全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 022113203
茶树种质资源 ISSR 分子标记初步研究
谭和平1 　徐利远2 　余桂蓉2 　杜文平2 　王宇星2 　钟昌松3
(11 中国测试技术研究院 ,四川 成都　610021 ; 21 四川省农科院生核所 ,四川 成都　610066 ;
31 西南交通大学生物系 ,四川 成都　610031)
摘 　要 :本研究采用 100 个 ISSR 引物对 32 个茶树资源的DNA 进行 PCR 扩增反应 ,其中UBC826、UBC847、
UBC849、UBC850、UBC854、UBC860、UBC873、UBC881 共 8 个引物能扩增出较好的多态性 ,根据引物
UBC854、UBC881 的多态性能将 32 个茶树资源进行区分 ,初步建立 32 个茶树资源的 ISSR 分子指纹图
谱。研究表明 ISSR 能有效用于茶树种质资源鉴定 ,茶树 ISSR 反应具有较高的稳定性。
关键词 :茶树 ; ISSR ; 分子标记
A PRELIMINARY STUDY ON TEA GENETIC RESOURCES BY ISSR MARKERS
TAN He2ping1 　XU Li2yuan2 　YU Gui2rong2 　DU Wen2ping2 　WANG Yu2xing3 　ZHONG Chang2song3
(11 Chinese Academy of Measurement and Testing Technology , Chengdu , Sichuan 　610021 ;
21 Institute of Biotechnology and Nuclear Techniques , Sichuan Academy of Agriculture Sciences , Chengdu , Sichuan 　610066 ;
31 The Department of Bioengineering of Southwest Jiaotong University , Chengdu , Sichuan 　610031)
Abstract :The DNA of 32 tea accessions were amplified by 100ISSR primes. 8 of them , which wre UBC826 ,UBC847 ,
UBC849 ,UBC850 ,UBC854 ,UBC860 ,UBC873 and UBC881 , generated highly polymorphism DNA fragments. The primers
UBC854 and UBC881 could distinguish the 32 tea accessions. The study suggested that ISSR markers were very effective to
genotype the tea genetic recourses.
Key words :tea ; ISSR ; molecular marker
收稿日期 :2005204211
基金项目 :四川省科技厅“十五”重点攻关项目 (03NG001207)
作者简介 :作者简介 :谭和平 (1957 - ) ,男 ,重庆丰都人 ,研究员 ,主要从事茶叶生理生化研究。
　　茶树[ Camellia sinensis (L. O. Kumtze) ]是我国重要
的经济作物 ,栽培历史悠久 ,分布广泛 ,种质资源丰富。
常规育种和分类研究依赖表型选择 ,盲目性大 ,采用
DNA 分子标记性状稳定 ,易于鉴别。
以 PCR 技术为核心的 RAPD 不需先了解基因组的
DNA 序列 ,是有批量商业化生产 10bp 的引物 ,在茶树
资源的研究中得到了初步应用 ,谭和平等[1 ,2 ] ,陈亮
等[3、4 ] ,Lai 等对茶树 DNA 的纯化、RAPD 进行了研究 ,
表明可以采用 RAPD 区分不同的种质。谭和平[2 ] 对我
国 30 多个国家级省级良种采用 300 个 10bp 随机引物
进行扩增 ,从中筛选出 144 个有多态性的引物。但由
于 RAPD 所用的引物长度偏短 ,配对温度 (35 ℃) 偏低 ,
易产生错配而且稳定性较差 ,因此采用更长的 PCR 引
物 (18～20bp) ,更高的配对温度 (50 ℃～65 ℃) 的反应
体系将对茶树的分子标记研究更有实用价值。
ISSR 采用简单重复多聚核苷酸为引物 ,引物序列
长度在 18～24bp , PCR 配对反应温度 55 ℃～56 ℃,扩
