全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062465204
冷诱导基因转录因子 CBF1 的组成型表达对植
物的抗寒性及生长发育的影响
韦善君1 　孙振元2 　巨关升2 　韩　蕾2 　余龙江1
(11 华中科技大学生命科学与技术学院 , 湖北 武汉　430074 ;
21 中国林业科学研究院林业研究所/ 国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘 　要 :通过农杆菌介导法将玉米泛素启动子 ( Pubi) 调控的 CBF1 基因以及 CaMV35 启动子调
控的 GUS 基因一起转化烟草 ,研究了冷诱导基因的转录因子 CBF1 (CRTΠDRE binding factor 1)
对植物抗寒性及生长发育的影响。结果表明 :CBF1 的组成型表达增强了冷敏感植物的抗寒
性 ;在表型上使植株矮壮 ,叶片着生密集 ,叶色深绿 ,叶厚度增加 ;促进侧枝生长 ,延长营养生长
期 ,推迟花期 ;对植株的结实性无明显影响。植株抗寒能力以及表型变化程度与 CBF1 的表达
强度相关。因此 ,利用 CBF1 基因进行植物遗传改良时应根据物种的应用特点采用合适的表
达调控策略。
关键词 :CBF1 ; 转基因烟草 ; 抗寒性 ; 生长发育
EFFECT OF CONSTITUTED EXPRESSION OF CBF1 TRANSCRIPTIONAL FACTOR
ON PLANT COLD TOLERANCE, GROWTH AND DEVELOPMENT
WEI Shan2jun1 　SUN Zhen2yuan2 　JU Guan2sheng2 　HAN Lei2 　YU Long2jiang1
(1. Department of Life Science , Huazhong University of Science & Technology , Wuhan , Hubei , 430074 ;
2. Research Institute of Forestry , Chinese Academy of Forestry/ Key Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing , 100094)
Abstract :The effects of CBF1 on cold tolerance ,growth and development of low2temperature sensitive plant were
investigated by delivering Arabidopsis CBF1 gene ( cbf1) concatenated with GUS gene (udiA) into tobacco. The
expression levels of exotic genes in transformed plant were shown by the GUS activity. The results showed that the
overexpression of CBF1 could obviously improve cold tolerance of plant . Compared with non2transformed control
plants , the transformed plants had a shorter and stronger stem , more leaves that were bottle2green and thicker , and
a longer growth period. CBF1 overexpression also promoted the growth of axillary shoots , but had little effect on the
fecundity of plants. The degree of the effects depended on the expression level CBF1. Proper regulation strategy for
