全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 042349204
内生枯草芽孢杆菌 B2001 菌株内生定殖
研究及生物学特性
易有金1 　罗　坤2 　罗　宽1 　刘二明1
(11 湖南农业大学生物安全科技学院 ,湖南 长沙　410128 ;21 广西大学农学院 ,广西 南宁　530005)
摘 　要 :用浸种、浸根、淋根、伤茎、伤叶和喷雾等接种方法测试枯草芽孢杆菌 B2001 菌株入侵烟草植株的
途径 ,发现该菌可通过自然孔口和伤口入侵寄主植物 ;取接种植株的茎部组织切片在电镜下观察 ,发现
该菌株在烟草的微管束和细胞内定殖。生长特性研究结果表明该菌株最适生长 pH 为 715 ,最适生长温
度为 30 ℃,48～96h 内处于稳定生长期。
关键词 :烟草 ;内生枯草芽孢杆菌 B2001 ;内生定殖 ;生物学特性
ENDOPHYTE B2001 ( Bacillus subtilis) COLONIZATION AND ITS BIOLOGICAL CHARACTERS
YI You2jin1 　LUO Kun2 　LUO Kuan1 　LIU Er2ming1
(11 College of Bio2Safety Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan , 410128 ;
21Agricultural College , Guangxi University , Nanning , Guangxi , 530005)
Abstract :The different inoculation methods , such as dipping seed , dipping root , watering root , injecting stem , injecting leaf ,
praying were used to test how the endophyte B2001 ( Bacillus subtilis) entered the host plant . The results indicated that the
bacteria penetrated into plant tissues through natural wounds. Observing the plant tissue after inoculation 30 days by electron
microscope , strain B2001 could be found in vascular and cell . Study on its biological character showed that the optimal pH and
temperature for the growth of B2001 were 715 and 30 ℃, respectively ,and its stable growth stage was 48～96h.
Key words :tobacco ; endophyte Bacillus subtilis B2001 ; endophytice colonization ; biological characters
收稿日期 :2006212203
基金项目 :湖南省教育厅重点资助项目 (02A019)
作者简介 :易有金 (19682) ,女 ,湖南涟源人 ,博士研究生 ,主要从事植物病理学研究。Tel : 073124618169 ; E2mail :yiyoujin @163. com　　植物内生细菌因与寄主植物在长期共同进化过程中形成密切的相互关系 ,且生存微环境稳定 ,成为化肥、农药和其他微生态制剂的最佳竞争者 ,它的合理应用将减少化学药剂造成的环境污染 ,提高农田生态系统的生物多样性 ,有利于保持生态平衡 ,兼具防病、促生效应的生防菌剂的应用 ,有广阔的前景[1 ,2 ] 。笔者近年来对烟草青枯病害的内生生防菌进行了研究 ,2003年 ,笔者所在的湖南农业大学生物安全科技学院生物防治实验室分离的内生枯草芽孢杆菌菌株 B2001 在桂阳、2004 年在宁乡的小区防治试验均取得了良好的效果 ,防治率分别为 8215 %和 6512 %[3 ,4 ] 。本研究旨在测定 B2001 在烟草植株的定殖部位 ,并探索其能否在不同的烟草品种上定殖及生物学特性 ,以期为该菌株 进一步应用于植物微生态制剂开发和利用提供理论和实践基础。1 　材料与方法111 　材料内生枯草芽孢杆菌菌株 B2001 由本实验小组分离纯化。烟草种子 NC82、云烟 87、红花大金元、翠碧 1号、K326、K346 由湖南农业大学烟草研究中心提供。112 　方法11211 　抗利福平菌株“B2001”的筛选 　用画线法将生长 2d 的 B2001 菌株移到含有 10μgΠml 利福平的 NA 培养基中 ,28 ℃下培养 ,3d 后将长出的菌落移到含 20μgΠ
