全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032196203
抗氯霉素多克隆抗体的制备
王　谦　齐孟文 3 　何方洋　杨根海
(中国农业大学　北京　100094)
摘 　要 :用重氮化和 CDI两种方法合成了 CAP 全抗原 ,紫外分析和商业试剂盒 ELISA
鉴定表明合成成功 ;动物免疫 4 次后采血检测 ,多克隆抗体 50 %抑制率探测限可达
10ng/ ml ,效价可达 10 万以上稀释倍数 ,特异性较好。
关键词 :氯霉素 ;全抗原 ;多克隆抗体 ; ELISA
收稿日期 :2002210211
作者简介 :王谦 (1978～) ,男 ,在读硕士研究生 ,主要从事环境小分子化合免疫检测方法研究。3 通讯作者
氯霉素是一种高效广谱抗生素 ,对畜禽多种疾病尤其是革兰氏阴性菌感染有很好的控制
作用 ,但使用过程中存在严重副作用 ,能引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症等疾病[1 ] 。其在
动物肉、奶、蛋中的残留严重威胁人体健康 ,许多国家限制甚至禁止此药用于生产食品动物 ,并
对畜产品中 CAP 残留制定了严格的限量标准。因此 ,建立氯霉素残留的 ELISA 测定方法 ,对
于畜禽产品的安全控制具有重要意义。本文对比研究了重氮化和碳二亚胺 (CDI) 方法[2～4 ] 制
备 CAP 全抗原的合成工艺 ,并通过免疫新西兰大白兔得到其多克隆抗体 ,结果表明所用偶联
方法是可行的 ,试验为下一步制备抗氯霉素单克隆抗体和 ELISA 试剂盒调试奠定了基础。
1 　材料和方法
111 　材料
氯霉素、HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔 IgG,购于北京欣经科生物技术公司 ;氯霉素
琥珀酸钠盐、牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA)和抗氯霉素抗体购于 Sigma 公司 ;水溶性碳
化二亚胺 ( EDC) 、亚硝酸钠、N ,N2二甲基苯胺、氨基磺酸胺 ,购于北京化学试剂公司。
112 　CAP全抗原的合成
11211 　重氮化法 　(1)还原 :取 60mg CAP 溶于 700μl 无水乙醇中 ,用 1M HCI 调 pH 值至 1 ,加
3118mg 锌粉 65 ℃反应 40min。(2)重氮化 :用 1M HCl 将 (1)得溶液 pH调至 1 ,加入 20mg 亚硝酸
钠 (溶于 300μl 三蒸水中) ,4 ℃避光反应 40min ,用 N ,N2二甲基苯胺检测重氮化是否成功 ,用
22mg 氨基磺酸胺 (溶于 300μl 三蒸水中)去除多余的亚硝酸钠 ,用 1M Na0H 调 pH 至 8 ,离心取
上清液 2 等份备用。(3)偶联 :取 58mgBSA 和 20mg OVA 分别溶于 1ml 0102M 磷酸缓冲液 PB 中
(pH712) ,分别加入 (2)得溶液 ,4 ℃反应 12h ,用 015M pH 914 的碳酸缓冲液 CB 透析 3d。
11212 　CDI法 　称取 50mg BSA 溶于 1ml Tris2HCl 缓冲液中 (0105M ,pH714 , Ⅰ液) ,25mgEDC 溶
691　 核 农 学 报　2003 ,17 (3) :196～198Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
于 015ml Tris2HCl ( Ⅱ液)中、17mg 氯霉素琥珀酸钠盐溶于 015ml Tris2HCl ( Ⅲ液)中 ,将 Ⅰ液、Ⅲ液
混合 ,室温下缓慢加入 Ⅱ液 014ml ,避光搅拌 1h ,然后加入剩下的 Ⅱ液 ,4 ℃搅拌反应 12h 并静置
过夜 ,用 0105M pH714 Tris2HCl 缓冲液中透析 3d。
113 　CAP全抗原的鉴定
11311 　紫外谱 　用 0101M PBS(pH712) 稀释氯霉素纯品、BSA 和 OVA ,配成浓度各自为 10、100
和 100ug/ ml 的溶液 ;用紫外分光光度计扫描 (350～190nm) 3 种物质的最大吸收峰波长。然后
将用不同方法合成的 CAP 全抗原稀释成 100ug 蛋白/ ml 后做同范围波长的扫描 ,参照杨利
国[4 ]介绍的方法测算偶联后 CAP 与载体蛋白的摩尔比。
11312 　ELISA 鉴定 　将全抗原按 1∶500、1∶5000、1∶10000、1∶50000 稀释后包板 ,分别加入浓度
为 019、217 和 811ngΠml 的氯霉素标准品 ,和进口抗氯霉素抗体及酶标二抗做间接竞争性
ELISA。检测采用Labsystems Dragon 公司的 Wellscan MK3 型酶标仪读取吸收值 A。
114 　多克隆抗体的制备与鉴定
取全抗原 BSA2CAP 或 OVA2CAP ,加入等量弗氏完全佐剂 ,充分乳化后配成终浓度为 1mg/
ml (以载体蛋白质量计算) 的乳剂 ,皮下注射健康新西兰大白兔 4 只 (1ml/ 只 ,体重 2kg) ,间隔
15d 后以同量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后 ,进行 2 免 ,间隔 15d 同法进行 3 免和 4 免。4