gene expression should be concerned when using CBF1 to modified plants.
Key words :CBF1 ;transgenic ; tobacco ; cold tolerance ; growth and development
收稿日期 :2005207211
基金项目 :国家“863”计划“优质抗逆草坪早熟禾等新品种选育 (2002AA244061)”
作者简介 :韦善君(1975 - ) ,女 ,广西环江人 ,在读博士生 ,从事植物抗逆机理及转基因研究。孙振元为通讯作者 ,Email :sunzy @caf . ac. cn
温度是决定植物地域分布的主要限制因子 ,是在栽培条件下影响着农作物及园艺作物等的产量和
品质的主要因素。植物的抗寒机理以及提高植物抗寒性一直是农业科学研究上的一个重要课题[1 ] 。在
拟南芥中发现的以 CRTΠDRE和 CBFΠDREB1 为主要元件介导的低温和脱水响应信息途径 ,为植物的抗
寒性研究提供了新的思路[2 ,3 ] 。拟南芥编码的冷响应转录激活因子家族 CBF ,包括 CBF1、CBF2、CBF3 和
CBF4 ,含有 AP2ΠEREBP DNA 结合域 (DNA2binding domain) 。CBF123 能识别 COR 基因中的 CRTΠDRE元件
564　核 农 学 报　2005 ,19 (6) :465～468Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
并与之结合 ,诱导 COR 基因的表达 ,CBF4 则与脱水响应相关。在低温环境下拟南芥中的 cbf1 转录水平
能在 15min 内迅速提高 ,2h 后含有 CRTΠDRE 元件的一组 COR 基因得以表达[4 ] 。组成型表达 CBF 因子
的转基因拟南芥或油菜植株 ,可以在非低温诱导下表达 COR 基因 ,使抗冻性增强[5～9 ] 。然而 ,CBF 转录
激活子作为一类调节因子 ,其组成型表达对植物的生长发育的影响值得研究。已有研究表明 ,过量表达
CBF3 的拟南芥植株表型矮化[6 ] ,叶片明显平卧 ,花期推迟[8 ] 。转录因子 CBF1 的过量表达对植株表型的
影响尚没有深入报道。本研究构建了玉米泛素 ( Pubi) 启动子调控下的 cbf1 并将其导入烟草 ,研究烟草
植株抗寒性及生长发育的变化。
1 　材料与方法
111 　供试材料
供试烟草 ( Nicotiana tobacum)为“新华 1 号”的试管苗 ,由中国林业科学院生物技术室提供。取带有
腋芽的烟草茎段接种到生根培养基上 (MS + NAA 0102 mgΠL + IBA 0102 mgΠL , pH518) ,于 24 ℃～26 ℃、
2500～2600 Lx 光照条件 (下同)下培养 25d 备用。烟草分化培养基为 :MS + NAA 0105mgΠL + 62BA 015mgΠ
L , pH518。
试验用农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens)菌株为 Gv3101。携带目的基因的双元质粒载体为 p3301C。
在 p3301C 的 T2DNA 区内含有玉米泛素启动子 ( Pubi) 调控的源于拟南芥的冷诱导因子基因 cbf1 ,
CaMV35s 启动子 (PCaMV35s)调控的草丁膦抗性基因 ( bar) ,以及 PCaMV35s 调控的含有内含子的 GUS 基
因 ( udiA) (图 1) 。
图 1 　p3301Cbf1 T2DNA 区结构
Fig. 1 　T2DNA region of p3301Cbf1
112 　烟草转化和转基因植株鉴定
对烟草的转化方法采用叶盘法[10 ] 。共培养后的叶盘 ,转接于添加有 500mgΠL 头孢霉素和 210mgΠL
草丁膦的分化培养基上诱导植株再生 ,每 10d 换一次培养基。60d 后切下再生植株 ,转接到含有 500mgΠ
L 头孢霉素和 210mgΠL 草丁膦的生根培养基上。生根的植株移栽到培养基质中 ,于 20 ℃～25 ℃的温室
内管理。根据 cbf1、bar 序列分别设计引物用于 PCR 检测。对于 PCR 阳性植株 ,取叶、茎杆及须根 ,切成
2～4mm 片段 ,用 x2gluc 进行染色[11 ] ,检测外源基因表达状况。
