全 文 ：文章编号: 100028551(2002) 0120008207
不同处理对水稻病程相关蛋白和
过氧化物酶的影响* *
曾富华1 王勇刚1, 2* 姚志雄1 罗泽民2
( 11 湛江师范学院生物系,广东 湛江 524000; 21 湖南农业大学生物技术系,湖南长沙 410128)
摘要:以稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae. XOO)弱毒株 7521和Ni(NO3) 2 作为
诱导因子处理水稻幼苗。表明不同处理均在第 2d 表现出最大诱导效果, Ni(NO3 ) 2
处理后的相对诱导效果达 5018% ;可溶性蛋白质 IEF 和 SDS2PAGE显示, 诱导蛋白一
般在诱导后 24h及 48h出现。Ni(NO3) 2 处理后 48h, SDS2PAGE发现上位叶有新增谱
带(MW分别为 54195 和 32136kD) ; IEF 显示上位叶出现 pI511 谱带, 诱导叶出现
pI5126谱带; POD 同工酶诱导叶新增加 4 条酶带 (Rf 分别为 0162、0163、0164 及
0173) ,上位叶新增加两条酶带(Rf为 0163和 0164)。不同诱导因子处理后,可溶性蛋
白质含量增加, 诱导后24~ 48h增幅最大;还显示不同诱导因子对同一植物诱导 PRP
的效力不同。
关键词:水稻;诱导抗性;病程相关蛋白;过氧化物酶
收稿日期: 2001209203
基金项目:广东省科技攻关项目( 2KM03103N)资助
作者简介:曾富华( 1952~ ) ,男,湖南湘潭人,博士,湛江师范学院教授,研究方向为植物免疫学
* 现在通讯地址:华东理工大学生物化工学院
病程相关蛋白( PRP)是植物在病理或病理相关的环境下如病原物的侵染或某些物理化学
因子刺激、胁迫产生的一类诱导蛋白。大多数 PRP具有几丁质酶和 B21, 32葡聚糖酶活性, 在体
内和体外均显示出抗真菌活性[ 1] ; PRP 直接攻击病菌, 其水平与病原菌数量呈正相关[2] ; PRP
抑制剂(Kinetin+ NAA)能使病情显著加剧[ 3] ;迄今为止描述的几乎所有系统获得性抗性( SAR)
都与 PRP 积累有关, 是植物产生 SAR的重要指标[ 4]。蔡新忠用水杨酸处理或用 Pyricularia
oryzae 接种水稻幼苗,通过 SDS2PAGE和活性 PAGE检测到 4种 PRP( 48、52、59和 10615kD) [5] ;
吴健胜[ 6]等选用水稻白叶枯菌不亲和互作系统,通过双向电泳分析发现一种新的特异性诱导
蛋白质(MW14kD, pI415)和两种特异性增强蛋白质(MW14kD, pI412, MW15kD, pI412) ;曾富华用
水稻白枯叶菌等诱导因子诱导水稻叶片及悬浮细胞,均发现新增蛋白质谱带,显示 PRP 与诱
导抗性密切相关。
过氧化物酶( POD)在个体发育和系统发育中表现出极大的多样性, 具有多种生理功能。
很多植物受真菌或细菌的感染后, POD活性增加。马国华等用稻瘟病菌( Pyricurarica oryzae )
ZC15分别接种水稻抗病和感染品种, 3d后抗病品种的 POD活性增加较快,而感染品种的 POD
8 核 农学 报 2002, 16( 1) :8~ 14Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
活性增加很少, 不同品种的 POD活性与病情指数呈负性相关( r= - 017138)。Manandhar等[ 7]
证明, Pyricularia oryzea 等因子能同时激发水稻植株 PRP 和 POD表达。Kanzan等[ 8]发现,病程
相关过氧化物酶( Pathogenesis2related peroxidase)的转基因烟草, 其转基因的 POD表达与抗病性
密切相关。我们在研究稻白叶枯菌(Xanthomonas . oryzae. pv. oryzae, XOO. ) 7521和Ni(NO3) 2 诱
导水稻对白叶枯病的抗性及活性氧代谢的基础上[ 9~ 11] , 进一步研究两者对水稻三叶期幼苗处
