全 文 ：文章编号 :100028551 (2002) 0320129204
受辐照窄颖赖草花粉 DNA 进入小麦胚囊的
电镜自显影证据及杂种原位杂交鉴定
李桂英1 　王琳清1 　施巾帼1 　周荣华2 　付仓生1 　郝宏京1
(11 中国农业科学院原子能利用研究所 ,北京　100094 ;
21 中国农业科学院作物品种资源研究所 ,北京　100081)
摘要 :采用3 H2胸腺嘧啶标记窄颖赖草 (Leymus angustus)花粉结合电镜自显影的方法证
明受辐照窄颖赖草花粉 DNA 进入了小麦胚囊 ,运用基因组原位杂交技术证明所得杂
种为真杂种 ,经辐照花粉获得的普通小麦 J211 与窄颖赖草杂种中窄颖赖草染色体发
生了数目和结构变异。
关键词 :普通小麦 ;窄颖赖草 ;辐照花粉 ;电镜自显影 ;基因组原位杂交
收稿日期 :2000211230
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39770497)
作者简介 :李桂英 (1964～) ,男 ,河北卢龙人 ,中国农业科学院原子能所副研究员 ,博士 ,从事小麦辐射遗传育种研究
在植物远缘杂交中 ,异源花粉是否进入母本胚囊 ,通常可通过胚胎学方法来证实。利用水
溶性苯胺蓝染色 ,在荧光显微镜下可观察到花粉管进入胚囊[1 ] 。但近亲花粉管与远缘花粉管
无法区别。韩一凡等[2 ]运用3 H标记花粉的方法研究了杨树远缘多父本受精现象。结果发现 ,
若在近亲花粉中加入大量远缘花粉进行混合授粉 ,远缘花粉 DNA 能够进入胚囊 ,甚至在 F1 中
表现。胡小元等[3 ]在小麦 ×大赖草属间杂交研究中证明 ,γ射线辐照花粉可促进花粉萌发 ,但
未证实受辐照花粉进入母本胚囊和所得杂种真伪。基因组原位杂交是利用异源物种的基因组
总 DNA 作探针进行的原位杂交 ,是鉴定杂种中异源染色体或片段的最有效和最直观的方
法[4～6 ] 。本文采用3 H2胸腺嘧啶标记结合电镜自显影的方法研究受辐照窄颖赖草花粉 DNA 是
否进入小麦胚囊 ,运用基因组原位杂交技术鉴定所获得的杂种真伪及杂种中异源遗传物质的
多寡。
1 　材料和方法
111 　材料
母本为普通小麦 J211 ;父本为窄颖赖草 ,由中国农业科学院作物品种资源所提供。用 9Gy
γ射线辐照父本花粉 ,授予母本 ,以不辐照的作对照 ,所获得的杂种分别以 JΠL (9Gy)和 JΠL (CK)
表示。
112 　方法
921　核 农 学 报　2002 ,16 (3) :129～132Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
11211 　3 H2胸腺嘧啶标记及电镜自显影 　(1) 标记 :采用虹吸法进行3 H2胸腺嘧啶标记。在窄
颖赖草幼穗下约 2cm 处 ,用针插入 1 条两股合成的棉线 ,穿过茎秆 ,使棉线两端浸在盛有
150μCiΠ10ml 或 250μCiΠ10ml 的小瓶内 ,连续标记直到散粉 ,标记起始时父本花粉母细胞处于细
胞分裂间期 Ⅰ。每个引入量标记两穗。
(2)辐照与授粉 :将标记的父本穗于散粉前 2～3h 取下 ,放于盛 4 %蔗糖的三角瓶中 ,在本
所农用标准60 Co 放射源用 9Gyγ射线辐照。以不辐照的为对照。待散粉时取新鲜花粉授予已
去雄的母本柱头。
(3)电镜自显影 :方法参考文献[7 ]。
11212 　杂种植株染色体的基因组原位杂交 　(1) 普通小麦、窄颖赖草基因组 DNA 的提取 :参
考文献[8 ]。
(2)杂种植株根尖染色体制片 :取材、固定参考文献 [ 9 ] ,2 %纤维素酶和果胶酶混合液 ,
37 ℃水浴中酶解 70～80min ,45 %醋酸压片 ,液氮冷冻揭片 ,气干 , - 20 ℃保存。
(3)原位杂交 :方法见参考文献 [ 4 ,5 ] ,并略作修改。探针混合液含 50 %甲酰胺 (20μl) 、20
×SSC(4μl) 、10 %SDS(015μl) 、50 %DS(8μl) 、蛙鱼精 DNA (5μl) 、中国春 DNA (111ng) 、探针 DNA
(100ng) 、无菌水 (015μl) 。探针混合液 80 ℃变性 5min ,迅速插入冰中 5min。染色体制片经 RNA
