全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 062469204
蚕豆离体培养繁殖植株对高温及紫外线胁迫的反应
陆瑞菊1 ,2 　屈巧玲3 　王亦菲1 ,2 　孙月芳1 ,2 　胡润田3 　康诗腾3 　许凌波3 　黄剑华1 ,2
(11 上海市农业科学院生物技术研究所 ,上海　201106 ;21 上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海　201106 ;31 上海市文来中学 ,上海　201101)
摘 　要 :将蚕豆种子无菌苗 (对照)和离体繁殖 3 代无菌苗作为供试材料 ,观察它们在高温和紫外线胁迫
下的生长和根尖细胞有丝分裂的情况。试验结果表明 ,供试植株在高温和紫外线胁迫下在外观上表现
叶片枯黄、植株死亡 ,在染色体水平上发生了畸变 ,紫外线胁迫造成的畸变程度大于高温胁迫 ,3 代克隆
苗的畸变程度大于种子苗。
关键词 :蚕豆 ;快繁 ;高温和紫外线胁迫 ;染色体畸变
RESPONSE OF in vitro PROPAGATED PLANTLETS OF Vicia faba TO
HIGH TEMPERATURE AND ULTRAVIOLET STRESS
LU Rui2ju1 ,2 　QU Qiao2ling3 　WANG Yi2fei1 ,2 　SUN Yue2fang1 ,2 　HU Run2tian3
KANG Shi2teng3 　XU Ling2bo3 　HUANGJian2hua1 ,2
(11Biotech Research Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106 ;21Shanghai Key Lab. of Agricultural
Genetics and Breeding , Shanghai 　201106 ;31Shanghai Wenlai Middle School , Shanghai 　201101)
Abstract :Using propagated2plantlets from the 3rd generation of Vicia f aba as materials , the effects of heat and ultraviolet stress
on growth and the mitosis of root2tip cells of plantlets were studied. The results showed that the frequency of the plantlets with
yellow leaf and dead plantlets and chromosomal aberrations were increased by use of both stress compared with CK, the effects
of ultraviolet stress were stronger than that of heat stress. The frequency of chromosomal aberrations of plantlets from the 3rd
generation was higher than that of plantlets germinated from seeds.
Key words : Vicia f aba ; rapid propagation ; heat and ultraviolet stress ; chromosomal aberration
收稿日期 :2006202215
作者简介 :陆瑞菊 (19622) ,上海人 ,研究员 ,主要从事作物组织Π小孢子培养研究。Tel : 021 6220866023201 ; Email : cs7 @saas. sh. cn。黄剑华为通讯
作者 :Tel : 021 62201032 ; Email : sw1 @saas. sh. cn
　　快繁技术已在植物上得到广泛应用 ,研究离体培
养繁殖后代的遗传稳定性和对生长逆境的适应性 ,将
有助于对植物克隆后代的抗逆性及遗传稳定性评估 ,
无疑具有重要的学术意义和应用价值。蚕豆是一种敏
感植物 ,外界环境条件的变化对其生长极易造成明显
影响[1～3 ] 。由于蚕豆染色体大而数量少 ,细胞分生组
织增殖周期短 ,大部分时间是对诱变剂的敏感时期 ,易
产生微核及染色体畸变[4 , 5 ] ,因而是一种用于监测环
境污染及重金属污染的指示植物[6～8 ] 。本研究以蚕豆
离体培养繁殖群体为供试材料 ,着重研究了克隆后代
在个体和染色体水平上对逆境的反应。
1 　材料与方法
111 　无菌种子苗的获取
选择饱满、均匀的蚕豆种子 ,置 70 %的酒精中
1min ,再用饱和的漂白粉溶液浸泡 10min ,然后用无菌
水冲洗 5～6 次。放在铺有无菌纱布的瓷盘中 ,倒入添
加 5mgΠL GA3 的无菌水浸泡 12h ,待种子完全吸胀后 ,
用饱和的漂白粉溶液浸泡 10min ,再用无菌水冲洗 5～
6 次 ,接种到无激素的MS 培养基上。在 23 ℃±1 ℃、光
强 1800lx、日光照 12hΠ黑暗 12h 的光周期下培养。当
芽长出 2～3cm 时 ,进行逆境处理。
