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此文于 1995 年 11 月 19 日收到。
浙江省“8812”资助项目。
利用 RAPD 技术检测转绿型白化突变系
W25 基因组的变化
吴殿星1 夏英武1 舒庆尧1 张耀洲2 刘贵付1
(11 浙江农业大学核农所 21 浙江农业大学生化所 杭州 310029)
转绿型白化突变系 W25 系γ射线辐照籼型温敏核不育水稻 2177s 获得的一个
叶色突变体。在整个生育阶段 ,其叶色呈现白色2转绿2返白2复绿规律变化。RAPD
分析结果表明 ,70 个随机引物中有 3 个引物不能扩增出多态性 DNA ,共扩增出 493
条 DNA 条带 ,平均每个引物 714 条 ,其中引物 H05 能扩增出 W25 和 2177s 多态性产
物 ,2177s 表现出缺失 2 条特异性 DNA 条带。
关键词 :转绿型白化突变系 RAPD 水稻
前 言
叶绿素缺失突变的研究开始较早 ,本世纪 30 年代就有报道[8 ] 。现已对其发生、分类、遗
传、叶绿体超微结构及蛋白质分析等方面作了研究[5 ] ,但对其辐射诱发的基因组变化尚未见
报道。1990 年 ,Williams[9 ]首次运用随机引物扩增寻找多态性 DNA 作为分子标记 ,并将此法
命名为 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 。朱立煌、王京兆、陆军等分别利用该技
术对水稻加倍单倍体[3 ] 、农垦 58s 与 F12育性分离群体[1 ] 、辐射突变体 5460 和自然突变体
5460s 及亲本 IR54的基因组变化[6 ]进行了研究 ,取得了良好结果。本文以转绿型白化突变系
W25 为材料 ,旨在利用 RAPD 技术了解其基因组变化的信息 ,为其作为标记性状在两系杂交
稻的进一步利用及其在基础研究中的深入提供基础资料。
材 料 与 方 法
材料 2177s 及其突变系 W25。水稻转绿型白化突变系 W25 系γ射线辐照籼型温敏核
不育系 2177s 干种子后 ,经 6 代选择与稳定获得的一个叶色突变体[4 ] 。在 25 ℃下 ,出苗后幼叶
表现白色 ,3 叶期开始转绿 ,6 叶期完全转绿 ,8 叶期部分返白 ,12 叶期又开始复绿而完全正常
生长发育。
D NA的提取 按卢杨江等[2 ]的方法提取 ,但在氯仿抽提时添加 5 %(V/ V)的苯酚。
仪器和试剂 Taq 聚合酶及聚合酶链反应 ( PCR) 的温度循环仪 (浙江博联营养与工程科
学研究所生命技术中心产品) 。Taq buffer、MgCl2 、dA TP、d GTP、dCTP、dTTP 均为 Progema 产
98 核 农 学 报 1997 ,11 (2) :89～92Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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品。10 个碱基的随机引物为 British Columbia 大学和博联营养与工程科学研究所生命技术中
心共同开发产品 , G2C 含量为 50 %～80 %。
RAPD 反应体系 PCR 反应在 25μl 的体系中进行 , 内含 Taq 酶 2unit , Taq buffer
50mmol/ L , MgCl2 2mmol/ L , 4 种 dN TP 各 012mmol/ L ,随机引物 014μmol/ L ,模板 DNA
20ng。热循环条件 :先在 94 ℃下变性 10 min ,尔后在 94 ℃下 1min ,35 ℃下 1min , 72 ℃下 2min ,
循环 45 次 ,最后在 72 ℃下维持 6min。取反应产物 10～15μl 在含溴化乙锭 ( EB) 的 114 %琼脂
糖中电泳 ,观察、拍照 ,每反应重复 2～3 次。
结 果 与 分 析
(一) 随机引物的筛选
用 B01～B10、G01～G10、H01～H10、J01～J10、K01～K10、O01～O10、P01～P10 70 个随
机引物对 W25 和 2177s 进行 PCR 扩增 ,除 3 个引物 (J08、K05 和 O07) 未能扩增出 DNA 片段
外 ,其它引物 (占 9517 %) 都能扩增出多态性 DNA 片段 ,共扩增 493 条 ,平均每个引物 714 条
(表 1) 。这些片段大小在 315～0. 1kb 之间 ,个别的小于 011kb。其中引物 H05 能扩增出 W25
和 2177s 的多态性产物。
(二) RAPD 产物的电泳图谱分析
随机引物 H05 (A GTCGTCCC)能扩增出 W25 的 21 条 DNA 条带 ,与 2177s 相比 ,有 2 条
特异性 DNA 片段差异 (图版 Ⅰ) ,大小在 315～3. 1kb 之间 ,表现出 W25 的基因组与随机引物
结合位点发生了增加。
图版 Ⅰ 随机引物 H05 扩增的 DNA 多态性分析