理叶及上位叶中可溶性蛋白质谱带和 POD同工酶酶谱的动态变化。
1 材料与方法
111 材料与方法
水稻 ( Oryza Sativa L. )高感白叶枯病品种威优 44, 由湖南省农业科学院水稻所提供。
XOO17521(弱毒菌株)及 76225(强毒菌株)由湖南农业大学植物病理教研室提供。所用大部分
试剂均为进口产品, 国产试剂均为分析纯。
112 材料培养及诱导处理
浮选壮实种子,用 4%甲醛溶液消毒 15min, 充分漂洗后于 28 e 浸种、催芽, 播种在直径
18cm的尼龙网筒上, 每盘 30 粒, 在人工气候室中用木村 B 营养液培养至 3 叶 1 心期。
XOO17521接种到固体胁本培养基上, 28 e 下恒温培养 4d至对数生长期, 用无菌蒸馏水制成菌
悬液,并稀释至 310@108个细菌PmL备用。
按下列方法进行诱导处理: ¹3叶 1心期稻苗用塑料袋套住第 2叶以上部位(不包括第 2
叶) , 喷洒 212mmolPL Ni(NO3 )溶液(含 0105% (VPV) Tween280) ; º3 叶 1 心期稻苗第 2 叶用
XOO17521剪叶接种, 并喷洒 0105% (VPV)Tween280水溶液。»对照仅喷洒 0105%(VPV)Tween2
80水溶液(喷雾量以植株全叶湿润,溶液不至流下为准)。处理后的稻苗一部分取样分析,另
一部分于诱导后第 2d、3d在第 3叶挑战接种, 2周后调查发病情况。
113 病情调查及诱导效果测定
挑战接种 2周后测量全叶长和病斑长(mm) , 用下列方法测诱导效果:相对病斑长(% )=
病斑长(mm)P全叶长(mm) @100% ;绝对诱导效果(mm)= 对照病斑长(mm) - 诱导处理病斑长
(mm) ;相对诱导效果(% )= (对照病斑长- 诱导处理病斑长)P对照病斑长@100%。
114 可溶性蛋白质提取、含量测定和丙酮粉的制备
叶片洗净后称重,按 1B5加入预冷的 pH718, 65mmolPL磷酸盐缓冲液(含1%不溶性PVP和
1mmolPL PMSF) ,冰浴研磨至匀浆,双层纱布过滤液,用 16000rpm(日立 CR22E46# 转子) 4 e 下离
心20min,上清液即为粗样品。粗样品稀释 100倍,分别测定 A215和A225 ,求 $A 值, 查标准曲线
求蛋白质含量。粗样品加入 2~ 4ml样品溶解液( pH715, 10mmolPL Tris2HCl, 011mmolPL EDTA,
0115 molPL NaCl, 5%正丁醇)研磨至匀浆在 4 e 用 12000rpm离心 20min, 上清液按 1B4(VPV)加
入预冷的丙酮( - 20 e 以下)沉淀蛋白质, 放置一段时间后在 4 e 用 10000rpm离心 10min,沉淀
用冷丙酮洗涤, 离心后倾去上清液,在 4 e 下干燥即得丙酮粉。
115 可溶性蛋白质电泳及 POD同工酶测定
SDS2PAGE参照张龙翔等[ 12]介绍的方法略加改进,采用垂直板不连续体系的聚丙烯酰胺
凝胶电泳,凝胶厚度 115mm,分离胶浓度为 3%, 浓缩胶浓度为 12%。IEF 参照夏其昌[ 13]介绍
的方法进行,凝胶厚度 1mm。POD同工酶测定采用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳, 交联度为 3% ,
9 1期 不同处理对水稻病程相关蛋白和过氧化物酶的影响
浓度为2% ~ 20%的梯度胶,用联苯胺染色法。
分子量测定:测量各蛋白质样品区带中心与加样端的距离, 计算相对迁移率 Rf,以标准蛋
白质的相对迁移率为横坐标, 其分子量的对数为纵坐标,作出标准曲线。根据未知蛋白质样品
相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。
pH梯度的测定:用浸泡凝胶的方法测定 pH 值。将凝胶分成数小段浸泡在重蒸水或
10mmolPLKCl中,测定浸出液的pH 值,根据pH 值和迁移距离做标准曲线。然后根据线形梯度
和迁移距离测算蛋白质的 pI。
