全 文 ：文章编号: 100028551(2005) 042274205
两种基因型泡桐体细胞胚胎发生及植株再生
范国强 翟晓巧 马新业 黎 明
(河南农业大学泡桐研究所,河南郑州 450002)
摘 要:以叶片和茎段为外植体,研究了毛泡桐和白花泡桐胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎发生
及植株再生情况。结果表明, 白花泡桐叶片和茎段胚性愈伤组织诱导的最适培养基分别为MS
+ 013mgPL NAA+ 14mgPL BA和MS+ 013mgPL NAA+ 8mgPL BA,其最适培养基皆为MS+ 013mgP
L NAA+ 17mgPL BA。从体细胞胚胎发育所需时间来看, 两种泡桐叶片的体细胞胚胎发育能力
均高于茎段。
关键词:泡桐; 外植体; 愈伤组织; 体细胞胚胎发生; 植株再生
SOMATIC EMBRYOGENESIS AND PLANTLET REGENERATION OF DIFFERENT
GENOTYPES OF Paulownia PLANTS
FAN Guo2qiang ZHAI Xiao2qiao MA Xin2ye LI Ming
( Institute of Paulownia, Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan , 450002)
Abstract :The induction of embryogenic calli, somatic embryogenesis and plantlet regeneration from leaves and nodal
segments of two genotypes of paulownia plants were studied. The results indicated that the opt imal media of
embryogenic callus induction from leaves and nodal segments of P . fortunei were MS+ 013mgPLNAA+ 14mgPL BA
andMS+ 013mgPL NAA+ 8mgPL BA respectively, and those media of embryogenic callus induction were MS+
013mgPL NAA+ 17mgPL BA. The capability of somatic embryogenesis from leaves of two genotypes of paulownia
plants was higher than that from the nodal segments.
Key words: Paulownia ; explants; callus; somat ic embryogenesis; plant regeneration
收稿日期: 2004209222
基金项目:国家自然科学基金(批准号 30271082)
作者简介:范国强( 1964- )男,河南禹州人,主要从事泡桐丰产栽培理论与技术及林木生物技术研究。Email: zlxx@public. zz. ha. cn。
翟晓巧现在河南省林业科学研究院工作。
植物体细胞胚胎发生及植株再生为高等植物在细胞水平上进行遗传操作及品种改良提供了可靠的
依据和有效途径[ 1~ 3]。近年来, 国内外科学工作者已对多种木本植物的体细胞胚胎发生及植株再生进
行过研究[ 4~ 16]。泡桐为玄参科植物,是我国的重要速生用材树种,有关其器官发生和原生质体游离及植
株再生的研究国内外已有报道[ 17~ 19] ,但有关体细胞胚胎发生及植株再生只有兰考泡桐的研究报道[ 20]。
为了顺利进行泡桐的基因工程和细胞工程操作及新品种的快速繁育,本研究以两种基因型泡桐叶片和
茎段为材料研究了其体细胞胚胎发生及植株再生。
1 材料与方法
111 试验材料
材料为用 2001年 9月采集于河南农业大学郑州林业试验站的毛泡桐( Paulownia tomentosa )和白花
274 核 农学 报 2005, 19( 4) : 274~ 278Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
泡桐(Paulownia fortunei )种子培育的 80d无菌苗。
112 试验方法
11211 胚性愈伤组织诱导 将以上两种泡桐无菌苗叶片剪成约 110 cm@110cm, 茎段剪为约 115cm作
为外植体放入盛有 25ml附加 013 mgPL的NAA和 2, 42D及 5~ 20 mgPL BA 的MS培养基的三角瓶中(每
个处理接种 30瓶,每瓶 3个外植体) ,将其置于光照强度为 1500lx、光照时间为 16hPd、温度为 25 e 培养
箱内培养。每隔 2天观察 1次,根据胚性愈伤组织诱导率筛选最适培养基。每试验重复 2次。