964　核 农 学 报　2006 ,20 (6) :469～472Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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112 　离体繁殖 3 代群体的构建
种子的消毒及发芽步骤同上。当芽长至 2～3cm
时 ,将芽切下转移至增殖培养基上 ,连续快繁 3 代。以
MS 培养基为基本培养基 ,发芽培养基中添加 30gΠL 蔗
糖、610gΠL 琼脂 ,pH 518 ;增殖培养基则在发芽培养基
的基础上添加 015mgΠL 6 - BA ( 6 - 苄氨基嘌呤 ) 、
0101mgΠL NAA (萘乙酸 ) 、015mgΠL MET (矮壮素 ) 、
800mgΠL CH(水解干酪素) 、015gΠL AC (活性炭) ;生根
培养基中则添加 110mgΠL NAA、015gΠL AC。121 ℃高温
高压灭菌。
113 　逆境设置
高温逆境在光照培养箱中进行 ,45 ℃ 1h 和 2h。
紫外线逆境在超净工作台上进行 ,培养瓶的盖子打开 ,
将苗暴露在 20W 的紫外灯下 ,高度 60cm ,照射时间设
1h 和 2h。逆境处理结束后 ,将无菌苗接种至无激素的
恢复培养基培养 ,21d 后统计植株的枯黄率和死亡率 ,
植株上有一片叶子发生枯黄即为枯黄植株。存活的植
株转移到生根培养基生根。
114 　根尖细胞染色体观察和畸变率统计
当根长至 115～210cm 时 ,上午 11 : 30 —12 : 30 剪
根 ,置于 011 %的秋水仙碱溶液中 13 ℃处理 2h ,然后用
卡诺氏固定液 (无水酒精 :冰醋酸 3 :1) 固定 24h。制片
前用 1molΠL 的盐酸于 60 ℃解离 20min ,醋酸洋红染色 ,
在 45 %的冰醋酸中压片 ,显微镜下观察计数。只统计
有丝分裂中期分裂相中出现染色体畸变 (染色体断片)
的细胞占中期分裂相的百分率。每个处理统计 10 株
植株 ,每 1 株至少统计 50 个染色体分裂相。
2 　结果
211 　蚕豆离体繁殖 3 代群体的长势
蚕豆种子发芽后 ,在增殖培养基上培养 ,30d 继代
1 次 ,繁殖系数为 2～3。快繁 3 代后 ,从表型看克隆苗
茎秆粗壮 ,叶色浓绿 ,长势良好 ,与种子苗没有差异。
(图 1) 。
212 　逆境处理对种子苗及离体繁殖苗的生长影响
无论是种子苗还是离体繁殖苗 ,高温 (45 ℃) 和紫
外线处理对植株的生长均有很大的影响 ,表现在叶片
枯黄、植株死亡。从表 1 可以看出 ,45 ℃处理 1h 时 ,种
子苗的死亡率和枯黄率分别为 510 %和 117 % ,而克隆
苗分别为 1510 %和 617 % ;紫外线照射处理 1h 时 ,种
子苗的死亡率和枯黄率分别为 1415 %和 1113 % ,而克
隆苗分别达 2910 %和 3213 % ;逆境处理时间的越长 ,
对植株生长的影响越大 ;但种子苗对逆境的忍耐力明
图 1 　克隆 3 代苗 (左)和种子苗 (右)
Fig. 1 　plantlets from 3rd generation of clone (left) and
seeds germination (right)
显好于克隆苗 ,在同等逆境条件下克隆苗的死亡率和
枯黄率是种子苗的 2～3 倍 ,而处理前克隆苗与种子苗
在表型上难于区别 (图 1) 。紫外线照射 1～2h 对植株
造成的伤害大于 45 ℃处理 ,当紫外线照射达 2h 时 ,克
隆苗的死亡率达 4311 % ,枯黄率达到 5117 %(图 2) 。
图 2 　克隆苗对逆境的反应
Fig. 2 　response of clonic plantlets to stress
左 :45 ℃2h ;右 :紫外线 2h
left : heat stress (45 ℃2h) ; right : ultraviolet stress(2h)
213 　逆境处理对种子苗及离体繁殖苗染色体畸变率
的影响
逆境处理能使蚕豆染色体出现断裂现象 ,表现在
有丝分裂中期分裂相中有很多断片产生。未经逆境处
理的对照中 ,种子苗的染色体畸变率为 310 % ,而克隆
苗为 716 % ,绝大部分分裂相正常 (图 3 - 1) ;45 ℃处理
1h ,种子苗和克隆苗的染色体畸变率分别为 919 %和
1919 % ,处理 2h ,为 1716 %和 2619 % ;紫外线照射 1h ,
种子苗和克隆苗的染色体畸变率分别为 1917 %和
2914 % ,照射 2h 为 2710 %和 4913 %。表明植株在遇到
逆境时不仅在外观上表现出叶片枯黄、植株死亡 ,更是
在染色体水平上发生了畸变 ,克隆苗的畸变程度远远
大于种子苗。另外 ,在镜检时发现 ,逆境处理的克隆苗
中 ,有四倍体现象发生 (图 3 - 2) ,且紫外线照射的多
074 核　农　学　报 20 卷
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　　　 表 1 　高温和紫外线胁迫对种子苗及克隆苗生长的影响
Table 1 　Effects of heat and ultraviolet stress on growth of plantlets from seed germination and clone