2 结果与分析
211 诱导对挑战接种后发病情况的影响
XOO17521及 Ni(NO3) 2 诱导处理 3 叶 1心期幼苗, 第 2d、3d 挑战接种均诱导产生系统抗
性,在第 2d表现出最大诱导效果。Ni(NO3) 2处理的诱导效果明显好于 XOO. 7521, 其相对诱导
效果达5018%, 平均差显著性分析为极显著性差异(P < 0101)。Ni(NO3) 2 处理后的某些叶片
甚至不感病,病斑或伤斑仅为 2~ 4mm(表 1)。
表 1 不同因子处理对水稻幼苗发病的影响
Tabel 1 The effects on disease developmental status in rice seedlidng induced
by different factors after challenge inoculation
诱导因子
induct ion
factors
挑战接种时间
t ime challenged
( days)
病斑长
lesion length
( mm)
相对病斑长
relative lesion
length( % )
绝对诱导效果
absolute induced
effect( mm)
相对诱导效果
relat ive induced
effect( % )
CK 2 3011 ? 017 2015 2 2
XOO17521 2 2216 ? 018* 1513 715 2419
Ni( NO3) 2 2 1418 ? 112** 1217 1513 5018
CK 3 3210 ? 016 2115 2 2
XOO17521 3 2511 ? 111** 1819 619 2116
Ni( NO3) 2 3 2314 ? 019** 1714 816 2619
注:病斑长为平均数 ? 标准差; * 表示与对照有显著差异 ( P [ 0105, N > 40 ) ; ** 表示与对照有极显著差异 ( P [ 0101, N >
40) .
Note:Lesion length are shown as means? SE. * : figures marked in a column means significantly different from CK. ** : figures marked in
a column means much significant ly different from CK.
212 不同诱导因子处理后水稻幼苗叶片中可溶性蛋白质含量和电泳谱带的变化
21111 水稻幼苗中可溶性蛋白质含量的变化 XOO17521和 Ni(NO3 ) 2 处理后,上位叶及诱导
叶的可溶性蛋白质含量普遍增高, 48h 达到最高;可溶性蛋白质含量升高, Ni(NO3 ) 2 大于
XOO17521,上位叶大于诱导叶(表 2)。
21212 可溶性蛋白质SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带的的变化 Ni(NO3) 2 处理后 24h, 诱导叶
两条谱带增强(MW18149、14112kD) ;上位叶 1条谱带增强(MW24110kD) ;处理后 48h上位叶新
增两条谱带(MW 32136、54195kD) ; Ni(NO3 ) 2 和 7521均使诱导叶 1条谱带增强(MW14112kD) ,
上位叶增强稍弱。Ni(NO3) 2 处理后72h, 上位叶新增 1条谱带( 0188, MW16141kD) ;诱导叶有 2
10 核 农 学 报 16卷
条谱带消失(MW64157、68139kD) (图版Ñ)。
表 2 不同诱导处理对水稻幼苗中可溶性蛋白质含量的影响
Tabel 2 Effects on soluble protein content in the seedling leaves induced by different factors(mg#g- 1fw)
处理
treatments
叶位
site of leaves
取样时间 sampling time (h)
24 48 72
平均值
average
CK

