全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 042297203
利用返回式飞船选育优良红曲霉菌
印　红1 　谢申义1 　章光明2 　谢申猛23
(11 北京东方红航天生物技术有限公司 ,北京　100086 ;21 空间技术研究院 ,空间生物实验室 ,北京　100081)
摘 　要 :利用“神舟 3 号”返回式飞船搭载红曲霉菌 0708。对搭载后的菌株进行复壮、分离和筛
选 ,以高产洛伐他汀和耐硒为选择条件 ,筛选到 8 株耐硒又高产洛伐他汀的菌株。经连续发酵
试验证明变异菌株的优良特性可以保持稳定。
关键词 :航天诱变 ;红曲霉菌 ;微生物育种
MUTANT SELECTION FROM Monascus purpureus BY AEROSPACE FLIGHT IN RECOVERABLE AIRSHIP
YIN Hong1 　XIE Shen2yi1 　ZHANG Guang2ming2 　XIE Shen2meng2
(1 Dawn Aerospace Bio - tech Co. , Ltd , Beijing , 　100086 ;
2 Space Biology Lab , Chinese Academy of Space Technology , Beijing , 　100081)
Abstract :Monascus purpureus was carried into aerospace by the return airship“Shenzhou No. 3”. After flight , the
strain was rejuvenized , segregated and selected. 8 strains with high productivity of lovastatin and Selenium tolerance
were obtained. A series of tests showed that the acquired character of the mutants is stable.
Key words :space inducement ; Monascus purpureus ;microbial breeding
收稿日期 :2003211209
基金项目 :军转民技术开发项目资助课题 (科工民[2002 ]298 号)
作者简介 :印红 (1973～) ,女 ,河北昌黎人 ,工程师 ,从事微生物制药研究。3 通讯作者
红曲的发酵产物他汀类物质是降血脂首选药物 ,广泛应用于心脑血管疾病的预防和治疗 ,但长期使
用可能引起可逆性转氨酶升高和抗氧化力下降的副作用[1 ,2 ] 。硒是强力抗氧化元素 ,具有降血脂、保肝、
预防癌症等功能[3 ] ,而有机硒比无机硒生物活性高 ,毒性低。红曲霉菌等真菌能利用无机硒合成有机硒
化合物[4 ] ,但现有红曲霉菌株耐硒性有限 ,过高的硒能导致生长抑制 ,且他汀的生成减少。空间环境的
强辐射、失重、高洁净、高真空等多种诱变因素 ,为人类提供了地面无法比拟的诱变条件[5 ] 。本研究利用
航天搭载进行诱变红曲霉菌 ,筛选耐硒和高产洛伐他汀的菌株。
1 　材料和方法
111 　菌种
搭载菌种为红曲霉菌 0708( Monascus purpureus) ,由北京东方红航天生物技术有限公司提供。
112 　搭载诱变过程
生长良好的平板培养物在无菌工作台上转移到无菌搭载小管 ,封口后装入搭载大管 ,搭载前于 4 ℃
保存。“神舟 3 号”返回式飞船 2002 年 3 月 25 日发射 ,2002 年 4 月 1 日回收。飞行过程中样品放置于飞
船返回舱 ,返回地面后 3d 取出样品 ,于 4 ℃冰箱保存[6～7 ] 。
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地面对照菌株 ,飞船发射前置于 4 ℃冰箱中 ,飞船升空后 ,对照样品置于自然环境 ,取回搭载样品后
与搭载样品同时置于 4 ℃冰箱。
113 　菌种筛选
搭载后的样品菌体洗脱到 10 毫升无菌水中 ,做倍比稀释。取 10 - 1 、10 - 2 、10 - 3 、10 - 4 、10 - 5 、10 - 6 ,六
个稀释度的菌液 015mL 涂于添加了不同浓度 Na2 SeO3 的平板上。试管保存各平板上长出的单菌落 ,用
于下步实验。对照组样品做同样处理。
114 　培养基
斜面培养基 ( %)葡萄糖 4 ,琼脂粉 2 ,土豆汁 20。种子液 ( %)甘油 7 ,葡萄糖 3 ,牛肉膏 3 ,蛋白胨 018 ,
NaNO3 012 ,MgSO4 . 7H2O 011。发酵液 ( %)为葡萄糖 3 ,牛肉膏 3。大米固体培养基的处理 :用自来水浸泡
12h 后过夜晾干 ,再以 30 %比例的发酵液浸泡灭菌即可。Na2 SeO3 添加方法为 ,25000mgΠL 的 Na2 SeO3 母
液经无菌 0122μ的微孔滤膜过滤除菌后在倒平板前按不同比例加入培养基中 ,以培养基中硒的浓度为
标准进行计算。
115 　固体发酵
搭载后筛选到诱变菌株和对照菌株同时活化 ,制成平板种子 ,用种子液洗涤培养物的表面 ,转移至
装有大米固体发酵培养基的试管中发酵。32 ℃培养 3d ,再转为 28 ℃培养 12d。
116 　样品中洛伐他汀的测定
发酵产物灭菌后用粉碎机粉碎 ,精确称取 011～012g 于离心管中 ,加入 4mL75 %乙醇 ,超声处理
60min 后 4000rpm 离心 10min ,取上清液 5μL ,用美国 Waters 公司的 Delta 600 型高效液相色谱仪测定[8 ] 。
检测条件为 Waters 公司 C18色谱柱 ,150 ×4160mm ;流动相 :甲醇∶水 (72∶28) ,加少量磷酸作改善剂 ;2996
PDA 检测器 ;检测波长 :237nm ;流速 :110mlΠmin ;柱温 :室温。甲醇为色谱纯 ,水为 HPLC 专用水 ,磷酸为
优级纯。以 sigma 公司洛伐他汀标准品配制对照溶液。
2 　结果与分析
211 　太空搭载对红曲霉菌耐硒能力的诱变效应
表 1 　耐硒生长实验结果
Table 1 　Se tolerance test
样品
sample
Se 浓 度[mgΠL ]
10 20 30 40 45 50 100 200
搭载样品
flight sample
+ + + + + + + -
对照样品
CK + + + + + - - -
　　注 :“+ ”表示有菌落生长 ;“ - ”表示无菌落生长。
Note :“+ ”indicates live colony existed ,“ - ”indicates no live
colony existed.