113 　转基因烟草抗寒力测定
播种转化植株种子及对照株系种子 ,温室管理。播种 60d 后 ,在转化植株后代幼苗顶端第 2 片叶上
点滴 115 %的草丁膦除草剂溶液 10～15μl ,筛选得到转基因植株 T1 代幼苗。以 T1 代 6 叶期幼苗为材
料 ,转入植物生长箱内 ,先于光照 3000～3500lx (12hΠd) 、25 ℃Π20 ℃(光Π暗) 条件下适应 2d ,然后直接降温
到 4 ℃Π0 ℃(光Π暗)进行低温处理 ,48h 后将植株转移到温室内恢复生长 ,3d 后观察受伤叶片数及受伤程
度。参考 Virgine B 等[12 ]的方法 ,将植株耐寒能力分为 4 级。即叶片未受伤为 4 级 ;第 2～3 叶缘褪绿为
3 级 ;第 2、3 叶缘褪绿且有明显黄斑 ,第 4 叶缘有轻微伤害为 2 级 ;第 2 叶整叶黄绿色 ,3～4 叶缘褪绿斑
明显 ,第 5 叶有轻微伤害为 1 级。
114 　组成型表达 CBF1 植株的形态特征及生长发育特征观察
664 核　农　学　报 19 卷
以转化植株 T1 代为材料 (筛选方法同 112) ,记录转基因植株的生长和发育状况。在 10 叶期取成熟
叶片中部主脉两侧约 015～1cm 部分制作徒手切片 ,用以测量叶片厚度。在营养生长末期测量基茎粗。
在末花期计数叶片总数并测量株高。
2 　结果与分析
211 　转化植株鉴定及外源基因表达检测
转化结果共得到 34 棵抗性植株。移栽至温室后 ,用 115 %的草丁膦除草剂溶液点滴至移栽苗叶片
上 ,5d 后观察到 TC8、TC9、TC24 和 TC35 共 4 棵植株叶片上没有任何枯斑 ,而其它植株在点滴除草剂的
叶上均出现明显的黄斑。用 cbf1 和 bar 引物分别进行 PCR 检测 ,结果均扩增出大约 600bp 和 425bp 的
特异带 ,与阳性对照结果一致 ,而阴性对照中均没有特异带 ,说明外源基因已整合到基因组内。用 x2
gluc 溶液检测转化植株根、茎、叶 GUS 活性 ,结果表明 ,CK株系组织中没有外源基因活性 ,TC8 株系中外
源基因在根、茎、叶内均高效表达 ,TC9 株系中外源基因仅在叶脉和主基的维管束内轻度表达 ,在根内几
乎没有表达 (图 2) ,而 TC24、TC35 均未检测到 GUS 活性。因此 ,选取 TC8、TC9 株系用于以后的实验。
图 2 　转化烟草植株根、茎、叶中 GUS活性鉴定
Fig. 2 　GUS detection in the leaves , stems and roots of transgenic tobacco plants
CK、TC9、TC8 分别指对照、转基因 TC9 株系和 TC8 株系。每个株系图片从左到右分别为叶片、茎、根的切段。箭头所示为轻度表达。
CK,TC9 ,TC8 means non2transgenic control plant , transgenic plant TC9 and TC8 , respectively. In each photo from left to right
was fragments of leaf , stem , and root consequently. The arrow shows slightly expressed in vascular bundle
212 　组成型表达 CBF1 植株的抗寒性测定
表 1 　组成型表达 CBF1 烟草植株的抗寒性
Table 1 　Cold tolerance of tobacco plants
over2expressing CBF1
株系
line
总数 (株)
total
抗寒能力等级
cold tolerance grade
4 3 2 1
CK 15 0 3 9 3
TC9 15 2 7 6 0
TC8 15 12 3 0 0
未经低温预处理的 6 叶期植株 ,在 4 ℃Π0 ℃(光
照Π黑暗) 温度条件下 4h 后叶片均萎蔫。经 48h 低
温处理的植株 ,在温室内均可以恢复生长。3d 后对
照株系第 2～5 叶以及 TC9 株系部分植株的第 2～3
叶上均可见到不同程度的低温伤害 ,表现为出现黄
斑或褪绿斑块 ,而 TC8 株系的叶片基本没受到伤害
