全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052743204
以玉米幼胚为受体转化海藻糖合成酶基因
张志勇　陈　梅　李晚忱　付凤玲
(四川农业大学玉米研究所Π西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室 ,四川　雅安　625014)
摘 　要 :将含酿酒酵母海藻糖合成酶基因 ( TPS1)的重组质粒 pC1300WTPS ,用农杆菌 EHA105 介导转化玉
米幼胚 ,不经诱导愈伤组织而直接筛选分化成苗。通过对幼胚大小和半胱氨酸 (Cys) 浓度筛选 ,发现长
度在 115～210 mm 的幼胚更适合农杆菌介导的幼胚转化 ,并且在农杆菌与幼胚的共培养阶段添加 200
mgΠL 的半胱氨酸 ,能够有效降低幼胚在农杆菌浸染过程中的褐化率 (2913 %) ,比对照褐化率 (5317 %) 降
低近一半。经 PCR 检测 216 株转化植株 ,得到 1 株阳性植株。
关键词 :玉米 ;幼胚 ;海藻糖合成酶基因
TRANSFORMATION OF MAIZE IMMATURE EMBRYOS
WITH TREHALOSE SYNTHASE GENE
ZHANG Zhi2yong 　CHEN Mei 　LI Wan2chen 　FU Feng2ling
( Maize Research InstituteΠKey Laboratory of Crop Genetic Resources and Improvement , Sichuan Agricultural University , Ya’an , Sichuan 　625014)
Abstract : Maize immature embryos were transformed by Agrobacterium tumef aciens EHA105 with TPS1 gene from
saccharomyces cerevisiae. In this study , immature embryos which were not induced into embyrogenic calli were selected with
antibiotic straightly. Through selecting length of immature embryos and concentration of Cys , we found that the 115～210 mm
of immature embryos were better than other length , and adding Cys 200 mgΠL in coculture could reduce browning rate
(2913 %) effectively , almost half of CK (5317 %) . The results of specific PCR test showed , there was one positive plant
among 216 transformed plants.
Key words :maize ;immature embryos ; trehalose synthase gene
收稿日期 :2009202217 　　接受日期 :2009207221
基金项目 :国家 863 计划 (2008AA10Z12121) ;国家转基因重大专项子课题 (2008ZX003200425)
作者简介 :张志勇 (19822) ,男 ,四川简阳人 ,博士研究生 ,主要从事植物基因工程研究。E2mail : zhangzyong219 @126. com
通信作者 :付凤玲 (19622) ,女 ,陕西蒲城人 ,教授 ,主要从事玉米遗传育种与生物技术研究。E2mail : ffl @sicau. edu. cn　　干旱是影响玉米生产最主要的非生物胁迫因素之一[1 ] 。玉米自身的水分生理状况也决定了它比其他禾本科作物更易受干旱的危害。因此 ,研究玉米基因组以外的耐旱相关基因 ,并通过遗传转化途径改良玉米自身的耐旱性 ,培育转基因耐旱玉米品种已受到越来越多的关注[2 ,3 ] 。近年来耐旱基因研究取得了较快进展 ,相继克隆了一些重要的耐旱基因 ,海藻糖合成酶基因 ( TPS1)就是其中之一[4 ] 。TPS1 合成的海藻糖在干旱条件下通过氢键与氨基酸相连 ,可以代替水起到防止蛋白质变性和细胞融合的作用[5 ] 。Holmstrom 等[6 ] 、Romero 等[7 ]均利用来源于酵母的 TPS1 基因成功转化 了烟草 ,并发现转基因烟草比未转化烟草具有更强的耐旱性。玉米转基因研究 ,更多的是以胚性愈伤组织为受体。由于基因型的限制 ,能稳定高效诱导胚性愈伤组织的玉米材料仅限于少数几个品种 ,加之胚性愈伤组织培养时间长 ,操作繁琐 ,分化再生率不高等原因 ,严重制约了玉米转基因研究的进展。因此有必要开展其他转基因受体系统研究 ,以提高转基因效率。Ishida等[8 ] 、Bronwyn 等[9 ]将玉米幼胚用农杆菌浸染后再诱导愈伤组织 ,得到阳性转基因植株 ,虽然可以减少愈伤培养时间 ,但仍受到基因型的限制 ,并且农杆菌介导玉米