增结果具有丰富的多态性和较好的稳定性。Lai 等[6 ]
采用 ISSR 对茶树的台湾引进种、本地种进行了分析 ,
表明 ISSR 在茶树品种间具有多态性和稳定性。Wolfe
等[12 ] 、Fang 等[9 ,10 ] 分别对 ISSR 的研究方法进行了系统
分析 ,比较了 RFLP、SSR、RAPD、ISSR 方法间的优势及
存在的问题 ,以及用 ISSR 用于品种间的鉴定、遗传作
图等进行了研究。方宣钧等[5 ]获得了抗性基因与 ISSR
标记的紧密连锁 ,指出 ISSR 的引物在 20 个核苷酸左
右 ,稳定性优于 RAPD。Kojima 等[12 ] 成功地在小麦上
定位一系列 ISSR 标记。研究表明 ISSR 具有丰富遗传
多样性和 PCR 扩增的稳定性 ,是一种较好的遗传分子
311　核 农 学 报　2006 ,20 (2) :113～115Journal of Nuclear Agricultural Sciences
标记。
目前本研究组收集了国内外近千份优质茶树品种
资源 ,其中国家级良种 77 份、省级良种 133 份、茶树资
源数百份。利用 ISSR 分子标记对茶树资源进行系统
研究 ,了解现有国内外茶树种质资源之间的亲缘关系
及品种间的遗传差异 ,进行茶树种质的鉴定 ,为进一步
利用这些资源进行新品种的选育提供理论指导。
1 　材料与方法
111 　实验材料
茶树材料由四川省农业科学院茶叶研究所郫县茶
场和重庆市茶叶研究所等单位提供 ,从所有的茶树种
质资源中 ,先期选用 32 份有代表性的材料用于实验。
具体材料名称及编号见表 1。
表 1 　茶树品种名称及编号
编号 品种 编号 品种
T1 白毫早 T17 凫早
T2 玉兰 T18 黄山种
T3 梅占 T19 台湾大叶
T4 云—8 T20 南川大石包大茶
T5 福安大白叶 T21 闽新选绿茶
T6 福云 6 # T22 南江 1 #
T7 凤凰水仙 T23 铁观音
T8 黔眉 419 T24 蜀永 703
T9 福鼎 T25 木禾种
T10 格鲁吉亚 4 # T26 武夷 3 #
T11 铁观音 - 1 T27 锡茶 5 #
T12 蜀永 808 T28 渝西 1 #
T13 苹云 T29 乌牛早
T14 菽北种 T30 平出特早
T15 白样观音 T31 红芽佛手
T16 蜀永 2 # T32 云南大叶
实 验 仪 器 包 括 PCR 仪 ( Biometra Tgradient
thermoblock) 、电泳仪 (BLO2RAD 公司 Pooerpac300 型稳
压稳流电泳仪) 、电泳槽 (北京市六一仪器厂 DYCP231D
型水平电泳槽) 和凝胶成像系统 (BLO2RAD 公司 Gel
Doc 1000 Darkroom) 。
TaqDNA 聚合酶购自 Promega 公司 (配套 10 ×buffer
及 Mg2 + ) , DNTPs 购于 Promega 公司 , Marker (Lambda
DNAΠEcorI + Hind Ⅲ) 购于 Fermentas life sciences 公司 ,
引物 UBCprimer set # 9 购于加拿大 The University of
British Columbia ,其中 8 个出带较好的引物序列如下 :
UBC826 : CACCACACACACACACC ; UBC854 :
TCTCTCTCTCTCTCTCRG; UBC847 : CACACACACACA2
CACARC ; UBC860 : TGTGTGTGTGTGTGTGRA ; UBC849 :
GTGTGTGTGTGTGTGTYA ; UBC873 : GACAGACAGACA2
GACA ; UBC850 : GTGTGTGTGTGTGTGTYC ; UBC881 :
GGGTGGGGTGGGGTG。
112 　试验方法
ISSR 反应体系 :2μlDNA (10ngΠμl) 、ddH2O161135μl、
10 ×buffer215μl、Mg (25mmolΠL) 2μl、UBC 引物 (115mmolΠ
L) 01165μl、DNTPs (215mmolΠL) 2μl、TaqDNA 聚合酶 (5UΠ
μl) 012μl , 共计 25μl。ISSR 反应程序 : 94 ℃预变性
300s ,94 ℃变性 45s ,52 ℃退火 40s ,72 ℃延伸 100s ,共 45
循环 ;72 ℃终止 300s ,4 ℃保存。ISSR 反应结果 :扩增结
束后 ,取 8μl 扩增产物 ,用 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,然后在