(表 1) 。说明 CBF1 的超量表达明显增强烟草的低
温抗性 ,CBF1 的表达量与抗性强度相关。
213 　组成型表达 CBF1 植株的生长和发育特性
在同样的栽培管理条件下 ,转基因植株与对照植株的生长发育有明显差异 (表 2 ,图 3) 。
表 2 　组成型表达 CBF1 对烟草植株的生长发育的影响
Table 2 　The effect of CBF12overexpression on the growth and development of tobacco plants
株系 line CK TC9 TC8
叶色 color of leaf 绿色 green 深绿色 dark green 墨绿色 deep dark green
叶表面特征 character of leaf surface 平整 explanate 较平整 unevent slightly 不平整 ,有皱缩 crimple
叶厚度 thickness of leaf (μm) 34515 ±3811 395110 ±2614 48516 ±5014
营养生长期 vegetative stage (d) 8517 ±417 9014 ±412 11414 ±713
基茎粗 diameter of stem(mm) 5166 ±0138 6143 ±0120 8193 ±0120
腋芽 axillary 未长出 no growth 略长出 ,可见 visible growth 长出 ,有 2～3 片叶 growth , 2～3 leaves
株高 height (cm) 8316 ±218 7019 ±413 4019 ±312
总叶片数 total number of Leaf 12 13 16
764　6 期 冷诱导基因转录因子 CBF1 的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响
CBF1 表达水平较高的 TC8 株系明显矮化 ,叶片着生比较紧密 ,挺立 ,叶色深绿 (图 3 版 Ⅲ- A ,见封
三) ,叶表面不平整 ,成熟后皱缩明显 (图版 Ⅲ- B) ,成熟叶片平均厚度明显厚于对照株系 ;主茎较粗 ,有
腋芽长出 ,有的腋芽有 2～3 展开叶 (图版 Ⅲ- B) 。在整个生长期内 ,TC8 株系叶片总数为 14～16 片 ,比
对照株系多 2～4 片。植株生长周期 TC8 株系为 150～160d , 较对照株系多 30～50d。当植株主茎顶端
出现花芽时标志着营养生长结束。根据本试验观察 ,TC8 株系的营养生长期较对照植株延长约 30d。当
对照株系开花时 ,TC8 株系主茎顶点尚未形成花芽 (图版 Ⅲ- B) ,而当对照株系种子成熟、叶片枯黄时 ,
TC8 株系花期尚未结束 (图版 Ⅲ- C) 。TC8、TC9 株系开花的数量及果实大小与对照株系无明显差异。
CBF1 表达量低的 TC9 株系的表型变化与 TC8 的相似 ,但是变化幅度较小 ,其表型特征更接近于对照 (表
2) 。说明 CBF1 的组织型表达促进植株的横向生长 ,延长营养生长 ,对植株结实性无明显影响。
3 　讨论
目前已证实在拟南芥、油菜 ( Brassica napus)中存在 CBF 冷应答信息途径。在大麦、小麦和黑麦等能
进行冷驯化的植物以及番茄、玉米、水稻等不能进行冷驯化的植物中也存在编码 CBF 类似蛋白的基
因[9 ] 。因此 ,利用源于拟南芥或其它植物的 CBFΠDREB1 基因来增强作物的对低温的抗性有较好的发展
前景。CBF 家族中的 CBF1、CBF3 的组成型表达提高拟南芥的抗寒性已被众多试验所证实[3 ,5 ,8 ] 。本实
验结果证实 ,过量表达 CBF1 可以提高冷敏感植物烟草对低温的耐性 ,然而 ,CBFΠDREB1 作为一类基因
转录的调控元件 ,其组成型表达在生理上增强了植株抗逆性的同时 ,对植株表型和生长发育也产生一定
的影响 ,表现为植株矮化 ,叶片着生紧密 ,叶厚度增加 ,叶色深绿 ,生长期延长。这些影响效果与 CBF3
的相似[6 ,8 ] 。然而 Jaglon2Ottosen 等研究认为 CBF1 的组成型表达对拟南芥植株表型没有显著影响[5 ] 。
Gilmour 等报道 CBF3 的组成型表达影响拟南芥的结实性[8 ] ,而本试验结果表明 CBF1 的组成型表达对烟
