全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032249204
外源 lea3 基因转化紫花苜蓿的研究
王　瑛1 ,2 　朱宝成2 ,3 　孙　毅2 　张琳宇2 　罗建平1
(11 合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009 ;21 河北大学生命科学学院 ,河北 保定　071002 ;
31 河北农业大学生命科学学院 ,河北 保定　071001)
摘 　要 :将来源于大麦的 lea3 基因通过基因枪法导入紫花苜蓿栽培品种“中苜一号”的胚性愈伤组织中 ,
经过膦丝菌素类除草剂 (PPT)的 4 次筛选获得抗性愈伤组织 ,诱导分化后共获得 21 株抗性再生植株。
经叶片涂抹除草剂试验和 lea3 基因的 PCR 分子检测证明 , lea3 基因已整合到紫花苜蓿的基因组中。与
对照植株相比 ,获得的转基因植株具有显著增强的耐盐能力 ,表明遗传转化 lea3 基因可用于苜蓿抗旱
耐盐新品种的选育。
关键词 :紫花苜蓿 ;胚性愈伤组织 ; lea3 基因 ;转化
TRANSFORMATION OF BARELY lea3 GENE INTO ALFALFA ( Medicago sativa L. )
WANG Ying1 ,2 　ZHU Bao2cheng2 ,3 　SUN Yi2 　ZHANGLin2yu2 　LUO Jian2ping1
(11School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei University of Technology , Hefei , Anhui 　230009 ;
21 College of Life Sciences , Hebei University , Baoding , Hebei , 　071002 ;
31 Collenge of Life Sciences , Hebei Agriculture University , Baoding , Hebei 　071001)
Abstract :This paper reported the transformation of a late embryogenesis abundant protein gene , lea3 , from barely ( Hordeum
vulgare L. ) into Medicago sativa L. Embryogenic callus from Medicago sativa L. cultivar“ZhongMu No. 1”was transformed
by particle bombardment with plasmid pBY520 containing lea3 gene. After 4 repeated PPT selecting cultures , resistant calli
and 21 regenerated plants were obtained. PPT resistance tests and PCR amplification analysis showed that 2 putative transgenic
plants carried the lea3 gene. Compared with control plants , transgenic plants had an enhanced salt2tolerance , suggesting that
transformation of lea3 gene could be used to select elite alfalfa cultivars with enhanced tolerance to drought and salt stress.
Key words :Alfalfa ( Medicago sativa L. ) ; embryogenic calli ; lea3 gene ; transformation
收稿日期 :2006207225
基金项目 :河北大学自然科学基金预研项目 (2003009)
作者简介 :王瑛 (19712) ,女 ,河北保定人 ,讲师 ,合肥工业大学在读博士 ,从事植物细胞工程研究。