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幼胚转化外源基因时 ,容易造成幼胚褐化死亡 ,影响转
化效率。多数学者认为 ,这种褐化死亡主要是由多酚
氧化酶和过氧化氢酶造成。研究发现 ,半胱氨酸 (Cys)
作为一种抗氧化剂 ,能有效抑制多酚氧化酶和过氧化
氢酶的活性 ,从而提高农杆菌介导的转基因效率[10 ] 。
本研究用农杆菌介导法 ,将酿酒酵母海藻糖合成
酶基因 ( TPS1) 的重组质粒 pC1300WTPS 转化玉米幼
胚 ,进行潮霉素抗性筛选后直接分化成苗 ,在分化培养
过程中同时进行潮霉素抗性筛选 ,从而避开愈伤组织
诱导过程。最后对成活幼苗混样进行基因组 PCR 检
测 ,再在阳性混合样中分单株检测 ,确定阳性植株。为
了提高幼胚转化效率 ,试验对幼胚大小和农杆菌浸染
后的共培养阶段添加的半胱氨酸浓度进行了筛选 ,以
建立优化的玉米幼胚转化体系。
1 　材料与方法
111 　玉米幼胚的获取
在超净工作台上剥离玉米优良自交系 182599 红、
182599 白、PJ21 及丹 340 授粉 11～18d 的幼胚 ,按不同
大小分组 , 获得小于 110 mm、115 ～ 210 mm、大于
215 mm 3 组作为农杆菌转化外源基因的受体材料。
根癌农杆菌菌株为 EHA105 , 双元表达载体
pC1300WTPS为本实验室构建 ,其物理图谱见图 1。T2
DNA 区 TPS1 基因的启动子为植物逆境诱导启动子 p2
wcs120 ,终止子是 T2nos。选择标记为潮霉素磷酸转移
酶基因 ,具潮霉素 (Hyg)抗性。
112 　农杆菌转化和再生植株的获得
将含有 TPS1 基因的农杆菌菌株 EHA105 接种到
YEP 培养基上 (含利福霉素和卡那霉素各 50 mgΠL) ,
28 ℃、225 rpm 振荡培养。当 OD600值为 015 时 ,于 4 ℃、
4000rpm 离心 5 min ,收集菌体。再用 pH值为 512 的浸
染液 (液体 N6 培养基 ,6814 gΠL 蔗糖 ,36 gΠL 葡萄糖 ,
100μmolΠL AS)稀释菌体浓度至 OD600值为 013 ,浸染玉
米幼胚 8～10 min 后 ,取出幼胚 ,用无菌滤纸吸干表面
菌液 ,置于 pH 值为 518 的共培养基上 (液体 N6 培养
基 ,7 gΠL 琼脂 ,0185 gΠL AgNO3 ,100μmolΠL AS) 进行共
培养 (20 ℃暗培养 3 d) [11 ] 。共培养基中添加半胱氨酸
的量分别为 0、100、200、300 和 400 mgΠL。共培养后的
幼胚用含 250 mgΠL 噻雹霉素钠的无菌水清洗 3 次 ,再
置 pH 值为 518 的恢复培养基上 (液体 N6 培养基 ,
30 gΠL 蔗糖 ,0185 gΠL AgNO3 ,250 mgΠL 噻孢霉素纳 ,015
gΠL MES ,7 gΠL 琼脂) 28 ℃暗培养 5～7d ,转至 pH值 518
的筛选培养基上 (恢复培养基 + 5～15 mgΠL 潮霉素)进
行潮霉素梯度筛选 ,其浓度依次为 5、10、15 mgΠL ,每轮
筛选于 28 ℃暗培养 15～20 d。经筛选后的抗性幼胚再
转至 pH518 的分化培养基[12 ] (液体 N6 培养基 ,30 gΠL
蔗糖 ,1 m gΠL 62BA ,015 mgΠL NAA ,7 gΠL 琼脂) ,3000 lx
每天光照 16 h ,25 ℃分化培养获得再生植株。
图 1 　TPS1 基因单子叶
植物诱导表达载体 pC1300WTPS的结构
Fig. 1 　Construction of stress inducible expression vector
pC1300WTPS containing TPS1 gene for monocotyledon
113 　转基因植株的检测
再生植株生根壮苗后移植到营养杯中 ,长至 5 叶
后 ,剪取少许叶片 ,每 5 株作为一个混合样 ,用 CTAB
法提取基因组 DNA。根据 McDougall [4 ]测定的 TPS1 基
因序列设计特异引物 : P3 ( 5’2GCTAAGTAAGCAACA2
AAGCAGGC23’) 和 P4 (5’2GAAAACCGGACCAGGAATA2