免后 10d 兔耳缘静脉采血 ,室温静置 1h ,4 ℃放置过夜 ,10000rpm 离心 15min ,收集血清 ,4 ℃保
存。用抗原 BSA2CAP ,OVA2CAP 包被酶标板 (用 BSA2CAP 包被板检测用 OVA2CAP 免疫制备的
抗体 ;用 OVA2CAP 包被板检测用 BSA2CAP 免疫制备的抗体) ,将兔血清 10 倍比稀释做 ELISA
检测 ,同时设阴性 (未免疫前的兔血清)和空白 (分析缓冲液) 对照。以 A 值为阴性 3 倍时的稀
释倍数作为血清效价。将包被抗原以 1∶5000 稀释后包板 ,加不同稀释度的兔血清 ,然后分别
加入 019、217、811、10、100ngΠml 和 1μgΠml 的氯霉素标准品做间接竞争 ELISA 测定 ,以 50 %抑制
率可达到的探测限作为灵敏度。
2 　结果与讨论
211 　紫外扫描吸收光谱分析
由表 1 可见 ,BSA 和 OVA 偶联 CAP 后最大吸收峰都发生了蓝移 ,说明其分子结构有变化 ,
程度差异可能是因为偶联方法不同造成分子内发色及助色基团不同。参照杨利国测定重氮化
法合成的 CAP2BSA( Ⅰ) 、CAP2OVA( Ⅰ)中 CAP 和BSA 及OVA 的偶联率分别为 1∶10 和 1∶9 ,CDI
法合成的 CAP2BSA( Ⅱ) 、CAP2OVA( Ⅱ)中 CAP 和 BSA 及 OVA 的偶联率则为 1∶15 和 1∶11。
表 1 　各样品紫外扫描最大吸收峰
Table 1 　Theλmax of samples
扫描样本
samples
CAP BSA OVA CAP2BSA( Ⅰ) CAP2BSA( Ⅱ) CAP2OVA( Ⅰ) CAP2OVA( Ⅱ)
λmax (nm) 20715 22011 21713 21810 21615 21512 21313
212 　ELISA鉴定结果
用进口抗氯霉素抗体建立的间接竞争 ELISA 方法鉴定全抗原的合成 (表 2) 。结果表明 ,
全抗原可以和氯霉素标准品竞争抗氯霉素抗体 ,证明全抗原合成是成功的 ,对比竞争抑制数据
791　3 期 抗氯霉素多克隆抗体的制备
则可知 CDI法较重氮化法合成效果好。
表 2 　间接竞争 ELISA 检测重氮化法和 CDI法合成的全抗原的 A 值
Table 2 　Detection of antigens synthesized by diazotization and CDI reaction
with competitive2inhibition ELISA
方法
method
标准品
standard
(ngΠml) CAP2BSA 包被浓度diluted multiple of CAP2BSA CAP2OVA 包被浓度diluted multiple of CAP2OVA1∶500 1∶5000 1∶50000 1∶500 1∶5000 1∶50000
重氮化法
diazotization
0 21442 21459 21160 21453 21322 11699
019 21177 21174 11832 21175 21032 11500
217 21000 21009 11648 21046 11884 11317
811 01813 01783 01474 01888 01581 01273
CDI 法
CDI reaction
0 21314 21153 11856 21995 21325 11524
019 21203 11563 11625 21635 11958 11354
217 11865 11120 11399 21142 11482 11008
811 11325 01521 01102 11654 01967 01725
213 　血清效价测定
经倍比稀释测定 ,4 免后最好的兔血清 (3 号兔)的效价可达 106 以上 (表 3) 。
表 3 　血清效价测定
Table 3 　ELISA titers of serum
血清稀释倍数
diluted multiple of the serum
102 105 106 107 108 109
阴性
negative
空白
blank
吸收值
A 21641 21633 11636 01283 01073 01054 01248 01064
214 　间接竞争 ELISA方法测定氯霉素多克隆抗体的灵敏度
经多次实验发现 ,4 免后 2 号兔 (CDI法合成的 CAP2BSA 免疫) 的血清在 4000 倍稀释时的
抑制率最好 ,50 %抑制率可达 10ngΠml (见表 4) 。CAP 残留量各国规定各不相同 :美国、芬兰规
定为 0 ,欧共体规定为 10μgΠkg ,欧共体中的许多成员国单独规定更低 ,为 1μgΠkg。我国农牧发
[2001 ]24 号文规定在马肝、鸡肉、真鲷肌肉的残留限量为不得检出 ,对用酶联免疫 ( ELISA)和高
效液相色谱分析法 ( HPLC) 检测时 ,要求其检测限量为 1ngΠg。而 CAP 常用检测方法有微生物
法、比色法、高效液相色谱法、气相色谱法、放射免疫和酶联免疫。ELISA 较之其它方法具有灵
敏度高 ,特异性强 ,仪器化程度低和样本前处理相对简单等优点 ,适于现场监控和大量样本筛
查。本实验目的旨在对氯霉素的残留进行有效控制 ,保证人们食品安全。此处报道的 50 %抑
制率为 10ngΠml 只是实验的阶段性成果 ,进一步研究正在进行之中。
表 4 　氯霉素多克隆抗体的灵敏度测定