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ml 利福平的 NA 培养基中 ,28 ℃下培养 ,3d 后将长出
的菌落再移到含 30μgΠml 利福平的 NA 培养基中培养 ,
依此反复培养筛选 ,直到能在含有 300μgΠml 利福平的
NA 培养基中平稳生长为止。经测定 ,抗 300μgΠml 利
福平的菌株形态和生理生化特性与野生 B2001 菌株相
同。
11212 　B2001 菌株入侵烟草的途径测定 　分别用浸种
法、浸根法、淋根法、喷雾法、伤茎法、伤叶法检测 B2
001 菌株入侵烟草的途径。将 K326 烟草种子浸入浓
度为 108 cfuΠml 的 B2001 诱变菌株的菌体悬浮液中
24h ,以浸灭菌水为 CK。将烟草播种于装有灭菌菜地
土的花盆中。待浸灭菌水的烟草种长至 20cm 时 ,用浸
根法 (30min) 、淋根法 (每株淋 30ml) 、喷雾法 (2mlΠ株的
量均匀喷洒到烟草植株上) 、伤茎法 (刺伤烟草苗茎的
中部) 、伤叶法 (刺到烟草叶片)把 108 cfuΠml 的B2001 诱
变菌株的菌体悬浮液接种到烟草植株上 ,以灭菌水按
上述不同的方法处理为 CK。每处理设 3 次重复 ,每重
复 3 株烟草。接种 30d 后按方法 11214 进行接种菌的
回收。
11213 　在不同烟草品种上的定殖 　分别将 NC82、云烟
87、红花大金元、翠碧 1 号、K326、K346 烟草种子用浓度
为 108 cfuΠml 的B2001 诱变菌株的菌体悬浮液浸种 24h ,
对照浸种在灭菌水中 ,分别播种于装有灭菌菜地土的花
盆中 ,出苗后 30d 按方法 115 进行B2001 菌株的回收。
11214 　接种菌的回收 　分别剪取烟草的根、茎、叶各
5g ,用 75 %乙醇消毒 30s ,再用 011 %升汞消毒 1～3min
(叶组织消毒 1min) ,然后用灭菌水冲洗 4 次 ,置于灭菌
研钵中研磨 ,研磨液用灭菌水分别稀释成浓度为
10 - 1 、10 - 2 、10 - 3 、10 - 4 、10 - 5 、10 - 6 、10 - 7 、10 - 8 ,分别取
011ml 稀释液移到培养皿中 ,倒入 45 ℃含有 300μgΠml
利福平的 NA 培养基 ,摇匀 ,另取 1ml 最后一次组织表
面消毒的灭菌水冲洗液置于培养皿内 ,倒入培养基 ,于
28 ℃下培养 ,每处理 3 次重复 , 2d 后观察 ,若在含
300μgΠml 利福平的 NA 培养基内长出与 B2001 菌株相
同的菌落 ,而对照的植株和最后一次表面消毒的灭菌
水冲洗液中无细菌长出 ,说明长出的细菌为内生的 B2
001 菌株。
11215 　B2001 菌株定殖部位的检测 　无菌烟草苗的培
育及接种将烟草 K326 种子放入 75 %乙醇中 30s ,取出
后在 20 %的次氯酸钠溶液中消毒 30min , 再用含
200μgΠml 的利福平溶液浸泡 20min ,用灭菌水冲洗 4
次 ,用浓度为 108 cfuΠml 的 B2001 菌株的菌体悬浮液浸
种 24h (浓度为 108 cfuΠml) ,对照浸种在灭菌水中 ,分别
播种于装有灭菌菜地土的花盆中 ,出苗生长 30d ,用于
超薄切片。
11216 　切片与镜检 　将烟草植株茎部切成小块 ,在戊
二醛中固定 2h ,用磷酸缓冲液冲洗 2 次 ,每次 10～
15min(下同) ,再用锇酸固定 1h ,用磷酸缓冲液冲洗 2
次 ,依次在 30 %、50 %乙醇中脱水各 10min ,在室温下
用 70 %醋酸铀块染色 12h ,依次在 70 %、80 %乙醇中脱
水各 10min ,在 100 %乙醇中脱水 2 次 ,每次 15min ,最
后在 100 %丙酮中脱水 15min ,脱水的材料在室温下于
渗透液 (丙酮 :树脂 = 1∶1) 中放置 12h ,移到纯树脂中 ,
依次在室温下聚合 3h ,40 ℃下聚合 1d ,60 ℃下聚合 1d。
包埋好的材料 , 用切片机进行超薄切片 , 用铅盐
(pH618)染色 10min ,再用电镜透射 ,观察细菌在茎部
组织内的定殖部位 ,以无菌苗为 CK。
113 　生物学特性测定
11311 　生长曲线 　将 B2001 菌株接种到 NA 培养液
中 ,于 28 ℃的摇床 (180r/ min)培养 ,接种后的前 48h ,每
隔 2h 测 1 次 680nm 波长下的 OD 值 ,48h 后每隔 12h
测 1 次。每处理 3 次重复。
11312 　温度试验 　将 B2001 菌株接种到 NA 培养液