草的结实性没有明显影响。说明 CBF1 和 CBF3 调控表达的基因可能有一定差异 ,同一个 CBF 转录激活
子对可以进行冷驯化的植物 (拟南芥)和对不能进行冷驯化的植物 (烟草)的影响效果也不尽相同。
由于 CBF1 的组成型过量表达会产生一些对农业生产具有潜在的负面效应的农艺性状 ,因此 ,在转
基因育种研究中应根据植物的使用特点采取适宜的调控表达策略 ,以获得预期的效应。对于一些防风
护坡的地被植物、草坪草等主要应用价值为营养器官的植物 ,可以考虑用组成型启动子调控 CBF1 的表
达。因为 CBF1 的组成型表达增强植株耐寒性的同时 ,还可以延长植株的营养生长 ,促进植株的横向生
长 ,使植株更加矮壮 ,这些特性在草坪草应用上可以减少修剪费用。对于应用价值为果实、种子植物的
转基因抗寒育种研究中 ,建议采用胁迫诱导型启动子以驱动 CBF1 的表达 ,以在获得增强植物抗寒性的
同时又避开 CBF1 调节子潜在的负面效应。
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(下转第 455 页)
864 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (6) :465～468
完全展开叶为测定对象。
光饱和点和光补偿点是植物的两个重要的光合生理指标。植物的光饱和点和光补偿点反映了植物
光照条件的要求 ,是判断植物耐阴性的一个重要指标。一般认为 ,光补偿点和饱和点均较低的植物是典
型的耐荫植物 ,而光补偿点低而光饱和点高的植物对环境适应性很强 [5 ] 。狼尾草的光饱和点在
1200μmolm - 2 s - 1左右 ,光补偿点在 25μmolm - 2 s - 1左右 ,表观量子效率为 010558 ,与耐阴性的 C4 型阳性植
物地毯草的表观量子效率 (010592) 基本相同[7 ] 。较低的光补偿点、较高的光饱和点和较大的表观量子
效率 ,表明狼尾草是一种较耐荫的阳性植物。因此 ,在园林配置时 ,可以配置在一些较荫湿的地带作为
绿化和保护之用 ,并注意适当密植 ,可生长迅速 ,提高观赏效果。
狼尾草的 CO2 补偿点为 5μmolmol - 1 ,CO2 饱和点为 600μmolmol - 1左右 ,比普通的 C3 植物胡杨 (补偿
点和饱和点分别高达 150μmol mol - 1 和 900μmol mol - 1 ) 低的多 ,与典型的 C4 植物地毯草的补偿点
(0197μmol mol - 1 ) [6 ]相似 ;狼尾草羧化效率特别大 ,CE = 012349 ,也接近于 C4 植物地毯草的羧化效率 (CE
= 012539) [7 ] ,约为 C3 植物鹅掌楸 (0102) 的 12 倍[7 ] 。狼尾草表现出典型的 C4 植物的特征 ,对低浓度
CO2 有极强的同化能力。因此 ,在园林布置时 ,可以增大栽植密度 ,有利于狼尾草的快速生长 ,以及时达
到景观设计的效果 ,提高观赏价值。
狼尾草的净光合速率 13 :00 时达到 2118μmolCO2 m - 2 s - 1 ,为全天的最大值 ,没有“午休”现象 ,为典型
的“单峰型”曲线 ;气孔导度在日变化呈“单峰型”曲线 ,9 :00 达到最大值 ,到 15 :00 一直保持较高的水平 ,
但逐步降低 ,与净光合速率的趋势不同。两者之间的相关性不明显 ,这与其他一些研究者对一些植物的
研究结果不一致。可能是因为狼尾草的光合表现为典型的 C4 植物特性 ,气孔导度达到一定程度后 ,对
净光合速率就不再有明显的影响。温达志等人对杂交狼尾草做了初步的研究 ,研究结果是 :净光合速率
日进程在 10 :00 前最大 ,可达 3614μmol CO2 m - 2 s - 1 ,有明显的“午休”现象 ,随后下降 ,在 12 :00 和 14 :00
分别出现两个微弱的 Pn 峰 ,呈“双曲线型”;气孔导度日变化呈“双曲线型”。同为狼尾草属的植物却存
在一定的差异 ,其原因可能是 : (a)植物本身生理特性的不同 (b) 生长的环境条件的不同 (c) 测定季节的
不同。但真正的原因尚需要做进一步研究。
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