全 文 ：EMS 和 52氮胞苷处理的水稻愈伤
组织对耐盐细胞频率的影响
刘丕庆
(广西大学农学院　南宁　530005)
从四倍体中丹二号 (4N)的花药和幼穗中分别诱导出二倍体[ ZDA (2N) ]、四倍体
[ ZD Y(4N) ]的愈伤组织。用 EMS 和 52氮胞苷处理愈伤组织发现 : 11 随着培养基
EMS 或 52氮胞苷浓度的提高 ,ZDA (2N)和 ZD Y(4N) 在相对生长量的减少方面表现
相同的模式 ,而这两种愈伤组织受盐胁迫时在相对生长量的减少方面表现不同的模
式 ;21 经 EMS 或 52氮胞苷处理后的愈伤组织的耐盐细胞频率没有显著的变化。
关键词 :水稻 　EMS 　52氮胞苷 　耐盐细胞频率
此文于 1998 年 4 月 9 日收到。
水稻是对盐渍敏感的作物 ,通过组织培养筛选耐盐变异体是耐盐育种的一个重要途径。
组织培养过程中 ,培养物能发生各种各样的变异 ———体细胞无性系变异[7 ] 。对耐盐变异体筛
选是否使用诱变剂存在两种不同意见 :一种是诱变能增加耐盐变异体的频率[1 ,2 ,9 ] ,另一种是
诱变不能增加耐盐变异体的频率 ,并且可能导致基因组的其它基因的破坏[5 ] 。
Sano 等[12 ]用 52氮胞苷 (阻止甲基化的药品)处理水稻秧苗 ,发现很多秧苗株高变矮 ,水稻
基因组的甲基化水平降低。甲基化可引起一系列遗传变异[10 ] ,因此 ,52氮胞苷是一种弱诱变
剂[6 ] 。EMS 具有诱变效应 ,并且曾有研究[4 ]指出 , EMS 能提高老鼠垂体前叶肿瘤细胞 DNA
甲基酶的活性 ,使某些序列甲基化。
本实验利用 EMS 和 52氮胞苷处理愈伤组织 ,调查处理后愈伤组织耐盐细胞频率的变化 ,
试图说明耐盐变异体筛选过程中诱变剂使用的重要性。
1 　材料与方法
111 　材料
四倍体水稻中丹 2 号按正常的方法种植于水稻田。分别从其幼穗和花药诱导出四倍体
[ ZD Y(4N) ]、二倍体[ ZDA (2N) ]的愈伤组织。愈伤组织经继代形成松脆型的愈伤组织。
112 　培养基
幼穗、花药培养的诱导愈伤组织培养基是 MS ,附加 2 ,42D 2mg/ L ,水解乳蛋白 400mg/ L ,
酵母提取物 1000mg/ L ,肌醇 100mg/ L 。继代培养基为诱导培养基附加激动素 ( KT) 015mg/
L 。筛选培养基是在继代培养基中加入规定量的 NaCl , SM12、SM16、SM20 ,分别表示含有
112 %、116 %、210 %NaCl 的筛选培养基。所有以上培养基的 p H 值在灭菌前调至 518。
731　核 农 学 报　1999 ,13 (3) :137～141Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
113 　诱变处理
灭菌后的继代培养基没有凝固前 ,在无菌的条件下加入一定量的 EMS 或 52氮胞苷 ,然后
分装在 100ml 的三角瓶中 ,每瓶约装 40～50ml。待培养基凝固后 ,将分成 7～15mg 小块的愈
伤组织接种于各种诱变剂浓度的培养基中。在含诱变剂的培养基上培养 25d 后 ,将存活的愈
伤组织分成 7～15mg 小块接种于筛选培养基。
114 　愈伤组织的筛选
将继代 30d 正常生长的松脆型愈伤组织分为 7～15mg 的小块 ,接种到筛选培养基上。在
筛选培养基上生长 30d 后 ,将每块存活的愈伤组织作为 1 个克隆。在以后的继代中 ,以每个克
隆为单位 ,将所有存活的愈伤组织分成 7～15mg 的小块接种到筛选培养基。
115 　相对生长量、耐盐细胞频率及细胞的计算
参照 Liua[8 ]提出的方法进行。
2 　结果与分析
211 　NaCl 对愈伤组织生长的抑制
将 ZDA (2N) 、ZD Y(4N)两种愈伤组织分别转移到不同 NaCl 浓度的培养基上 ,NaCl 对愈
伤组织的生长有抑制作用 (表 1) 。在同一浓度下 ,ZD Y(4N)的生长比 ZDA (2N)受到更多的抑
制 ,它们的差异达到显著水平。
表 1 　NaCl 对愈伤组织生长的抑制
Table 1 　Inhibitory effects of NaCl on the growth of the callus