Plate ⅠAnalysis of DNA polymorphisms amplified by random primer H05
11 分子量标记 (λDNA/ EcoRI) 2. 转绿型白化突变系 W25 3. 2177s
1. DNA sizing marker (λDNA/ EcoRI) 2. Greenable albino mutation line W25 3. 2177s
A. 21. 226kb B. 7. 421kb C. 5. 804kb D. 5. 643kb E. 4. 843kb F. 3. 530kb
09 核 农 学 报 11 卷
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讨 论
从外观上看 ,转绿型白化突变系 W25 的农艺性状、配合力和育性转换等特性与 2177s 相
仿 ,仅叶色表型存在明显的差异[7 ] 。但 RAPD 分析结果却表明 ,W25 与 2177s 存在两条带的
差异。说明 W25 基因组除了与控制叶色表型有关的部分发生变化外 ,可能也发生尚未引起表
观差异的其它变化。因此笔者认为 ,辐射诱发 W25 基因组变化较为复杂 ,或许至少有 2 个部
位发生了变化 ,只是有的变化不足以引起性状的变异。有关 W25 基因组的变化信息在进一步
研究中。
参 考 文 献
1 王京兆等 1 用 RAPD 方法分析水稻光敏核不育基因 1 遗传学报 ,1995 ,22 (1) :53～58
2 卢杨江等 1 提取水稻 DNA 的一种简易方法 1 中国水稻科学 ,1992 ,6 (1) :47～52
3 惠东威等 1RAPD 技术及其应用 1 生物工程进展 ,1992 ,12 (6) :1～5
4 刘贵付 1 籼型温敏核不育系叶绿素突变体的诱发、遗传及利用价值研究 1 浙江农业大学硕士论文 ,1994
5 吴殿星等 1 植物叶绿素突变体的研究及其应用探讨 1 中国农学通报 ,1995 ,11 (4) :36～39
6 陆 军等 1 利用 RAPD 技术检测水稻基因组的变化 1 科学通报 ,1993 ,38 (2) :2181～2182
7 夏英武等 1 籼型温敏核不育水稻叶绿素突变体的诱变鉴定及其初步研究 1 核农学报 ,1995 ,9 (3) :129～133
8 Constantin 等 ,王彩莲译 1 大麦叶绿素缺失突变体分析 1 原子能农业译丛 ,1984 , (1) :5～6
9 Williams J GK et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic marks. Nucl Acids Res , 1990 ,
18 :6531～6535
MEASUREMENT OF GENOME CHANGES OF
GREENABL E ALBINO MUTATION L INE c. v. W25
Wu Dianxing1 Xia Yingwu1 Shu Qingyao1 Zhang Yaozhou2 Liu Guifu1
( Instit ute of N uclear A gricult ural Sciences1 , Instit ute of Biochemist ry2 ,
Zhejiang A gricult ural U niversity , Hangz hou 310029)
ABSTRACT
W25 was a greenable albino mutation l ine , which was derived from a temperature - sensi2
tive genic male sterile rice 2177s , with 300 Gy gamma rays irradiation. During the whole growth
duration , the leaves of W25 showed the following characters : white , greenism , albinism and
greenism again. 70 primers were used for the detection of polymorphism , one of them gave
polymorphic products. RAPD analysis of W25 and 2177s with random primer H05 indicated
that there were t wo D NA bands differences.
Key words : Greenable albino mutation line , RAPD , rice ( O ryz a stativa L . )
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1997 ,11 (2) :89～92