. 5 0 4 17 4. 13
100 483 33 6. 8 18 14 77. 8 0 5 19 3. 93
150 467 17 3. 6 15 15 100 - 5 18 3. 85
200 561 16 2. 9 14 14 100 - 4 12 2. 14
250 654 15 2. 3 14 14 100 - 3 8 1. 22
443 核　农　学　报 19 卷
经 4 轮筛选后存活的抗性愈伤组织在含 50mgΠL 潮霉素的培养基上高渗预分化和分化 ,所有 GUS -
愈伤组织均不能再生 ,而部分 GUS+ 愈伤组织分化出转基因植株。这些转基因植株都被成功移栽于土
中 ,并进行了 PCR 扩增 (图 6)和 Southern 杂交 (图 7)验证。表 1 表明 ,按第四轮筛选后的 GUS+ 愈伤组织
数计算 ,转化频率以 150mgΠL 潮霉素筛选最高 ,但若按再生的转基因植株数计算 ,则是 50mgΠL 潮霉素筛
选最高。潮霉素浓度超过 150mgΠL 后 ,无论是按 GUS+ 愈伤组织数还是按转基因植株数计算 ,转化频率
都是逐渐降低。
图 6 　高羊茅转基因植株 hpt 基因 PCR 检测
Fig. 6 　PCR assay of hpt gene in different
transgenic tall fescue plants
M:DNA 分子量 ;P :质粒 pCMD(阳性对照) ;CK:非转化植株
(阴性对照) ;1～12 :转基因植株
M: DNA marker ; P : pCMD plasmid as positive control ; CK: non2
transformed plant as negative control ; 1～12 : transgenic plants
图 7 　高羊茅转基因植株 hpt 基因的 Southern 杂交分析
Fig. 7 　Southern analysis of hpt gene in transgenic
tall fescue plants
M:DNA 分子量 ;P :质粒 pCMD ;CK:非转化对照植株 ;
1～6 :转基因植株
M: DNA marker ; P : pCMD plasmid ; CK: non2transformed
control plant ; 1～6 : transgenic plants
　　根据以上结果 ,在高羊茅遗传转化中 ,转化体宜采用低浓度潮霉素连续筛选 ,潮霉素浓度不宜超过
150mgΠL。
3 　讨论
农杆菌介导单子叶植物遗传转化受诸多因素的影响[16 ,17 ] 。高羊茅作为一种单子叶植物 ,迄今尚无
对其农杆菌介导转化影响因素进行系统研究的报道。本研究以供试品种凌志的胚性愈伤组织为受体材
料 ,通过 gus 基因瞬时表达检测 ,探讨了涉及愈伤组织预培养、农杆菌感染、共培养以及乙酰丁香酮添加
等几方面的多种因素对农杆菌介导高羊茅转化的影响 ,确定了适宜转化条件。从获得的结果来看 ,乙酰
丁香酮添加对转化效率的影响最大 ,同在水稻、大麦、小麦等单子叶植物中一样 ,共培养基中添加乙酰丁
香酮对高羊茅的农杆菌介导转化至关重要。愈伤组织预培养能使转化效率得到较大提高 ,尤其是在培
养基中添加 015mgΠL 的 BAP 和 NAA 后 ,获得了比含 210mgΠL 2 ,42D 的普通继代培养基更高的转化效率 ,
这与 Khanna 和 Raina 在水稻上的研究结果相吻合[18 ] ,其原因可能是添加较高浓度的 BAP 和 NAA 后 ,更
有利于将受体愈伤组织调整到一种适合农杆菌介导转化的生理状态[19 ] 。此外 ,菌液浓度和共培养时间
等因素对转化效率也有很大影响 ,菌液浓度过低或共培养时间太短 ,因农杆菌细胞数或浸染量不足使转
化效率较低 ,但若菌液浓度过高或共培养时间太长 ,则由于对植物细胞造成严重伤害 ,也会导致转化效
率降低。
高羊茅对潮霉素具有很强的内源抗性 ,在现有高羊茅遗传转化研究中 ,不同研究者使用的潮霉素浓
度从 50 到 250mgΠL 相差很大[6 ,7 ,10 ] 。为确定最佳的潮霉素筛选浓度 ,本研究考察比较了不同浓度潮霉素
对高羊茅转化体的筛选效果。结果表明 ,在 50 和 100mgΠL 潮霉素的低选择压下筛选 ,会有非转化细胞
的逃逸但不能再生。从转化频率来看 ,按 4 轮筛选后的 GUS+ 愈伤组织数计算 ,以潮霉素 150mgΠL 的最
高 ,但若按再生转基因植株数计算 ,则是 50mgΠL 最高并随潮霉素浓度的提高而下降。据分析 ,这可能是
由于农杆菌感染高羊茅胚性愈伤组织后 ,转化细胞与非转化细胞共存 ,两类细胞在生长和分裂过程中相
互竞争 ,当选择压较低时 ,非转化细胞具有一定的竞争优势 ,使部分转化细胞慢慢消失 ,导致第一轮筛选
得到的 GUS+ 愈伤组织数较少 ,甚至少量已经获得的 GUS+ 愈伤组织也会因为这个原因而在随后的继代
543　5 期 农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立
筛选中丢失。但另一方面 ,连续多轮筛选在较低的选择压下进行 , GUS+ 愈伤组织得以保持相对较好的
活力状态 ,植株再生能力较强 ,表现为愈伤组织再生频率较高 ,再生的转基因植株数较多。当潮霉素浓
度提高到 150mgΠL 后 ,非转化细胞的竞争优势被削弱 ,直至其生长完全被抑制 ,因而能得到较多的 GUS+
愈伤组织 ,但这些愈伤组织的分化能力有所下降。进一步提高选择压 ,潮霉素浓度达到和超过 200mgΠ
L ,在完全抑制非转化细胞生长的同时 ,也引起表达水平较低的转化细胞停止生长 ,使获得的 GUS+ 愈伤
组织数减少。而且 ,经这种高选择压连续筛选 , GUS+ 愈伤组织的活力变得较弱 ,植株再生能力明显降
低。
农杆菌介导高羊茅遗传转化至今只有一例报道[12 ] 。在该研究中 ,研究者以胚性悬浮细胞为受体材
料 ,通过农杆菌介导转化仅获得 2 株转基因植株。本研究以胚性愈伤组织为受体材料 ,经农杆菌介导转
化和 50mgΠL 潮霉素筛选后 ,转化频率按再生转基因植株数计算达到了 4113 % ,转化效率大大提高。另
外 ,高羊茅胚性悬浮培养物基本上都是由胚性愈伤组织制备而来 ,由胚性愈伤组织建立胚性悬浮培养物
不仅存在技术上的难度 ,费时、费力 ,而且还会给植株再生尤其是绿苗再生带来困难。因此 ,在农杆菌介
导高羊茅遗传转化研究中 ,直接以胚性愈伤组织作为受体材料无疑更具实际应用价值。
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