全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 062435203
辐照对结缕草农杆菌介导法遗传转化的影响
张　磊1 , 2 　胡繁荣1 　张琳琳1 　王雪艳1 　马传喜2 　吴殿星1 3
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;21 安徽农业大学农学系 ,安徽 合肥　230036)
摘 　要 :以结缕草成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织为材料 ,研究了钴260 伽玛射线辐照对农杆
菌介导法遗传转化的影响。结果表明 ,在辐照剂量为 1～4Gy 时 , GUS 瞬间表达率随剂量的增
加逐渐提高 ,但在辐射剂量高于 4Gy 时 ,GUS 瞬间表达率随剂量的增加而下降。综合考虑辐照
后愈伤组织的存活率和 GUS 瞬间表达率 ,初步认为 2Gy 为最佳辐照剂量。进一步观察表明 ,
辐照处理后以继代培养 36h 最适合农杆菌介导感染。
关键词 :结缕草 ;伽玛辐照 ; GUS 瞬间表达
EFFECT OF GAMMA IRRADIATION ON Agrobacterium2MEDIATED GENETIC
TRANSFORMATION OF JAPANESE LAWNGRASS( Zoysia japonica Steud. )
ZHANGLei1 ,2 　HU Fan2rong1 　ZHANGLin2lin1 　WANG Xue2yan1 　MA Chuan2xi2 　WU Dian2xing1 3
(11 Institute of Nuclear Agriculture Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029 ;
21 Agronomy Department , Anhui Agricultural University , Hefei , Anhui , 230036)
Abstract :The effects of gamma irradiation on Agrobacterium2mediated genetic transformation of were investigated in
the current paper , using embryonic calli derived from the mature seeds of Japanese lawngrass ( Zoysia japonica
Steud. ) . The result indicated that the GUS transient expression rates were enhanced with the increasing doses when
treated by doses lower than 4Gy , however it would be decreased when treated by doses higher than 4Gy. Based on
the survival rate and GUS transient expression rate , 2Gy is the optimal dose for Agrobacterium2mediated genetic
transformation. Further observation found that 36 hours reculture after gamma irradiation is the most appropriate for
Agrobacterium infection.
Key words :Japanese lawngrass ; gamma irradiation ; GUS transient expression
收稿日期 :2003206215
基金项目 :国家自然科学基金 (30370147)和浙江省重大项目 (021102530)
作者简介 :张磊 (1979～) ,男 ,安徽蒙城人 , 博士研究生 , 主要从事农作物种质创新与利用的研究。3 通讯作者 ,Tel & Fax : 0571286971202 ,Email : dxwu @zju. edu. cn农杆菌介导法以可转移较大的 DNA 片段、成本低、无须复杂的原生质体培养、导入外源基因以单拷贝数居多、再生植株无育性问题等诸多优点逐渐成为植物遗传转化的有效方法[1 ] 。农杆菌介导的遗传转化依赖于 2 大技术体系 ,即高效的再生体系和转化体系。由于大多数单子叶植物非农杆菌的天然寄主 ,因而该方法一直未能像在双子叶植物中那样得到广泛的应用[2 ] 。鉴于单子叶植物与双子叶植物之间的再生体系并无显著差异 ,转化体系 (效率)就成为农杆菌介导单子叶植物转化的瓶颈。为此 ,许多学者先后就如何提高该方法的转化效率作了大量的研究 ,包括在转化过程中引入乙酰丁香酮可提高转化效率等 ,研究还表明强感染力农杆菌菌株的选择、农杆菌活性、菌液浓度、浸染时间以及共培养条件均不同程度影响转化效率[3～5 ] 。另在农杆菌浸染过程中 ,采用表面活性剂、负压处理、外植体致伤等辅助处理也能提高转化效率[6～9 ] 。
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结缕草 ( Zoysia japanica Steud. )是享誉世界的暖季型草坪草 ,具有成坪后草坪密度大、耐旱、抗病、耐
践踏、低维护、耐贫瘠等优良特性 ,广泛用于运动场、城市绿化和环境保护等多种场所[10 ,11 ] 。利用转基因
技术 ,针对性地将目的基因导入愈伤组织或原生质体 ,获得转基因植株以提高抗逆性、抗除草剂、抗病虫
性等 ,已成为结缕草遗传改良的研究前沿[12 ] 。为结缕草转基因育种的深入开展奠定基础 ,也为提高农