通讯作者 :罗建平 (19662) ,男 ,安徽肥东人 ,教授 ,博士 ,从事植物生物技术研究 ,E2mail : jianpingluo @sohu. com　　紫花苜蓿 ( Medicago sativa L. ) 是世界上栽培面积最广、应用最广泛的多年生豆科牧草 ,适口性强、营养丰富 ,素有“牧草之王”的美称。然而 ,因盐渍化和干旱 ,草场不断退化 ,限制了它的推广与应用。选育抗旱耐盐新品种 ,对扩大苜蓿种植面积、恢复草场和进一步开发利用盐碱地都有重要意义。多年来 ,常规育种技术在紫花苜蓿品种改良中发挥了重要作用 ,但存在周期长、效率低、预见性差等缺点[1 ] 。近年来 ,转基因技术已成为改良苜蓿品质的一条新途径 ,将外源 SOD 基因[2～5 ] 、杜氏盐藻 Dscbr 基因[1 ]转入苜蓿提高其抗旱抗 氧化胁迫能力 ,以及将外源苹果酸脱氢酶 neMDH 基因[6 ]转入苜蓿增强其耐土壤酸性和铝毒害能力都获得较好的结果。胚胎发育晚期丰富 ( late embryogenesis abundant ,LEA)蛋白质是目前植物逆境生物学研究中受到高度关注的抗胁迫功能蛋白质 ,具有很高的亲水性和热稳定性[7 ] 。LEA 蛋白质可分为 5 类 ,以第 3 类 (LEA3) 的研究较深入。LEA 蛋白质的合成受种子成熟信号、干旱和盐胁迫以及 ABA 信号的诱导 , lea 基因的表达量与植物抗旱耐盐能力呈正相关[8 ] 。转 lea3 基因的水
942　核 农 学 报　2007 ,21 (3) :249～252Journal of Nuclear Agricultural Sciences
稻[9 ] 、小麦[10 ]和草莓[11 ]所展示出的显著增强的耐脱水
耐盐能力 ,表明 lea3 基因在遗传操作改良作物抗旱耐
盐碱能力上具有广阔的前景。目前尚未见 lea3 基因
转化紫花苜蓿的报道。
本研究利用基因枪法将来源于大麦 ( Hordeum
vulgare L. ) 的 lea3 基因导入紫花苜蓿栽培品种“中苜
一号”细胞中 ,获得转基因植株 ,以期提高其抗旱耐盐
碱能力 ,为苜蓿抗旱耐盐碱新品种的培育提供新的种
质资源。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　植物材料 　以来源于紫花苜蓿 ( Medicago sativa
L. )栽培品种“中苜一号”种子的胚性愈伤组织为受体
材料。胚性愈伤组织的诱导、继代培养条件参照肖荷
霞等[12 ]方法。
11112 　质粒载体 　携带有 lea3 基因和 bar 基因 (膦丝
菌素乙酰转移酶基因) 的质粒 pBY520 由美国 Cornell
大学 Ray Wu 教授馈赠。lea3 为目的基因 ,以水稻 act1
为启动子 ,马铃薯 pin2 为终止子。bar 为筛选基因 ,由
CaMV 35S 和 nos 调控 (图 1) 。bar 基因具有膦丝菌素
类除草剂 (PPT) 的抗性 ,本试验以 PPT 为筛选剂对表
达 bar 基因的愈伤组织与再生植株进行筛选。
图 1 　pBY520 质粒酶切图谱
Fig. 1 　Restrictive digestion map of plasmid pBY520
112 　方法
11211 　胚性愈伤组织的基因枪转化
取生长发育状态良好的胚性愈伤组织 ,在附加甘
露醇 014 molΠL 的继代培养基上高渗处理 5 h 后 ,用
PDS21000ΠHe 型基因枪 (Bio2Rad 公司生产) 进行轰击。
质粒 DNA 的提取和纯化用碱裂解法[13 ] ,制备钨粉Π载
体 DNA 子弹参照 Daniell 方法[14 ] 。基因枪转化参数
是 :真空度 25 inches ,Hg ,轰击距离 9cm ,钨粉颗粒直径
110μm ,氦气压力 1100 psi。轰击后的愈伤组织维持高
渗条件 16h ,然后转到继代培养基上恢复培养 10d。
11212 　转化体的筛选和植株再生
为确定选择剂 PPT 的浓度 ,将未经基因枪轰击的
愈伤组织分别接种于含 0、5、10、15、20、25mgΠL PPT 的
继代培养基上培养 30d ,当 PPT的浓度达到 10 mgΠL 时
愈伤组织全部褐化死亡 ,而 5mgΠL PPT 培养基上有一
半以上的愈伤组织存活。以 1mgΠL 为梯度在 5～10
mgΠL 间进行浓度筛选 ,在浓度为 8 mgΠL 时 PPT培养基
上的愈伤组织有一半以上褐化死亡 ,因此确定此浓度
用于抗性愈伤组织的筛选。
将恢复培养 10 d 的愈伤组织在筛选培养基 (MS
+ 2 ,42D 210mgΠL + 62BA 015mgΠL + 8 mgΠL PPT) 上
进行转化体筛选 ,每 30 d 将生长状态良好的愈伤组织
转移 1 次 ,选择 4 次后 ,将抗性愈伤组织转到无激素的
筛选培养基 (MS + 8 mgΠL PPT) 上诱导植株再生。待