凝胶成像系统中检测 ,观察 ,拍照保存。
2 　结果与分析
211 　茶树 32 个种质资源 ISSR指纹图谱的初步建立
采用UBC Primer set # 9 共 100 个引物进行 ISSR 扩
增 ,大多数引物在茶树的不同种类或同一种类的不同
品种间不能同时表现出多态性 ,往往只是少量品种能
扩增出带 ,且带的数量较少 ,说明多态性不够。多态性
较好的引物有 : UBC826、UBC847、UBC849、UBC850、
UBC854、UBC860、UBC873、UBC881。用能同时在大多
数种质上产生多态性 (即能初步鉴定不同茶树种质)的
引物 ,对茶树 32 个种质资源进行 ISSR 扩增 ,其指纹图
谱见图 1、图 2。
图 1 　引物 UBC854 的 ISSR 扩增图谱
(1～32 号茶树品种名称见表 1 ,下图同)
图 1 表明 ,不同的茶树种质用引物 UBC854 进行
PCR 扩增 ,获得约 92 个遗传轨迹 ,其中有 20 个 (占
2117 %)是多态的 ,说明该引物可以较好地揭示茶树不
同种质的多态性水平 ,其中多态性水平较高的是 17 号
(凫早) 、18 号 (黄山种) 、19 号 (台湾大叶) 、26 号 (武夷
3 # ) 和 32 号 (云南大叶) 等茶树种质 ,其次是 3 号 (梅
411 核　农　学　报 20 卷
占) 、5 号 (福安大白叶)和 16 号 (蜀永 2 # )等。
图 1 中 7 号模板 (凤凰水仙)与 21 号模板 (闽新选
绿茶)没有扩增产物 ,说明该引物在这两个茶树品种上
无结合位点 ;而 10 号 (格鲁吉亚 4 # ) 和 22 号 (南江 1
# )分别只有 1 条特有的条带 ,且带的大小不同 ,说明
该引物用于这两个品种的特异性鉴定 ;其余的茶树模
板 ,均在大约 2000bp 与 2100bp 处各有 1 条共有的带 ,
不同的模板之间又有不同的带 ,这说明引物 UBC854
既可以鉴别茶树这个物种 ,又能有效鉴定不同的茶树
种类及品种。
图 2 　引物 UBC881 的 ISSR 扩增图谱
用引物 UBC881 进行茶树的 ISSR 扩增 ,结果见图
2 :获得约 87 个遗传轨迹 ,其中有 33 个 (占 3719 %) 是
多态的 ,说明该引物可以较好地揭示茶树不同种质的
多态性水平 ,其中多态性水平较高的是 17 号 (凫早) 、
18 号 (黄山种) 、19 号 (台湾大叶) 、20 (南川大石包大
茶) 、26 号 (武夷 3 # )和 29 号 (乌牛早) 等茶树种质 ,其
次是 8 号 (黔眉 419) 、9 号 (福鼎) 和 32 号 (云南大叶)
等。大多数能扩增出带的模板在大约 7000bp 处虽然
均有 1 条共有的亮带 ,然而不同的模板之间仍然存在
着它特有的条带 ,如 :4 号 (云 - 8) 、18 号 (黄山种) 、23
号 (铁观音) 、24 号 (蜀永 703) 、30 号 (平出特早) 等 ,这
说明引物 UBC881 也能有效鉴定不同茶树品种。
212 　ISSR在茶树种质资源鉴定上的应用
茶叶种质资源丰富 ,通过形态进行区分难度较大 ,
利用分子标记进行茶树种质资源的区分和鉴定 ,对茶
树的资源鉴定和利用有重要的价值。ISSR 反应的引
物长度在 18～ 24bp , PCR 反应配对温度在 50 ℃～
65 ℃,稳定性比 RAPD 高 ,研究表明可作为茶树资源的
有效鉴定手段。
利用 UBC set # 9 的 UBC826、UBC847、UBC849、
UBC850、UBC854、UBC860、UBC873、UBC881 , ISSR 引物
初步建立了 T1～T32 共计 32 个资源材料的分子指纹
图谱 ,利用这些图谱能进行这些种质资源的鉴定和利
用。同时利用这 8 个引物对 77 个国家级茶树良种 ,
133 个省级良种的 DNA 进行扩增 ,多数都能扩增出多
态性和特异性条带。通过这些标记带能将收集的茶树
种质资源进行有效鉴定 ,基本能将现有的品种资源进
行区分 ,这对茶树资源的利用有重要的指导价值。
3 　讨论
由于 ISSR 反应引物比 RAPD 引物长度长 ,配对温
度比 RAPD 配对温度高 ,研究表明 ISSR 反应的稳定性
比 RAPD 反应的稳定性高。但由于茶树含有丰富的茶
多酚 ,探索降低茶树提取的 DNA 中酚类物质的含量和
减少茶多酚在提取过程中氧化 ,对于提高茶树 ISSR 反
应的稳定性有重要价值。
参考文献 :
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