酶 37 ℃下处理 1h ,70 %甲酰胺 (70 ℃) 变性 2min ,经 - 20 ℃70 %～100 %乙醇逐级脱水干燥后 ,
将探针混合液加于每张片子上 ,盖上塑料盖片 ,37 ℃下杂交过夜。杂交信号的检测 :5 %牛血清
蛋白 (BSA ,用 4 ×SSCΠTween20 配制) ,每片 100μl ,37 ℃20min ;去 BSA ,加 2μgΠml 抗地高辛2荧光
素 (每片 40μl) ,37 ℃1h ;DAPIΠPI 对染 ;用 Olympus DX260 荧光显微镜观察 , Kodak ASA400 彩卷
摄影。
2 　结 　果
211 　电镜自显影
以3 H2TdR 标记的化合物的β粒子 ,打到乳胶层显影后的银颗粒呈扭曲的丝团状[7 ] 。经3 H2
TdR 标记的窄颖赖草花粉 (经 9Gy 射线辐照或不辐照)授予普通小麦 J211 1、3、5d 后 ,对小麦子
房进行电镜自显影观察 ,结果见图版 Ⅰ2A、B、C。由图可见 ,无论是辐照的异源花粉 ,还是未辐
照的花粉 ,授予小麦后 ,在小麦胚胎细胞中均发现有一些这样的丝团状银粒 ,说明经 9Gy 射线
辐照的异源花粉与未经辐照的花粉一样 ,均能在小麦柱头上萌发 ,并进入小麦胚囊。
212 　杂种植株基因组原位杂交
以窄颖赖草基因组 DNA 为探针 ,普通小麦基因组 DNA 为封阻 ,与普通小麦 ×窄颖赖草
(CK或 9Gy 辐照花粉) 杂种植株根尖染色体进行原位杂交 ,在所试材料中均获得了阳性杂交
(图版 Ⅰ2D ;图版 Ⅰ2E、F、G) 。在J211 ×窄颖赖草 (CK)杂种有丝分裂中期可明显区分出 42 条窄
颖赖草染色体 (绿色)和 21 条小麦染色体 (红色) 。在 J211 ×窄颖赖草 (9Gy) 杂种植株根尖细胞
有丝分裂中期 ,可见 21 条小麦染色体 ,窄颖赖草染色体的数目与结构发生了变异。图版 Ⅰ2F
示 21 条小麦染色体 ,40 条窄颖赖草染色体 ,比理论数少 2 条 ;图版 Ⅰ2G示 21 条小麦染色体 ,42
条窄颖赖草染色体 ,其中一条为端着丝粒染色体 (t)或微染色体 (m) 。
031 核　农　学　报 16 卷
A2C授粉后 123d JΠL 杂种胚胎细胞中的银粒分布 ;A1JΠL (CK)授粉后 1d ; B1JΠL (9Gy) 授粉后 2d ; C1JΠL (9Gy)
授粉后 3d ; D1JΠL (CK)根尖染色体原位杂交 ,小麦 21 条 (红色)窄颖赖草 42 条 (绿色) ; E JΠ(CK) 根尖细胞分
裂前期原位杂交 ,红色为小麦染色质 ,黄色为窄颖赖草染色质 ; F、GJΠL (9Gy)根尖细胞染色体原位杂交 ,2 n
= 61 ,小麦 21 条 (淡绿) ,窄颖赖草 40 条 (绿色) 。2 n = 61 + t (或 m)小麦 21 条 (淡绿) ,窄颖赖草 41 条 ,并 1 条
t 或 m(黄绿色) 。
A2C. Silver particles distribution in embryo cells of JΠL hybrid 123 days after pollination(DAP) ;A.JΠL (CK) 1DAP ; B.JΠ
L (9Gy) 2DAP ; C.JΠL (9Gy) 3DAP ; D. GISH of JΠL (CK) ,2n = 63 ,21 from wheat (red) ,42 from L . angustus (green) ,
E. GISH of JΠL (CK) premitosis cell ,chromatin of wheat is red and that of L . angustus is green , F. G. GISH of JΠL
(9Gy) ; F. 2n = 61 ,21 from wheat (pale green) , 40 from L . angnstus . ; G. 2n = 61 + t or m ,21 from wheat , 42 from
L . angustus ( Kelly) including one telocentric or minichromosome.