GACG23’) ,按如下程序进行 PCR 扩增 :94 ℃5min ;94 ℃
30s ,59 ℃30s ,72 ℃90s ,30 个循环 ;72 ℃8min。琼脂糖
凝胶电泳检测目的条带。检测出阳性混合样后 ,再检
测其中的单株。回收阳性单株的特异条带并测序
(Invitrogen Biotechnology Co. ,Ltd) ,验证外源海藻糖基
因是否转入玉米。
2 　结果与分析
211 　不同大小幼胚经农杆菌浸染后的褐化率分析
将上述 3 组幼胚各 100 个用农杆菌浸染 ,两周后
统计褐化胚数。结果表明 (表 1) ,长度在 110 mm 以下
的幼胚 ,经农杆菌浸染后褐化率达 100 % ,这可能是由
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于幼胚太小 ,在剥离时难与胚乳分离 ,使得剥离次数增
加 ,造成伤口面积过大 ,在后续恢复培养中伤口难以愈
合 ,最终褐化死亡 ,难以成苗。215 mm 以上的幼胚褐
化率为 3518 % ,但在共培养中部分幼胚直接萌发幼
芽 ,甚至长根 ,造成与农杆菌共培养不充分 ,外源基因
进入机会减少。115～210 mm 幼胚褐化率为 4312 % , 虽然高于 215 mm 以上的幼胚 ,但在共培养中不萌发 ,这就保证了幼胚能够与农杆菌进行比较充分的共培养 ,增加外源基因进入机会。不同自交系均有相同趋势。因此 ,初步认为 ,长度在 115～210 mm 左右的幼胚更适合作为农杆菌转化外源基因的受体。
表 1 　幼胚长度对褐化率的影响
Table 1 　Effect of immature embryo length on browning rate ( %)
胚长
length
自交系 inbred line
182599 红
182599 Red 182599 白182599 white PJ21 丹 340Dan340 平均褐化率average browning rate
< 110 mm 100 100 100 100 100
115～210 mm 48 51 54 63 43. 2
> 215 mm 37 42 46 54 35. 8
212 　半胱氨酸含量对幼胚褐化的影响
玉米幼胚受农杆菌浸染时会造成损伤 ,形成伤口
的褐化和死亡 ,致使转化效率降低。半胱氨酸作为抗
氧化剂 ,能有效抑制多酚氧化酶和过氧化氢酶的活性 ,
提高农杆菌转化率。将授粉 12～14d 的幼胚 (胚长 110
～215 mm) 用农杆菌浸染后 ,接种在添加不同浓度半
胱氨酸的共培养基上 ,每处理 100 个幼胚 ,浸染后两周
调查幼胚褐化率 ,结果见表 2。半胱氨酸不同含量之
间幼胚褐化率存在显著差异。从表 2 可以看出 ,以 200
mgΠL 浓度的褐化率最低 ,为 2913 % ,显著低于不添加
半胱氨酸的对照处理 (5318 %) 。尽管添加半胱氨酸都
不同程度地减轻了农杆菌浸染幼胚的褐化率 ,但含量
较高时 (大于 300 mgΠL) 褐化率反而有所增加 ,可能是
高浓度半胱氨酸对幼胚造成了损伤[9 ,10 ] ,且不同自交
系间均有上述规律。因此认为 ,以幼胚作为农杆菌转
化受体时 ,共培养基中添加 200 mgΠL 半胱氨酸 ,可有
效降低幼胚褐化率 ,从而提高转化幼胚的成苗率 ,增加
外源基因转化效率。
表 2 　添加不同浓度半胱氨酸共培养基的幼胚褐化率
Table 2 　Browning rate of immature embryo coculture with different concentration Cys ( %)
半光氨酸含量
Cys concentration (mgΠL) 自交系幼胚数 immature embryo number of inbred line182599 红
182599 Red 182599 白182599 white PJ21 丹 340Dan 340 平均褐化率average browning rate
Ⅰ　0
Ⅱ　400
Ⅲ　300
Ⅳ　100
Ⅴ　200
47
35
30
26
23
51
42
39
31
28
54
45
40
33
31
63
52
48
36
35
5318 a A
4315b AB
3912b BC
3115cd BC
2913d C
注 :表中注释后带有不同小写Π大写字母表示在 0105Π0101 水平差异显著。
Note : The data followed by different small and capital letters indicated significant difference at 0105 and 0101 levels , respectively.