11212 胚性愈伤组织鉴定 参见陈正华方法[ 21]。
11213 胚性愈伤组织诱导率的计算
胚性愈伤组织诱导率= 诱导出胚性愈伤组织外植体的数量放置外植体的总数量 @100%
11214 体细胞胚胎发生的组织学观察 将不同基因型泡桐的外植体置于其胚性愈伤组织诱导的最适
培养基上(培养条件同上) ,进行体细胞胚胎发生, 每隔 3d取样 1次, 共取样10次。用卡诺氏液(Carnoy)
固定诱导时期不同的样品 24 h,常规石蜡切片法制作切片,切片厚度 7~ 8 Lm, 番红染色, 脱色、脱蜡封
片后,在尼康TS2100倒置荧光显微镜下观察体细胞胚的发生情况。
11215 数据处理 2种泡桐叶片在不同诱导培养基上的愈伤组织诱导率用 SAS V6112软件进行处理,
方差分析用LSD方法检验、检验水平为 P= 0105。
2 结果与分析
211 激素对泡桐胚性愈伤组织诱导的影响
在NAA和 2, 42D浓度分别为 013 mgPL时, 在含有不同浓度 BA的MS培养基上, 白花泡桐和毛泡桐
叶片和茎段(外植体)形成的愈伤组织存在着明显的的差异(表 1)。
表 1 不同激素组合对泡桐胚性愈伤组织诱导率的影响
Table 1 Effect of various plant hormone combinations on inductions rate of embryog
enic calli of different Paulownia plants (%)
基因型
genotypes
外植体
explants
013 mgPL NAA 013 mgPL 2, 42D
5BA 8BA 11BA 14BA 17BA 20BA 5BA 8BA 11BA 14BA 17BA 20BA
白花泡桐 P . f ortunei 叶片 leaves 2816e 4114d 6010c 9219a 7215b 5316c 0 0 0 0 0 0
茎段 nodal segments 1719b 2411a 1413c 1318c 1011d 619e 0 0 0 0 0 0
毛泡桐 P . tomentosa 叶片 leaves 3111e 4617d 5512c 7115b 8313a 6718b 0 0 0 0 0 0
茎段 nodal segments 1413e 2313d 2717c 3518b 4617a 2115d 0 0 0 0 0 0
注: 5BA指 5mgPLBA。下同。
Note: 5BAmeans 5mgPL BA. The same as others.
由表 1可以看出,以上 2种泡桐的叶片和茎段在 12种激素浓度组合的培养基上都有愈伤组织形成。但
是,叶片和茎段在含 NAA和 BA的培养基上形成胚性愈伤组织, 而在含 2, 42D和 BA 的培养基上只有大
量的非胚性愈伤组织诱导出来,而没有胚性愈伤组织形成。此外,在含有 NAA 的培养基上, BA 浓度的
变化引起了不同基因型泡桐胚性愈伤组织诱导率的变化。由此可知, NAA和 2, 42D在泡桐胚性愈伤组
织和非胚性愈伤组织的形成中起关键作用。因此,我们选择含有适当浓度 NAA和 BA的MS培养基进
行泡桐胚性愈伤组织诱导。
212 基因型和外植体对泡桐胚性愈伤组织诱导的影响
21211 基因型对泡桐胚性愈伤组织诱导的影响 由白花泡桐和毛泡桐叶片和茎段在胚性愈伤组织诱
导培养基上的诱导结果列于表 1和表 2。
从表 1可以看出, 2种基因型泡桐的不同外植体胚性愈伤组织诱导率存在较大的差异。白花泡桐
叶片的胚性愈伤组织诱导率随着 BA浓度的升高而升高,当 BA浓度达到 14mgPL时,胚性愈伤组织诱导
率最大,之后,随着 BA浓度的增大,胚性愈伤组织诱导率逐渐变小;而毛泡桐叶片胚性愈伤组织诱导率
275 4期 两种基因型泡桐体细胞胚胎发生及植株再生
在 BA浓度为 17mgPL达到最大值后快速下降。此外,不同基因型泡桐叶片胚性愈伤组织最高和最低的
诱导率变化幅度达到 50%以上。从 2种泡桐茎段的胚性愈伤组织诱导率来看,白花泡桐茎段胚性愈伤
组织诱导率在 619~ 2411% ,毛泡桐茎段在1413~ 4617%, 其达到最高诱导率时的 BA浓度分别为 8mgPL
和17mgPL。
基因型对泡桐胚性愈伤组织诱导的影响结果(表 1)表明,在 NAA浓度为 013 mgPL时, 6种 BA 浓度
组合对白花泡桐叶片胚性愈伤组织诱导率的影响有显著性差异,在MS+ 013mgPL NAA+ 14mgPL BA培
养基上诱导率最高, 而在培养基MS+ 013 mgPL NAA+ 5mgPL BA上诱导率最低。对白花泡桐茎段来说,
在MS+ 013mgPL NAA+ 20 mgPL BA培养基上,胚性愈伤组织诱导率最低, 而在MS+ 013mgPL NAA+ 8mgP
L BA培养基上,胚性愈伤组织诱导率最高。因此,选择MS+ 013mgPL NAA+ 14 mgPL BA和MS+ 013 mgP