Table 4 　The sensitivity of polyclonal antibody against chloramphenicol
标准品 standard
0 019ngΠml 217ngΠml 811ngΠml 10ngΠml 100ngΠml 1μgΠml
吸收值
A 11422 11172 11057 01868 01619 01346 01211
(下转第 195 页)
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2003 ,17 (3) :196～198
ISOZYME ANALYSIS OF MAIZE( Zea mays L. ) INBRED LINES AND A F2 SEGREGATION
POPULATION DURING ANTHER CULTURE PROCEDURE
QI Yan2fang1 　YANGJing2cheng2 　ZHOU Zhu2hua1 　XING Yan2ju1
XU Li2hua1 　XU Fang2zuo1 　QIU Deng2lin1
(1. Institute for Application of Atomic Energy , Shandong Academy of Agricultural Sciences ,Jinan , Shandong prov 　250100 ;
2. Laboratory of Quantitative Vegetation Ecology , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 　100093)
Abstract :Anthers of two inbred lines( A3 and A46) with different induction rate and their F2 ( A3
×A46) segregation population were cultured. The peroxidase isozyme patterns of their embryoids
and calli were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis( PAGE) . The results indicated
that the isoperoxidase bands Rf 0150 and Rf 0152 were only present in the inbred line and donor
plants of F2 segregation population with high induction rate. It is supposed that the isoperoxidase
patterns can be used as a kind of reliable biochemical marker to improve anther culturability of
maize.
Key words :maize( Zea mays L . ) ; F2 segregation population ; anther culture ; peroxidase
(上接第 198 页)
参考文献 :
[ 1 ] 　Meyer L ,et al . Blood dyscrasias attributed to chloramphenicol . A review of 641 publised and unpublished cases. Postgrad Med ,1974 ,
50 :123～126
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[ 3 ] 　王桂枝 ,石德石 ,等 ,氯霉素免疫原的合成与鉴定 ,中国兽医学报 ,1998 ,18 (2) :163～167
[ 4 ] 　杨利国 ,酶免疫测定技术 ,南京 :南京大学出版社 ,1998
STUDY OF THE POLYCLONAL ANTIBODY AGAINST CHLORAMPHENICOL
WANG Qian 　QI Meng2wen 　HE Fang2yang 　YANG Gen2hai
( China Agricultural University , Beijing 　100094)
Abstract :The antigen of Chloramphenicol was synthesized by CDI reaction and diazotization reac2
tion respectively , and identif ied with UR scan and imported commercial kit. After immunized 4
times ,the sensitivity of the antiserum obtained was more than 10ngΠml.
Key words :chloramphenicol ; antigen ; polyclonal antibody; ELISA
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2003 ,17 (3) :191～195