中 ,分别置于 15 ℃、20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、
38 ℃、40 ℃、43 ℃、45 ℃、48 ℃和 50 ℃的摇床 (180r/ min)
培养 48h 后在 680nm 波长下测其 OD 值。每处理 3 次
重复。
11313 　pH 值试验 　将 NA 培养液分别调制 pH 为
410、413、415、510、515、518、610、615、710、715、810、815、
910、915 和 1010 ,接种 B2001 菌株于 28 ℃的摇床 (180r/
min) ,48h 后在 680nm 波长下测其 OD 值。每处理 3 次
重复。
11314 　碳、氮源利用 　在灭菌的不加碳源基础培养基
中分别加入经 0122μm 细菌过滤器过滤的蔗糖、葡萄
糖、D2半乳糖、α2乳糖、麦芽糖、D2果糖、D2木糖、甘露醇
作为碳源 ,以不加碳源为对照 ,每处理 3 次重复 ;在灭
菌的不加氮源基础培养基中分别加入经 0122μm 细菌
过滤器过滤的胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、
干酪素、氯化铵、硝酸钾、脲和草酸铵作为氮源 ,以不加
氮源为对照 ,每处理 3 次重复。培养基分装于试管内 ,
接种 B2001 菌株 ,于 28 ℃的摇床 (180r/ min) 培养 ,48h
后培养液明显比对照管浑浊者为利用该碳 (氮) 源 ,否
则为不利用。
2 　结果与分析
211 　B2001 菌株入侵烟草 K326 植株的途径
本试验采用的 B2001 菌株入侵烟草 K326 植株途
053 核　农　学　报 21 卷
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径的测试结果见表 1。除喷雾法外 ,其他接种方法均
可使 B2001 入侵烟草植株。其中浸种、浸根和淋根处
理的烟草植株回收到的 B2001 菌株菌量较多 ;而伤茎、
伤叶处理的烟草植株回收的菌量较少。
表 1 　不同途径入侵烟草 K326 植株回收的组织菌量
Table 1 　Number of strain B2001 re2isolated from
tissues of tobacco K326 ( ×105 cfuΠg fw)
接种方法
methods of inoculation
B2001 清水对照 water control
根 root 茎 stem 叶 leaf 根 root 茎 stem 叶 leaf
浸种法 dipping seeds 6127 3184 01156 - - -
浸根法 dipping roots 7113 4135 01562 - - -
淋根法 watering roots 5140 3121 01124 - - -
喷雾法 spraying - - - - - -
伤茎法 injecting stem 2131 1165 01078 - - -
伤叶法 injecting leaf 010154 010187 01092 - - -
注 : - 表示未回收到 B2001 菌株 1
Note : - means the bacteria was not re2isolated from plants1
212 　B2001 菌株在不同品种烟草植株中的定殖
将B2001 菌株接种到不同品种的烟草植株上 ,30d
后进行接种菌回收 ,结果见表 2。在所接种的 6 个烟草
品种植株的根部、茎部、叶部都能回收到B2001 菌株。 表 2 　B2001 菌株在不同烟草品种植株中的定殖Table 2 　Colonization ability of strain B2001in different tobacco species烟草品种tobacco species 根部root 茎部stem 叶部leafNC82 + + +云烟 87 Yun 87 + + +红花大金元 Honghuadajinyuan + + +翠碧 1 号 Cuibi1 + + +K326 + + +K346 + + +注 : + 表示回收到 B2001 菌株 , - 表示未回收到 B2001 菌株 1Note : + means the bacteria was re2isolated from plants , - means the bacteriawas not re2isolated from plants.213 　B2001 菌株在植株内的定殖部位将 B2001 菌株接种到烟草上 ,30d 后取烟草茎部组织进行超薄切片 ,在电镜下观察 ,发现茎部组织维管束的导管内及其附近的细胞内 (图 1) 有细菌存在 ,其中 ,多数细菌生存于导管内 ,而在无菌苗 (CK) 的茎部组织内未发现有细菌存在。