L NAA+ 8 mgPL BA培养基分别为白花泡桐叶片和茎段胚性愈伤组织诱导的最适培养基。同理, 选择
MS+ 013mgPL NAA+ 17mgPL BA培养基为毛泡桐叶片和茎段胚性愈伤组织诱导的最适培养基。
21212 外植体对不同基因型泡桐胚性愈伤组织诱导率影响 由不同基因型泡桐叶片和茎段对胚性愈
伤组织诱导影响的结果(表1)可以看出,白花泡桐叶片诱导率变化幅度较大, 而茎段较小。即在相同的
诱导培养基上, 白花泡桐叶片胚性愈伤组织诱导能力高于茎段。对毛泡桐来说, 在相同培养上, 叶片胚
性愈伤组织诱导率也高于茎段。2种泡桐的各 2种外植体胚性愈伤组织诱导率在MS+ 013 mgPL NAA+
5 mgPL BA培养基上差异显著,毛泡桐叶片诱导率最高、茎段最低。即在MS+ 013 mgPL NAA+ 5 mgPL BA
培养基上, 2种泡桐的各 2种外植体中, 毛泡桐叶片最适宜胚性愈伤组织诱导。同理,在MS+ 013 mgPL
NAA+ 8 mgPL BA培养基上,毛泡桐叶片也是胚性愈伤组织诱导的最适合外植体;在MS+ 013 mgPL NAA
+ 11 mgPL BA和MS+ 013 mgPL NAA+ 14 mgPL BA培养基上, 白花泡桐叶片是胚性愈伤组织诱导的最适
外植体;在MS+ 013 mgPL NAA+ 17 mgPL BA和MS+ 013 mgPL NAA+ 20 mgPL BA培养基上, 均有利于毛
泡桐叶片胚性愈伤组织的诱导。这些结果说明,在相同的培养基上, 基因型和外植体种类影响胚性愈伤
组织的形成。白花泡桐和毛泡桐在诱导体细胞胚胎发生时,叶片均高于茎段。因此,叶片是白花泡桐和
毛泡桐诱导胚性愈伤组织的适宜外植体。
213 不同基因型泡桐体细胞胚胎发生的过程及其植株再生
21311 不同基因型泡桐的体细胞胚胎发生过程 2种基因型泡桐的各 2种外植体体细胞胚胎发生过程
(表 2)表明,在每一泡桐的最适培养基上,自接种 7d左右就观察到早期原胚( 6~ 9d)出现, 茎段在 12d时
观察到球形胚, 15d时观察到心形胚;叶片鱼雷胚与心形胚在试验观察中同时出现,而茎段鱼雷胚在其
心形胚发生 3d后出现;叶片都在 18d时观察到子叶胚,而茎段则在 21d。以上结果表明,在不同基因型
泡桐叶片体细胞胚胎发生过程中, 各阶段大致同步发生,其中,心形胚到鱼雷胚的发育过程相对较快;茎
段体细胞胚胎发育中,早期原胚到球形胚进程较慢。在 2种基因型泡桐中, 叶片体细胞胚胎发育能力均
高于茎段,表现为叶片体细胞胚胎发育所需时间比茎段短。泡桐体细胞胚胎发生及植株再生情况如
图1。
表 2 不同种泡桐的体细胞胚胎发生过程
Table 2 Somatic embryogenesis from different explants of different paulownia plants ( d)
基因形
genotypes
外植体
explants
早期原胚
pre2embryos
球形胚
globula2 shaped
embryos
心形胚
heart2shaped
embryo
鱼雷胚
torpedo2shaped
embryos
子叶胚
cotyledonary2shaped
embryos
白花泡桐 P . fortunei 叶片 leaves 9 12 15 15 18
茎段 Nodal segments 6 12 15 18 21
毛泡桐 P . tomentosa 叶片 leaves 6 12 15 15 18
茎段 Nodal segments 6 12 15 18 21
21312 不同种泡桐的体细胞胚胎的植株再生 将处于子叶胚阶段的胚状体在同一培养基上继续
发育成幼苗。当芽生长到 3 cm左右时,从其茎的基部剪断并转移到无任何植物生长调节剂的WPM培
养基上,放入光照培养箱内使其生根,第 15d时即可形成完整的植株。
276 核 农 学 报 19卷
图 1 毛泡桐体细胞胚胎发生及植株再生
Fig. 1 Somatic embryogenesis and plantlet regeneration of P . tomentosa
A:非胚性愈伤组织( @200) ; B:胚性愈伤组织( @200) ; C:球形胚( @400) ; D:心形胚( @600) ;
E:鱼雷形胚( @400) ; F:子叶胚( @200) ; G:离体胚状体( @400) ; H:发育的完整植株。
A:Non2 Embryogenic callus( @200) ; B:Embryogenic callus( @200) ; C:Globular shaped embryo( @400) ; D: Heart shaped embryo( @400);
E:Torpedo shaped embryo( @400) ; F: Cotyledonary embryo( @200) ; G: Isolated shaped embryo( @200) ; H:Seedlings.