处 理叶
t reated leaves
2015

21165

23150

21173

第 3叶
upper leaves
21165

26170

31175

26170

XOO17521

处 理叶
t reated leaves
21180

28160

27100

23180

第 3叶
upper leaves
23165

32125

33140

29180

Ni(NO3 ) 2

处 理叶
t reated leaves
26145

30140

27145

28110

第 3叶
upper leaves
28105

39160

34155

30170

图版Ñ 不同诱导因子处理后可溶性蛋白质 SDS2PAGE谱带的变化
Plate Ñ The changes of SDS2PAGE bands of soluble protein after treatment
A, B, C分别为处理后 24h, 48h 和 72h取样; 11 对照, 诱导叶; 21XOO17521诱导叶; 31Ni( NO3 ) 2,诱导叶; 41 对照, 上位叶;
51XOO17521,上位叶; 61Ni(NO3 ) 2,上位叶; 71 标准蛋白质
A, B and C were samples at 24h, 48h and 72h after t reatment . 11CK of treated leaves; 21 the leaves induced by XOO17522; 31 the leaves
t reated by Ni(NO3 ) 2; 41CK of upper leaves; 51upper leaves of ones t reated by XOO17523; 61upper leaves of ones treated by Ni
(NO3 ) 2; 71molecular weight marker
21213 可溶性蛋白质等电聚焦电泳( IEF)谱带的变化 Ni(NO3) 2处理后 24h,上位叶新增两条
谱带( pI4175, pI513) , 1条谱带增强( pI 5181) ,诱导叶和上位叶也有 1条谱带增强( pI 4169) ;处
理后 48h,诱导叶 1条新增谱带( pI 5126) , 1条谱带减弱( pI 4156,上位叶完全消失) , 上位叶新
增1条谱带( pI 511) ,诱导叶和上位叶均有 1条谱带增强( pI 517) ;处理后 72h,上位叶和诱导叶
11 1期 不同处理对水稻病程相关蛋白和过氧化物酶的影响
1条谱带减弱( pI 4164) ; XOO17521 和 Ni(NO3) 2 都使诱导叶和上位叶 2条谱带减弱 ( pI511,
pI515) (图版Ò)。
图版Ò 不同因子对水稻幼苗叶片中可溶性蛋白质 IEF谱带的变化
Plate Ò The changes of IEF bands of soluble protein in seedling leaves after treatment
A, B, C分别为处理后 24h, 48h和 72h 取样; 11 对照,诱导叶; 21XOO17521, 诱导叶; 31Ni( NO3 ) 2, 诱导叶; 41 对照, 上位叶;
51XOO17521,上位叶; 61Ni(NO3 ) 2,上位叶。
A, B, C were 24h, 48h and 72h after treatment . 11 induced leaves. Ni( NO3) 2 ; 21induced leaves, XOO17521; 31 induced leaves. Ni
(NO3 ) 2; 41upper leaves,CK; 51upper leaves, XOO17521; 61upper leaves of ones treated by Ni( NO3) 2
21214 不同因子对水稻幼苗叶片中POD同工酶谱带的变化 XOO17521菌株处理后 48h,诱导
叶新增加 1条酶带(Rf0165) , 上位叶未见明显的谱带增加; Ni(NO3) 2 处理后 48h,诱导叶新增加
4条谱带(Rf 分别为 0162、0163、0164和 0173) , 上位叶增加 2条谱带(Rf 分别为 0163和 0164)
(图版Ó)。
3 讨 论
植物抗病防卫反应的时序性是指防卫功能因子按特定的时间顺序参与作用的过程或特
性。水稻中的 PR基因的时序性表达尚未见报道。我们的结果表明, 诱导产生(或增强)的蛋
白谱带一般出现在诱导处理后 24h、48h, 在 72h 新的条带减少; Ni(NO3 ) 2 诱导后 48h,诱导叶
POD同工酶新增 4条酶带, 上位叶增加 2条谱带,而 24h、72h 没有检测到酶谱变化;可溶性蛋
白质含量在 48h增幅最大;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH2px)活性也在 48h有较大幅度升高。PRP
出现的时间类似于水分胁迫条件下小麦幼苗中胁迫蛋白的产生[ 14] ,也与不同因子处理后 48h,
水稻悬浮细胞中 POD等酶带普遍表达增多的结果相一致(易克, 1999)。Manandar等[ 7]在用 B .
Sorokiniana 接种后 12h,即可检测到 PRP转录产物的积累。检测了诱导后的系统抗性, 在诱导
后第 2d表现出最大诱导效果。表明结果, 寄主的诱导抗病性取决于寄主特异性和非特异性抗
12 核 农 学 报 16卷
性基因表达的相对速率,这些表达产物在时序上协同作用, 共同诱发系统抗性,限制了病原物
进一步增殖和侵染。
图版Ó 不同因子对水稻幼苗叶片中 POD同工酶谱带变化的示意图