愈伤组织
Callus
NaCl 浓度 Concentration of NaCl
010 % 112 % 116 % 210 %
ZDA(2N) 100100 211171 9104 3117
ZD Y(4N) 100100 8136 1147 0160
　　1 　处理的相对生长量与对照相对生长量的比值
1 　Ratio of the relative growth of the treatment to that of the check
212 　EMS 对愈伤组织生长的抑制
将 ZDA (2N) 、ZD Y(4N)接种到不同浓度 EMS 的培养基上 , EMS 对它们的生长表现一定
的抑制作用 (表 2) 。在较低的浓度 (0 %、0105 %、01010 %)下 ,愈伤组织生长和对照相差不大。
当 EMS 的浓度达到 01050 %时 ,愈伤组织生长受到抑制 ,有些愈伤组织变褐死亡 ,相对生长量
是对照的 40 %左右。当 EMS 的浓度达到 01100 %时 ,直到接种 20d 左右才有愈块生长 ,很多
愈块死亡。当 EMS 浓度达到 01300 %时 ,所有愈块死亡。在同一浓度下 ,两种愈伤组织受抑
制的差异没有达到统计显著水平。
表 2 　EMS对愈伤组织生长的抑制
Table 2 　Inhibitory effects of EMS on the growth of the callus
愈伤组织
Callus
EMS 浓度 Concentration of EMS
01000 % 01005 % 01010 % 01050 % 01100 % 01300 %
ZDA(2N) 100100 991701 110101 42185 7110 1142
ZD Y(4N) 100100 97114 104128 42185 2185 1114
　　1 　处理的相对生长量与对照相对生长量的比值
1 　Ratio of the relative growth of the treatment to that of the check
831 核　农　学　报 13 卷
213 　EMS 处理后的愈伤组织耐盐细胞频率的变化
经 EMS 处理后的愈伤组织的耐盐细胞频率表现出不同的变化。EMS 处理后的 ZDA
(2N)耐盐细胞频率略有增加 (表 3) ,而 EMS 处理的 ZD Y(4N) 的耐盐细胞频率或比对照稍高
(01005 %处理)或比对照低 (01010 %、01050 %处理) (表 4) 。经统计分析 ,处理后的耐盐细胞
频率没有显著高于或低于对照。
表 3 　EMS处理 ZDA( 2 N)对耐 SM16 细胞频率的影响
Table 3 　Effects of EMS2t reated ZDA (2N) on the rate of SM16 tolerant cell
EMS 浓度
Concentration of EMS
接种量
Inoculum weight
(g)
耐 SM16 细胞频率
Rate of SM16 tolerant cell
( ×10 - 6)
变幅
Range
平均值
Average
01000 % 31136 11184～11841 11458
01005 % 41756 01848～31325 11771
01010 % 41932 11357～21327 11684
01050 % 21332 11359～21488 11923
表 4 　EMS处理 ZDY( 4 N)对耐 SM12 细胞频率的影响
Table 4 　Effects of EMS2t reated ZD Y(4N) on the rate of SM12 tolerant cell
EMS 浓度
Concentration of EMS
接种量
Inoculum weight
(g)
耐 SM12 细胞频率
Rate of SM12 tolerant cell
( ×10 - 6)
变幅
Range
平均值
Average
01000 % 31428 01000～21355 11309
01005 % 41475 01280～11705 11406