3 　讨 　论
电镜自显影技术是电镜技术与放射自显影技术的结合 ,可以很清楚地显示放射性物质在
亚细胞内的分布。本文运用这一技术 ,证明了受辐照窄颖赖草花粉 DNA 进入小麦胚囊。此
131　3 期 受辐照窄颖赖草花粉 DNA 进入小麦胚囊的电镜自显影证据及杂种原位杂交鉴定
外 ,所观察材料绝大部分均发现有银粒分布 ,表明标记方法与标记时期合适。3 H2TdR 标记的
是异源花粉 DNA ,因此 ,银粒应主要分布于胚胎细胞核中。然而 ,在细胞质中也有一定量的分
布 ,这是由于β粒子的特性决定的 ,粒子的运动是任何方向的 ,因此有可能打到细胞质中。细
胞质中银粒较多可能是由于标记剂量偏大所致。
辐照花粉对普通小麦 ×窄颖赖草杂种的细胞学效应的研究表明[9 ] ,辐照花粉促进了杂种
染色体数目与结构的变异 ,杂种中染色体数目减少。但由于利用一般细胞学方法不易区分小
麦染色体与窄颖赖草染色体 ,因此 ,不能确定所减少的是父本还是母本染色体。本文运用基因
组原位杂交分析表明 ,经辐照花粉授粉获得的杂种中受辐照父本的染色体发生了变异。说明
利用辐照可在一定程度上削减杂种染色体中外源染色体的数目 ,从而有可能提高杂种回交的
成功率。
参考文献 :
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[8 ] 　张学勇 ,等. E与 St 基因组特异 RAPD 片段在部分小麦族植物中的分布 ,遗传学报 ,1998 ,25 :131～141
[9 ] 　李桂英 ,等. 辐照花粉对普通小麦与窄颖赖草杂种的细胞学效应 ,核农学报 ,2000 ,14 (1) :6～11
EM AUTORADIOGRAPHY EVIDENCE FOR IRRADIATED POLLEN DNA OF Leymus
angustus ENTERING WHEAT OVARY AND GISH OF ITS HYBRIDS
LI Gui2ying1 　WANGLin2qing1 　SHI Jin2guo1 　ZHOU Rong2hua2
FU Cang2sheng1 　HAO Hong2jing1
(11 Institute for Application of Atomic Energy , CAAS , Beijing 　100094 ;
21 Institue of Crop Germplasm Resources , CAAS , Beijing 　100081)
ABSTRACT :It was proved that DNA of irradiated pollen of Leymus angustus entered wheat ovary
by means of labeling pollens of L . angustus with 3 H2TdRand electronic microscopic autoradiogra2
phy. Genomic in situ hybridization analysis on wheat ×L . angustus hybrids showed that chromo2
some number variation and structural aberration of L . angustus took place in the hybrids recov2
ered after pollinating with irradiated pollens of L . angustus .
Key words : Triticum aestivum L. ; Leymus angustus ; EM autoradiography ; GISH
231 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (3) :129～132