分化出的绿色芽点长成小苗后 ,将其转入含 8 mgΠL
PPT的无激素 1Π2 MS 培养基诱导生根。筛选和分化时
每日 26 ℃、16 h 光照。待再生植株根系发达时 ,经过
炼苗 ,移栽到蛭石和营养土 1 :1 的花盆中室温下生长。
11213 　转基因植株叶片涂抹除草剂试验
分别配制 500～5000 mgΠL 不同浓度的 PPT (含
011 % Tween80)溶液涂抹对照植株幼嫩叶片 ,1 周后观
察叶片受害程度 ,发现 2200 mgΠL PPT溶液可使涂抹的
对照植株叶片枯黄死亡。用该浓度涂抹转基因再生植
株的幼嫩叶片 ,1 周后观察叶片受害程度。
11214 　转基因植株 PCR 检测
对照及转基因植株叶片总 DNA 的提取采用
CTAB[15 ]法。根据 lea3 的基因序列设计 PCR 引物 :引
物 1 : 52CATCAGGCAATCACAGAGC23 ; 引 物 2 : 52
CACGAGCCACAACGACAC23 ,扩增片段长度为 750 bp。
扩增时对照植株叶片总 DNA 作阴性对照 ,质粒 DNA
作阳性对照。扩增条件为 : 94 ℃预变性 4min ,然后
94 ℃变性 40 s ,53 ℃退火 40 s ,72 ℃延伸 90s ,共 36 个循
环后 ,72 ℃延伸 10min。反应结束后取 5μl 反应液进行
110 %的琼脂糖凝胶电泳 ,观察结果并照相。
11215 　转基因植株的耐盐性分析
按 Winicov 法[16 ] 采用含有 012 %、014 %、016 %、
018 %、110 % NaCl 的 1Π4 Hoagland’s 培养液每天早上
浇灌对照植株 ,当 NaCl 浓度为 018 %浇灌 8d 时 ,对照
植株死亡率约为 90 % ,因此 ,试验选择该浓度评价转
化植株的耐盐胁迫能力 ,每隔 1d 观察对照及转基因植
株的生长情况并统计存活率。每次处理随机从每个转
基因株系中选取 10 株植株 ,重复 3 次。
2 　结果与分析
211 　转化体的筛选及转化植株的再生
基因枪轰击后的苜蓿胚性愈伤组织 ,于继代培养
基上恢复培养 10d ,再转入含 8mgΠL PPT的继代培养基
052 核　农　学　报 21 卷
上进行筛选 ,15d 后即可看到大部分愈伤组织逐渐停
止生长并开始褐化死亡 ,具有抗性的愈伤组织继续生
长 ,愈伤组织表面色泽鲜亮。经 4 次选择后 ,从 236 块
被轰击的愈伤组织块中获得 98 块抗性愈伤组织。抗
性愈伤组织逐步形成较大的组织块。将抗性愈伤组织
转到无激素的MS 培养基上 ,约 15d 后出现绿色芽点 ,5
～6 周后即形成 2～3 cm 高的再生苗 ,然后转到无激素
1Π2 MS 培养基 ,苗继续生长 ,根开始分化。待抗性植株
长至 10 cm 左右时 (图 22A) ,移至花盆于温室中生长
(图 22B) 。在研究中经过筛选和分化诱导共获得 21 株
再生植株。以获得的再生植株茎段为外植体诱导植株
再生 ,从而建立起 21 个转化植株系。
图 2 　紫花苜蓿转 lea3 基因植株
A :具发达根系的再生植株 ;B :生长健壮的转基因植株
Fig. 2 　Plant of transgenic alfalfa
A :Regenerated plant with strong roots ;B :Healthy plant
212 　转化植株对除草剂 PPT的抗性检测
2200 mgΠL PPT溶液涂抹叶片后观察发现 ,未经转
化的对照植株叶片顶部开始卷曲并变黄 ,最后死亡 (图
32A) ;而 21 个转化植株中 ,有 19 个株系植株表现不具
除草剂抗性 ,另外 2 个株系 ( T214 和 T215) 则表现出良
好的抗性 ,叶片仍呈现绿色 (图 32B) ,说明 bar 基因已
导入苜蓿基因组并表达。
图 3 　对照植株 (A)和转化植株 (B)对 Basta 的抗性
Fig. 3 　Resistance to Basta of wild type plant (A)
and transgenic plant (B)
213 　转化植株的 PCR 检测
对 21 株转化植株进行 PCR 扩增鉴定 ,具有除草
剂抗性的 T214 和 T215 植株表现为阳性 ,不具除草剂抗
性的 19 个株系没有 lea3 的特异带 (图 4) ,说明以除草
剂 PPT为选择压力能有效筛选目标转基因植株。本试
验中 PCR 阳性植株系占再生植株的 9152 %。
图 4 　紫花苜蓿转基因植株 lea3 基因 PCR 检测