杆菌介导单子叶植物的遗传转化探素新的思路 ,本文以结缕草成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织为材
料 ,采用60 Co 伽玛射线辐照 ,从辐照调节愈伤组织 (转化受体)状态的角度探讨了辐照对结缕草农杆菌介
导法遗传转化的影响。
1 　材料与方法
111 　材料
青岛结缕草 ,由北京林业大学韩烈保教授提供。转基因瞬间表达所用农杆菌菌株为 EHA105 ,由加
拿大渥太华大学生化系提供。质粒 p KUC 串联排列杀虫晶体蛋白基因 cry1Ab (由玉米启动子 Ubiquitin
驱动) 、卡那霉素抗性基因 npt Ⅱ、潮霉素抗性基因 hpt、报告基因 gus (均由 CaMV 35S 启动子驱动) 。
112 　愈伤组织的诱导
结缕草愈伤组织的诱导参见张磊等[13 ] 方法 ,即取破除休眠的成熟种子 ,70 %酒精浸泡 30s ,无菌水
冲洗 3 遍 ,011 %氯化汞消毒 10min ,无菌水冲洗 4 次 ,每次浸泡 5min ,用灭过菌的滤纸吸干水分后接种于
MS 诱导培养基 ,将培养皿置于 25 ℃、16h 光照、光强 6000lx 的条件下诱导愈伤组织。待出愈后 ,转移至
暗条件下培养 ,每 2 周以相同培养基继代培养 1 次。
113 　农杆菌培养与转化
农杆菌培养参见项友斌等[14 ]方法 ,即取 OD600 值为 015 的农杆菌悬浮液 ,浸泡 10min ,无菌滤纸吸
去多余菌液 ,接种于MS 诱导培养基上 ,置于 25 ℃、16h 光照、光强 6000lx 共培养。至出现农杆菌菌落 ,用
含 500mgΠL Carb 的无菌水洗净 ,一部分进行组织化学染色 ,一部分转入继代培养基 ,每 2 周继代培养 1
次 ,并统计存活率。存活率是指经 2 次继代培养后存活的愈伤数与农杆菌侵染的愈伤组织数之比。组
织化学染色按 Rueb[15 ]的方法。
图 1 　辐照对愈伤组织 GUS瞬间表达率的影响
Fig. 1 　The effects of gamma irradiation on GUS
transient expression rate of calli
114 　辐照处理
取生长大小一致、继代培养 2 周的愈伤组织 ,于浙江大学辐照中心按剂量率 1GyΠmin 进行如下 2 种
方式辐照 :以 1、2、4、8 和 16Gy 等剂量的60 Coγ射线辐照 ,以未辐照为对照 ,辐照后直接用于农杆菌感染
转化 ;以 2Gy 剂量的60 Coγ射线处理 ,辐照后转移至继代培养基 ,分别培养 0、12、24、36、48 和 60h ,尔后进
行农杆菌的感染转化。
2 　结果与分析
211 　辐照对愈伤组织及其转化的影响
21111 　辐照对 GUS 瞬间表达率的影响 　辐照对
GUS瞬间表达率的影响见图 1。不同辐照剂量显著
影响 GUS 瞬间表达率 ,表现在经 1～4Gy 辐照时 ,
GUS瞬间表达率均高于对照的 7211 % ,随剂量的增
加逐渐升高 ,其中 4Gy 辐照后瞬间表达率达 100 % ;
在 8～16Gy 辐照时 ,GUS 瞬间表达率逐渐降低。GUS
组织化学染色观察表明 ,经 1～4Gy 辐照后 GUS 染色
逐渐加深 ,高于 4Gy 辐照染色逐渐变浅。
21112 　辐照对愈伤组织存活率的影响 　虽然 GUS
瞬间表达率和染色情况以 4Gy 最为理想 ,但该处理
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的愈伤组织存活率却低于 2Gy 的处理 (图 2) 。以 1～2Gy 低剂量辐照 ,可显著促进愈伤组织的生长 ,高
于 2Gy 辐照则抑制生长 ,并且易导致愈伤组织的褐化。
212 　辐照后继代培养时间对愈伤组织转化的影响
辐照后不同继代培养时间也显著影响转化 (图 3) 。辐照后培养 36h ,GUS 染色率最高 ,达 92 % ,尔后
迅速下降 ,从一侧面说明辐照引起的 DNA 损伤与修复程度影响转化频率。
图 2 　辐照对愈伤组织存活率的影响
Fig. 2 　The effects of gamma irradiation on
survival rate of calli
图 3 　辐照后继代培养时间 GUS瞬间表达率的影响
Fig. 3 　The effects of reculture duration after
irradiationon GUS transient expression rate of calli
3 　讨论
农杆菌介导的遗传转化成功与否的关键性因素在于转化受体与农杆菌的互作状态。以往的研究
中 ,对农杆菌的活性、浓度与感染时间的研究较多[3～5 ] ,采用机械致伤、超声波致伤和酶解致伤等辅助手
段导致外植体细胞的损伤以提高转化频率也有较多的研究[5～9 ] 。辐射会引起生物体 DNA、生物化学和
细胞学等不同水平的损伤 ,但研究也表明低剂量的电离辐射具有刺激效应 ,如破除种子休眠、提高发芽
力、刺激细胞的生长发育、加速成熟、增强抗性等[16 ] 。低剂量辐照刺激愈伤组织的生长和分化已有不少
的报道[17～19 ] 。本试验结果与此相类似 ,即剂量的高低显著影响转化 ,其中低剂量有利于转化。有关低
剂量辐照提高转化的刺激效应的原因 ,从表型看表现为愈伤组织增殖加快 ,生理生化上是细胞活跃地进
行分裂分化 ,而分子水平上则是细胞内 DNA 快速的自我复制 ,这显然 T2DNA 的随机插入提供了更为有
利的条件。辐照后不同继代培养时间与DNA 的损伤和修复相关 ,旺盛的损伤修复期有利于 T2DNA 的插
入而影响转化效率 ;过高的辐照剂量则会造成细胞过度的伤害甚至细胞死亡 ,从而不利于遗传转化并导
致愈伤组织存活率的降低。
以辐照作为农杆菌介导法遗传转化的辅助措施 ,我们相继获得了草坪草抗虫、抗除草剂和耐逆的转
基因植株。
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