Plate Ó The changes of POD isoenzymes bands of soluble protein in the seedling leaves after treat2
ment
A, B, C分别为处理后 24h, 48h和 72h取样; 11对照,诱导叶;对照,上位叶; 31XOO17521, 诱导叶; 41XOO17521,上位叶; 51Ni
(NO3 ) 2,诱导叶; 61Ni( NO3) 2,上位叶。
A, B, C were samples at 24h、48h and 72h after treatment. 11 cont rol of induced leaves; 21 control of upper leaves; 31XOO17521, induced
leaves; 41XOO17521, upper leaves; 51Ni(NO3 )2 , induced leaves; 61Ni( NO3) 2 , upper leaves.
POD是植物体内的重要防御酶。资料表明[15]黄瓜受霜霉病菌侵染后均表现出过氧化物
酶同工酶增加, 认为与黄瓜抗霜霉病害有关; Reimers等发现水稻与白叶枯菌非亲和互作中,胞
间液中有一种阴离子 POD( PO2CI)新谱带出现和另外两种阳离子 POD(PO2A1, PO2A2)活性增
加,认为与木质素合成有关。Carla等[ 16]、Manandhar等[ 7]均发现在诱导 PRP 产生的同时,也诱导
POD活性增加,并指出诱导产出的 PR29蛋白即为 POD。Kazan等[ 8]将 POD转基因植株中表达的
与疾病抗性相关的POD称为病程相关 POD。我们用硝酸镍处理后水稻叶片 POD同工酶电泳表
明,处理后 48h诱导叶和上位叶均出现新酶带,这些诱导产生的新出现的酶带均应属于 PRP。
我们的研究还表明[ 9~ 11] , 诱导处理后 3~ 12h局部的 AO 及其代谢酶系统已发生了改变,
诱导后 24h 靠近处理叶的上位叶也检测到AO及其代谢酶的变化[ 17] ,这显示诱导局部的信号
在24h内已传递到上位叶,但这些信号还不足以刺激产生系统抗性,当诱导后48h,上位叶中检
测到新增 POD同工酶谱带后才产生系统抗性, 这种与 PRP 相关的系统抗性即为系统获得性抗
性,其信号传递及其作用机制有待进一步研究。
参考文献:
[ 1 ] Wubben J P, JoostenMhaj, VanKan Jal, et al. Subcellar local iazat ion of plant chitinases and 1, 32B2glucanase Cladosporium fulvum
( Syn. Fulvia fulva)2 infected tomato leaves. Physiol Mol Plant Pathol . 1992, 41: 23
[ 2 ] Dassi B, E Dumas2gaudot and S Gianinazzi. Do pathogenesis2related proteins play a role in bioprotection onmycorrhizal tomato roots
toward p. parasit ica? Physiological amd Molecular Plant Pathology. 1998, 52(3) : 167~ 183
[ 3 ] Bera S, R P Purkayastha. Mult icomponent coordinated defence response of rice to Rhizoctonia solani causing sheath blight. Current
13 1期 不同处理对水稻病程相关蛋白和过氧化物酶的影响
Science. 1999, 76( 10) : 1376~ 1384
[ 4 ] Lo Sze2Chung Clive, John DHipskind, Ralph L Nicholson. cDNA cloning of a sorghum pathogenesis2related protein( PR210) and
different ial expression of defense2related genes following inoculation with Cochliobolus heterstrophus or colletotrichum sublineolum.
Molecular Plant2microbe Interactions. 1999, 12( 6) : 479~ 489
[ 5 ] 蔡新忠,宋凤鸣,郑重.植物病程相关蛋白.植物生理学通讯. 1995, 31(2) : 129~ 136
[ 6 ] 吴健胜,董春,冷芬飞,王金生.水稻白叶枯病不亲和小种对水稻的诱导抗性和PRP 的初步研究.植物病理学报. 1996,
26(2) : 110
[ 7 ] Manandhar H K, Mathur S B, Smedegaard2Petersen, et al. Accumulat ion of transcript s for pathogenesis2related proteins and peroxi2
dase in rice plants triggered by Pyricularia oryzae, Bipolaris sorokiniana and U.V. light . Physiological and Molecular Plant Patholo2
gy. 1999, 55( 5) : 289~ 295