Fig. 4 　PCR assay of lea3 gene in transgenic plants
+ :阳性对照 ; - :阴性对照 ;T - 14 和 T - 15 :转基因植株
+ :positive control ; - :negative control ;
T - 14 and T - 15 :transgenic plants
214 　转基因植株的耐盐能力分析
为评价 LEA3 蛋白在紫花苜蓿中抗旱耐盐的作
用 ,试验在室温条件下对转基因植株进行了抗盐性鉴
定。图 5 和图 6 比较了对照和转基因株系 T214、T215
的耐盐情况 ,在 018 % NaCl 条件下 ,对照植株在盐胁迫
处理 2d 后叶片发生萎蔫开始坏死 ,7d 后大部分植株
死亡 ,而转基因紫花苜蓿植株表现出明显的抗盐胁迫
优势 ,盐胁迫 7d 后仅有部分植株叶片萎蔫坏死 ,对盐
胁迫的抵抗能力约是同时间内对照植株的 4 倍。
图 5 　紫花苜蓿转基因植株的耐盐能力分析
Fig. 5 　Resistance to salt of transgenic plants
152　3 期 外源 lea3 基因转化紫花苜蓿的研究
图 6 　对照植株 (A)和转化植株 (B)对 018 % NaCl 的抗性
Fig. 6 　Resistance to 018 % NaCl of wild type
plant (A) and transgenic plant (B)
3 　讨论
目前的研究表明 ,LEA 蛋白的抗旱耐盐能力取决
于其特殊的氨基酸组成和由此形成的特殊的空间结
构。LEA 蛋白主要是由极性氨基酸组成 ,为高度亲水
的多肽分子 ,分子中的多羟基能保持细胞液处于溶解
状态 ,从而避免细胞结构的塌陷 ,稳定细胞膜结构[17 ] 。
LEA 蛋白通常含有多拷贝的 11 个氨基酸基序 ,可形成
由非周期性的无规线团和少量兼性 | →- 螺旋构成的
高级结构 ,两个螺旋分子通过螺旋的疏水面形成稳定
的蛋白质二聚体 ,在植物细胞脱水时形成一个具疏水
区的亲水表面有利于结合细胞内水分和过多的盐离
子 ,保持细胞水分 ,降低胞内渗透压 ,从而减轻脱水胁
迫对细胞结构的损伤 ,表现出抗旱耐盐能力[8 ] 。1996
年 ,Xu 等[9 ]将大麦的 lea3 基因转入水稻中 ,获得的转
基因植株对水分缺乏和盐胁迫的耐受性显著增加 ,直
接证明了 LEA 蛋白在植物干旱胁迫中起保护作用。
最近 ,来自酵母表达系统[18 ] 和转 lea3 基因水稻[19 ] 的
实验结果表明 ,LEA 蛋白在干旱胁迫时可能是通过保
护细胞膜免受损伤来提高细胞抗旱耐盐能力。
本研究利用基因枪法将 lea3 基因导入紫花苜蓿
栽培品种“中苜一号”细胞中。苜蓿遗传转化多采用农
杆菌介导法 ,但该法存在着一定的宿主局限性 ,转化优
良的商业苜蓿品系报道很少[2 ] 。而本试验采用的基因
枪法 ,可以从许多有经济价值的栽培品种中获得转基
因植株 ,为苜蓿新品种的培育提供新的种质资源。
本研究利用膦丝菌素类的除草剂 PPT作为转化体
的筛选剂。PPT 可以抑制谷氨酸合成酶的活性 ,导致
氨的积累 ,最终导致未转化细胞死亡。而 bar 基因编
码的膦丝菌素乙酰转移酶 ( PAT) ,可使膦丝菌素类的
除草剂失去活性[20 ] 。本试验所用质粒 pBY520 中 bar
基因同 lea3 基因连锁 ,由于 bar 基因对 PPT有抗性 ,因
此理论上可以 PPT 为选择剂筛选出转目的基因的植
株。本试验结果表明 ,在叶片 PPT 涂抹试验中只有 T2
14 和 T215 植株表现为阳性 ,并扩增出特异性条带 ,说
明在基因导入及整合过程中 , bar 基因同 lea3 基因是
紧密连锁的。
但本试验对筛选后获得的抗性再生植株进行 PPT
涂抹试验和 lea3 基因的特异 PCR 扩增时发现 ,经 4 次
PPT抗性筛选后 ,仍有相当多的转化植株呈阴性反应 ,
其主要原因可能由于基因枪轰击时采用的受体材料为
愈伤组织 ,细胞分散程度低 ,造成转化细胞筛选和分化
过程中 ,一些非转化细胞未直接接触到 PPT ,逃过“选
择关”,以致产生假阳性再生植株。
除水稻外 ,转 lea 基因的小麦[9 ] 和草莓[11 ] 都提高
了的抗旱耐盐能力。本研究获得转大麦 lea3 基因的
紫花苜蓿再生植株在高盐胁迫下具有较高的存活率 ,
耐盐能力约是野生型植株的 4 倍 ,同样表明遗传转化
lea3 基因可用于苜蓿抗旱耐盐新品种的选育。但有关
转基因植株后代能否保持抗性性状尚需进一步研究。
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