图 1 　B2001 菌株在烟草的定殖部位 　( ×2500)
Fig. 1 　Colonization site of strain B2001 in the stem of tobacco 　( ×2500)
左图接种 B2001 菌株 ,右图为对照 ,Tr 为导管 ,w 为细胞壁 ,PC为薄壁细胞
left : inoculation with strain B2001 ; right : CK,Tr was trachea , w was cell wall , PC was parenchymatous cells
214 　B2001 菌株生物学特性
B2001 菌株在接种后 48h 内处于对数生长期 ,接种
后 48～96h 处于稳定生长期 ,此阶段菌量最多 ,接种
96h 后进入衰老期 (图 2) 。
pH值对菌株 B2001 菌株生长有明显影响 (图 3) ,
在 pH410～1010 范围内 ,B2001 菌株生长较好 ,pH610～
910 较适宜 ,最适 pH为 715。
图 4 显示 ,B2001 菌株在 15 ℃～50 ℃范围内都能
生长 ,最适生长温度为 30 ℃。说明 B2001 菌株适宜在
相对高温环境中生长。
将 B2001 菌株分别接种于装有 11314 中所述各培
养基的试管内 ,培养后发现所有的碳源和除硝酸钾以
外的氮源培养液明显比对照管浑浊 ,说明 B2001 菌株
能利用所述碳源及除硝酸钾以外的氮源。说明该菌对
碳源和氮源没有严格的要求 ,适应性很强。
3 　结论与讨论
B2001 菌株入侵烟草植株的途径测试结果表明 ,B2
001 菌株通过浸种、浸根、淋根、伤茎、伤叶方法可入侵
寄主植株 ;在所检测的 6 个烟草品种植株的根部、茎
部、叶部都能回收到 B2001 菌株 ,说明该菌株在烟草植
株中生存不受烟草品种的影响。取接种植株的茎部组
织切片在电镜下观察 ,发现其在烟草的微管束和细胞
153　4 期 内生枯草芽孢杆菌 B2001 菌株内生定殖研究及生物学特性
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图 2 　培养时间对 B2001 菌株生长的影响
Fig. 2 　Effect of culture time on the growth
of strain B2001
图 3 　pH值对 B2001 菌株生长的影响
Fig. 3 　Effect of medium pH on the growth
of strain B2001
图 4 　培养温度对 B2001 菌株生长的影响
Fig. 4 　Effect of culture temperature on
the growth of strian B2001
内定殖。生长特性研究结果表明它的最适生长 pH 为
715 ,最适生长温度为 30 ℃,48h 内处于对数生长期 ,48
～96h 内处于稳定生长期。B2001 菌株能利用上述所
有的碳源和除硝酸钾以外的氮源。表明该菌对碳源和
氮源没有严格的要求 ,适应性很强。
植物内生细菌是通过自然孔口和伤口进入寄主植
物的[5 ] 。本研究用浸种、浸根、淋根、注射、伤茎和伤叶
法将 B2001 菌株接种到烟草植株上 ,都能从烟草的根、
茎或叶组织回收到 B2001 菌株。因此 ,在大田上利用
B2001 菌株来防治烟草青枯病时 ,可采取浸根、淋根和
浸种等方法处理烟草。
本研究中 ,用浸种、浸根和淋根处理的烟草植株 ,
不但从根部分离到 B2001 菌株 ,而且从植株的茎组织
也分离到该菌 ;以伤茎法接种的植株可以从叶和根部
分离到 B2001 菌株 ,说明该菌能在烟草植株的根、茎、
叶部相互转移。菌体从根部向茎、叶部转移很可能是
在导管内借助蒸腾作用随水分向上运输 ,而从茎、叶部
转移到根部很可能是随着营养物质从韧皮部的筛管向
下运输。
B2001 菌株能在所有测试的烟草品种植株内定
殖 ,说明该菌株在烟草植株中生存不受品种的影响。
但它是否有寄主专化性 ? 能否在别的植物体内生存 ?
则有待今后的研究。
根据电镜下的观察 ,发现烟草茎部组织维管束的
导管和附近的细胞内均有细菌存在 ,其中 ,多数细菌存
在于导管中 ,进一步确认了 B2001 菌株的内生性 ,同时
也说明该菌株侵入烟草植株后多数定殖在维管束的导
管内 ,这与以往内生细菌报道的相同[6～8 ] 。
内生枯草芽孢杆菌 B2001 菌株能在不同的烟草品
种中定殖 ,在烟草的维管束组织内 ,具有良好的环境适
应性 ,几乎能利用本文所述所有的碳、氮源 ,这为利用该
菌进行烟草青枯病的田间防治提供了理论和实践依据。
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