当环境中硒浓度为 10mgΠL 时即可对微生物产生毒
害。不同微生物对硒的耐受性又有差异。本实验中搭载
菌种与对照分别在添加不同浓度硒的平板上进行筛选 ,
结果显示两者对硒的耐受性出现差异 (表 1) 。硒的浓度
为 50mgΠL 时 ,对照菌株已经停止生长 ,而诱变菌株在硒
的浓度为 50mgΠL、100mgΠL 时仍能正常生长 ,直到硒的浓
度为 200mgΠL 时 ,生长才受到抑制。在其它硒浓度条件
下 ,两组菌株生长状态也出现一定差异。与对照菌株相
比 ,诱变菌株的生长速度略快 ,菌体变红较早 ,颜色更鲜
艳 ,但两者在培养 7d 后没有明显区别。这一实验结果表明 ,经过太空诱变的红曲霉菌培养物中出现了
具有高耐硒性状的菌株。根据诱变原理 ,在经过诱变的培养物中可能还存在耐硒能力降低的菌株 ,但由
于与本研究目的无关 ,故未做实验和分析。
212 　耐硒菌株的洛伐他汀生产实验
通过耐硒选择实验共筛选出 237 个单菌落 ,这些单菌落来自从 10mgΠL 到 100mgΠL 的不同硒浓度筛
选平板。将这些单菌落分别做固体发酵实验之后检测其洛伐他汀含量并与对照菌株相比较。发现 13
个菌株的洛伐他汀含量高于对照菌 ,15 个菌株与对照菌株的洛伐他汀含量无明显差异 ,其余菌株均低
于对照菌株的含量。经显著性分析发现在 13 个高产菌中有 8 个菌与对照的洛伐他汀含量差异显著 ,本
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次搭载诱变的高产突变率为 3. 38 %。但是高产菌株的耐硒能力并不是所有菌株中最突出的 (表 2) 。
表 2 　耐硒菌株洛伐他汀的含量
Table 2 　Lovastatin content in Se2tolerant strains
对照 47 # 105 # 108 # 115 # 155 # 205 # 207 # 210 #
平板 Se 浓度 (mgΠL)
concentration of Se in medium
Π 10 20 30 30 45 20 20 20
发酵物中洛伐他汀含量 (mgΠg)
content of lovastatin in fermented product 2189 3172 3 3 410 33 317 3 3 3153 3 3 3136 3 5107 33 4132 3 3 3162 3
　　注 : 3 , 33 分别表示差异显著 (5 %)和极显著 (1 %)水平 ;n = 3
Note : 3 , 33 means signigicance at 5 % and 1 % , respectively.
3 　小结与讨论
本次搭载实验 ,我们得到了 8 株耐硒且高产的突变株 ,其突变率为 3138 %。但是对所有菌株的固体
发酵产物检测的结果显示 ,耐硒性突变与高产洛伐他汀突变无正相关性 ,筛选到的 8 株高产洛伐他汀突
变株的耐硒能力并不是最好的。在添加有 100mgΠL 硒的平板上得到的菌株的洛伐他汀含量低于对照菌
株的含量但差异不显著。因此耐硒性状与高产性状是否相互拮抗 ,耐硒性状是否单方面影响高产性状
还需要进一步研究。这可能与控制这两个性状的基因是否连锁有关。因此需要对原始菌株和突变株的
基因进行研究 ,从遗传学角度深入分析空间诱变育种机理。另外搭载后菌株的生长状态出现多种变化 ,
如生长速度 ,菌丝数量 ,菌丝长度 ,菌体颜色等性状出现改变 ,但由于这不是本研究的重点 ,故未作进一
步分析。
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