[ 8 ] Kazan, Kemal,Ken CGoulter, et al. Expression of a pathogenesis2related peroxidase of Stylosanthes humilis in transgenic tobacco and
canola and its effect on disease development. Plant Science. 1998, 135( 2) : 207~ 217
[ 9 ] 曾富华,吴岳轩,罗泽民,周朴华.稻白叶枯病不同毒力株细菌的诱导抗病作用与活性氧代谢的关系,湖南农业大学学
报. 1998, 24( 6) : 450~ 455
[ 10] 曾富华,吴岳轩,罗泽民.生物及非生物诱导因子对水稻白叶枯病的诱导抗性及其与活性氧代谢的关系, 中国水稻科
学. 1999, 13( 3) : 165~ 169
[ 11] 王海华,曾富华,康健,易克.镍处理对水稻叶片H2O2 积累和抗病的诱导效应,植物生理学报, 2001, 27( 1) :61~ 65
[ 12] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术(第二版) .北京:高等教育出版社. 1997, P85~ 140
[ 13] 其昌.蛋白质化学研究与进展.北京:科学出版社. 1997, P99~ 133
[ 14] 李妮亚,高俊凤,汪沛洪.小麦幼芽水分胁迫诱导蛋白的特征.植物生理学报. 1998, 24(1) : 65~ 71
[ 15] 李靖,利容千,袁文静.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化,植物病理学报. 1991, 21(4) : 277~ 283
[ 16] Carla C, Chilosi G, caporale C, et al. Induct ion of pathogenesis2related proteins in germinating wheat seeds infectedwith Fusarium
culmorum. Plant Science. 1999, 140( 1) : 87~ 97
[ 17] 曾富华,吴岳轩,罗泽民,易克,王勇刚,水稻对白叶枯病的诱导抗性与远离诱导部位活性氧代谢的关系, 植物病量学
报, 29(3) : 282~ 283
THE EFFECTS ON PATHOGENESIS2RELATED PROTEIN AND PEROXIDASE
IN LEAVES OF RICE SEEDLING INDUCED BY DIFFERENT FACTORS
ZENG Fu2hua1 WANG Yong2gang1, 2 YAO Zhi2xiong1 LUO Ze2min2
(11Department of Biology, Zhanjiang Normal College, Zhanjiang, Guangdong prov. 524048;
21Department of Biotechnology , Hunan Agricultural Universi ty , Changsha, Hunan prov. 410128)
ABSTRACT: Xanthomonas oryzae pv. Oryzae( XOO. ) stain 7521 and nickel nitr ate wer e used as
the inductive factors to tr eat leaves of rice seedling. Results showed that the best induced effects
were at the second day. The relative induced effect in the seedling leaves induced by Ni( NO3 ) 2
reached 5018% . With IEF and SDS2PAGE, induced protein in leaves of rice seedling gener ally
appear ed at 24h and 48h after induction by different factors. Two SDS2PAGE bands(MW54195
and 32136kD) of soluble protein in the upper leaves appear ed at 48h after induction by nickel ni2
t rate, one IEF band( pI511) and two POD isoenzyme bands(Rf0163 and 0164) did in upper leav2
es, another IEF band( pI5126) and four POD isoenzyme bands( Rf0162, 0163, 0164 and 0173) in
induced leaves. The soluble protein content increased after treatment and maximized at 24h and
48h after induction. Our study indicated that effects in the same plant induced by different factors
on PRP wer e differ ent .
Key words: rice; induced rsistance; pathogenesis2related protein; POD isoenzyme
14 Acta AgriculturaeNucleatae Sinica
2002, 16( 1) : 8~ 14