213 　农杆菌介导玉米幼胚转基因植株的 PCR检测
试验获得转化植株 216 株 ,其中 182599 红 85 株 ,
182599 白 62 株 ,PJ21 38 株 ,丹 340 31 株。为简便快速
检测阳性植株 ,采用 5 株混样再单株检测的方法。若
混合样中检测到 1600bp 左右的目的基因条带 TPS1 ,
再检测其中每 1 株幼苗 ,重复后仍未检出目的条带的
混合样淘汰。经 PCR 扩增检测 ,仅在 PJ21 中得到 1 个 阳性植株 ,平均转化率为 0146 %。目的基因条带 TPS1检测结果见图 2 ,阳性植株中扩增到一条 1600bp 左右的清晰条带。回收目的条带并测序 ,结果 (图 3) 表明 ,从阳性植株中扩增出的条带与 McDougall[4 ] 报道序列( GenBank : X68496) 相似性达 99 %以上 , 初步说明TPS1 基因已整合到玉米基因组中。
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图 2 　转化植株的 PCR 检测
Fig. 2 　PCR examining of transfer plant
3 　结论与讨论
以幼胚作为外源基因转化受体 ,可以不受愈伤组
织诱导的基因型限制 ,并可大幅度减少组织培养的繁
重劳动。为减少幼胚经农杆菌浸染后的褐化率 ,提高
转化效率 ,以 115～210 mm 长的幼胚为转化受体、并在
共培养基中添加 200 mgΠL 的半胱氨酸较好。为快速
低成本地检测出阳性转化植株 ,采用初次混合样检测
和二次单株检测相结合的方法 ,既可以减少待检测的
样本量 ,又可减轻移栽植株的田间管理强度 ,达到多快
图 3 　转基因植株扩增条带 (text)与酿酒酵母 TPS1 (x68496)基因序列比对结果
Fig. 3 　Sequence alignment of transgene plant (test) and TPS1 gene in Saccharomyces cerevisiae (x68496)
好省地获得转基因植株的目的。
以幼胚作为受体转化外源基因时 ,与农杆菌共培
养后的幼胚用含噻雹霉素钠 (Cef) 的无菌水洗菌 ,再转
入含同样量 Cef (250 mgΠL) 的恢复和分化培养基中 ,农
杆菌未被完全杀死 ,致使幼胚分化植株后逐渐死亡 ,这
与以胚性愈伤作受体的转化体系不同 ,可能是幼胚比
愈伤对农杆菌更敏感所致[13 ] 。因此 ,在幼胚转化体系
中 ,应适当提高噻雹霉素钠的含量 ,减少幼胚和分化植
株的死亡率。
研究表明[14～16 ] ,农杆菌介导的玉米愈伤组织的转
化率在 0～18 %之间。本试验以幼胚作受体仅得到 1
株阳性植株 ,转化率为 0146 % ,转化率较低 ,这可能是
受体材料的生长状态差异以及不同基因型间的差异造
成的。通过进一步改进以幼胚作受体的转化方法 ,相
信能够建立起一个高效、稳定的幼胚转化体系 ,为玉米
转基因的大规模实施提供更多的方法和途径。
本试验用农杆菌浸染玉米幼胚后直接成苗 ,经
PCR 初步鉴定 TPS1 基因已整合到玉米基因组中。至
于 TPS1 基因能否在后代植株中得到稳定表达 ,能否
在干旱条件下增强转基因植株的耐旱性 ,还需要做进
一步的后代分离和鉴定工作。
(下转第 757 页)
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数最大的是每亩穗数 ,其次为每穗粒数 ,千粒重的盐害
指数最小。盆栽试验表明 ,各品种 (系)耐盐性顺序为 :
C2118 > 盐丰一号 > 苏啤 4 号 > 扬农啤 5 号 > 西引二
号 > 单二 > 盐 99098 > 苏啤 3 号。
313 　综合发芽和成熟期耐盐力的鉴定结果 ,C2118、盐
丰一号、苏啤 4 号、扬农啤 5 号在 2 个时期均表现为耐
盐。由于沿海地区主要以种植二棱的啤酒大麦为主 ,
所以多棱品种的 C2118、盐丰一号可作为耐盐种质资
源利用 ,苏啤 4 号、扬农啤 5 号可作为耐盐品种直接在
沿海滩涂适宜的盐碱土上种植。苏 3、盐 99098 在 2 个
时期的鉴定中均表现为不耐盐 ,不适宜作为耐盐大麦
品种 (系)或种质资源利用。
芽期的耐盐鉴定结果基本与成熟期的结果一致 ,
由此可以认为 ,发芽试验的结果可以作为判断大麦品
种 (系)是否耐盐的依据 ,与丁顺华等在小麦上的研究
结论一致[12 ,13 ] 。
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