3 讨论
植物的任何器官(组织)皆由细胞组成,这些植物器官(组织)理论上都能诱导出体细胞胚胎,并获得
完整的植株。但至目前,能诱导体胚发生和植株再生的木本植物只有24科 80余种[ 22] ,原因主要是由于
在其体细胞胚胎发生及植株再生过程中受到一系列内外因素的影响[ 4, 5,9, 23~ 30]。在这些因素中, 植物基
因型是影响体胚发生的重要因子之一[ 31~ 36]。本试验结果中, 毛泡桐和白花泡桐的叶片和茎段都能诱导
出体细胞胚。但是, 2种基因型泡桐不同外植体体细胞胚发生所要求的最适培养基表现出一定的差异,
且诱导率的大小也不同。该结果与 18个基因型火炬松成熟合子胚在相同培养基上的体细胞胚胎发生
频率存在明显差异的结果相似[ 15]。类似结果在黑云杉、白云杉、恩氏云杉、美国五针松和柑橘等木本植
物中得以体现[ 9, 19, 37, 38]。在禾本科植物中, Gonzalez等用 12个不同基因型的肿胀小麦合子胚为外植体进
行试验,结果表明,一些基因型外植体可以 100%的诱导出胚性愈伤组织, 而另一些则只有 54%能诱导
出胚性愈伤组织[ 39]。在蔬菜类中, Seabrook和 Douglass通过对 18个基因型的土豆研究结果表明,不同基
因型土豆相同外植体在体胚发生和植株再生能力方面都存在着差异[ 40]。从以上可以看出, 基因型对诱
导体胚发生的影响具有普遍性,它的影响随植物种类的不同而不同[ 41~ 44]。造成这些结果的原因可能与
植物固有的遗传特性和长期适应某种环境条件有一定的关系。
植物的体细胞胚胎发生和植株再生除与植物的基因型等因素有关外[ 45, 46] ,还与培养基中的植物激
素种类和浓度密切相关[ 47~ 49]。对木薯等植物研究发现, 培养基中的 2, 42D有利于外植体发育形成体细
胞胚胎,但是其植株再生则需转移到无 2, 42D的培养基上[ 50~ 53]。本实验结果表明, 2种基因型泡桐的不
同外植体在含有 2, 42D的MS培养基上不能诱导出胚性愈伤组织, 而在含 NAA的培养基上则可形成胚
性愈伤组织,继而发育为成熟的体细胞胚胎, 并在该培养基上萌发成完整的植株。此外, 虽说 2种基因
型泡桐叶片愈伤组织早期原胚出现的时间与茎段大致相同, 但是叶片愈伤组织子叶胚出现的时间都比
茎段出现的时间早。这表明不同植物由于其细胞内碳水化合物、次生代谢物质和内源激素等方面的差
异导致了其外植体体细胞胚胎发生过程中对激素种类和浓度的不同需求。
277 4期 两种基因型泡桐体细胞胚胎发生及植株再生
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(下转 254页)
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2005, 19( 4) : 274~ 278
1512%, 前者基本达到了半致死剂量的标准,是大多数品种(系)达半致死剂量的适宜剂量。后者远超过
了半致死剂量的标准,说明该剂量不适宜作为大多数品种(系)的诱变剂量。但个别品种(系)如临抗 1
号和晋麦 47号无论 6@1016Ar+Pcm2、112 @1017Ar+ Pcm2 剂量处理都不能使其达半致死剂量。因此可以
认为在通过Ar+ 注入使小麦品种(系)产生诱变的研究中,不同品种(系)要求的剂量不同。
313 关于离子注入对不同水旱型品种的敏感性影响, 前人未作过此项研究。本项研究表明:不同类型
的水旱品种(系)对离子注入的敏感程度存在显著差异, 其敏感性为高水肥型> 中水肥型> 旱地型。可
为等离子体注入小麦种子使其变异提供参考即旱地型品种(系)要求剂量高于中水肥型,中水肥型要求
又高于高水肥型。
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