材料
material
处理
treatment
处理数
plantlets
死亡数
No. of dead
plantlets
死亡率
Freq. of dead
plantlets ( %)
枯黄植株数
No. of plantlets with
yellow leaves
枯黄率
Freq. of plantlets with
yellow leaves ( %)
种子苗
plantlets from
seeds germination
克隆苗
plantlets from 3rd
generation of clone
45 ℃1h 60 3 510 1 117
45 ℃2h 60 5 813 3 510
UV 1h 62 9 1415 7 1113
UV 2h 60 12 2010 15 2510
45 ℃1h 60 9 1510 4 617
45 ℃2h 60 13 2117 6 1010
UV 1h 62 18 2910 20 3213
UV 2h 58 25 4311 30 5117
表 2 　高温和紫外线胁迫对幼苗根尖细胞有丝分裂中期分裂相中染色体畸变的影响
Table 2 　Effects of heat and ultraviolet stress on chromosomal aberrations in the root2tip cell of plantlets
材料
material
处理
treatment
观察细胞数
cells
出现断片的细胞数
No1 of chromosomal aberrations 染色体畸变率 ( %)Freq1 of chromosomal aberrations
种子苗
plants from seeds
germination
克隆苗
plants from 3rd
generation of clone
对照 CK 501 15 310
45 ℃1h 503 50 919
45 ℃2h 510 90 1716
UV 1h 507 100 1917
UV 2h 504 136 2710
对照 CK 512 39 716
45 ℃1h 508 101 1919
45 ℃2h 501 135 2619
UV 1h 520 153 2914
UV 2h 511 252 4913
图 3 　逆境处理对根尖染色体的影响
Fig. 3 　Chromosomes response of plantlets to stress
1 :染色体正常形态 (2n = 12) ;2 :逆境诱发的四倍体 ;3 :逆境诱发的染色体断片 ;4 :逆境诱发的大量染色体断片
1 :Normal chromosomes (2n = 12) ;2 :Chromosomes doubling induced from the stress ;
3 :Chromosomes breaks and their fragments induced from the stress ;4 :Chromosomes pulverization induced from the stress
174　6 期 蚕豆离体培养繁殖植株对高温及紫外胁迫的反应
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于高温处理的 ;无论是克隆苗还是种子苗 ,在紫外线照
射的处理中 ,同一分裂相中断片的数量要多于 45 ℃高
温处理的 ;随着逆境处理时间的延长 ,中期分裂相中出
现染色体断片的数量也随着增加 (图 3 - 3、4) 。
3 　讨论
在正常培养条件下 ,蚕豆种子苗在离体繁殖 3 代
后 ,克隆苗与种子苗在表型上长势相当 ,难于区别 ,有
丝分裂过程中出现染色体断片的频率不高。种子苗对
高温、紫外线胁迫的耐受力明显好于克隆苗。在同等
条件下 ,克隆苗的死亡率是种子苗的 2～3 倍。植株在
遇到高温、紫外线胁迫时不仅在外观上表现出叶片枯
黄、植株死亡 ,染色体水平也发生了畸变 ,表现在有丝
分裂中期分裂相中有很多断片产生。高温处理和紫外
线照射的时间越长 ,有丝分裂过程中出现染色体断片
的频率就越高。紫外线照射胁迫对植株造成的伤害大
于高温胁迫 ,紫外线照射达到 2h 时 ,克隆苗分裂相中
出现断片的频率接近 50 % ,克隆苗的变异程度要远远
大于种子苗。
利用蚕豆 ( Vicia f aba)根尖微核技术监测环境污染
和检测危险化学品已得到广泛的运用 ,这种方法灵敏
性高、可靠性强、简便易操作 ,因此在世界范围内被广
泛应用[9 , 10 ] 。将微核技术与快繁技术结合起来 ,用于
检测克隆后代对逆境的适应度 ,尚未见报道。大量的
研究表明 ,染色体畸变是产生微核的主要来源 ,微核的
产生与染色体畸变有很大的相关性 [11 ] ,呈直线回
归[4 ] 。由于微核数量多 ,有大有小 ,统计较为困难 ,而
有丝分裂中期分裂相中染色体畸变较为直观 ,统计时
不易发生重复或遗漏。本研究表明以有丝分裂中期分
裂相中染色体的畸变率来评估植株受到伤害的程度是
可行的。染色体水平上的畸变又将引发基因水平上的
变化 ,而这种变化将会导致相关性状发生变异。
蚕豆克隆后代经有性繁殖后对逆境的反应以及其
他植物克隆后代对逆境的反应值得进一步研究。
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