01010 % 51744 01230～11293 01620
01050 % 31140 01621～11259 01941
214 　52氮胞苷对愈伤组织生长的抑制
52氮胞苷对愈伤组织有一定的抑制作用 (表 5) 。在 0102mM～0110mM 的浓度范围内 ,52
氮胞苷对愈伤组织的生长抑制程度基本相同 ,所有的愈伤组织都能生长。在高浓度 (1mM)
下 ,只有 30 %～50 %的愈伤组织块能生长 ,并且生长受到抑制。在同一浓度下 ,两种愈伤组织
受抑制程度差异没有达到统计的显著水平。
表 5 　52氮胞苷对愈伤组织生长的抑制
Table 5 　Inhibitory effects of 52 azacytidine on the growth of callus
愈伤组织
Callus
52氮胞苷的浓度　Concentration of 52azacytidine
0100mM 0102mM 0104mM 0110mM 0150mM 1100mM
ZDA(2N) 100100 71142 68157 68157 45171 22185
ZD Y(4N) 100100 78157 72185 74128 62185 40100
　　1 　处理的相对生长量与对照相对生长量的比值
1 　Ratio of the relative growth of the treatment to that of the check
215 　52氮胞苷处理后的愈伤组织耐盐细胞频率的变化
经过 52氮胞苷处理过的愈伤组织在大多数情况下都出现较低的耐盐细胞频率 ,只有 ZD Y
(4N)经过 52氮胞苷 (0102mM)处理出现较高的耐盐细胞频率 ,但处理和对照的差异没有达到
931　3 期 EMS 和 52氮胞苷处理的水稻愈伤组织对耐盐细胞频率的影响
统计上的显著水平 (表 6、表 7) 。
表 6 　52氮胞苷处理 ZDY( 4 N)对耐 SM12 细胞频率的影响
Table 6 　Effects of 52azacytidine2t reated ZD Y(4N) on the rate of SM12 tolerant cell
52氮胞苷浓度
Concentration of
52azacytidine 接种量Inoculum weight(g) 耐 SM12 细胞频率Rate of SM12 tolerant cell( ×10 - 6)变幅　Range 平均值　Average
0100mM 31428 01000～21355 11309
0102mM 41922 01733～31032 21209
0104mM 41560 01645～11543 11198
0110mM 41550 01527～11736 11161
表 7 　52氮胞苷处理 ZDA( 2 N)对耐 SM16 细胞频率的影响
Table 7 　Effects of 52azacytidine2t reated ZDA (2N) on the rate of SM16 tolerant cell
52氮胞苷浓度
Concentration of
52azacytidine 接种量Inoculum weight(g) 耐 SM16 细胞频率Rate of SM16 tolerant cell( ×10 - 6)变幅　Range 平均值　Average
0100mM 31136 11136～11841 11457
0102mM 41846 01471～11220 01795
0104mM 51124 01886～11650 11266
0110mM 41279 01000～11436 01600
3 　讨 　论
NaCl、EMS 和 52氮胞苷都能抑制愈伤组织的生长。在同一 NaCl 浓度下 , ZD Y (4N) 比
ZDA (2N) 受到更多的抑制 ,而同一浓度 EMS 或 52氮胞苷对上述两种愈伤组织的抑制作用几
乎相同。这一结果说明盐胁迫抑制愈伤组织的机制与 EMS 或 52氮胞苷抑制愈伤组织生长的
机制不同。
EMS 和 52氮胞苷对植物都有诱变作用。张成合等[2 ]用 EMS 处理小黑麦的愈伤组织 ,发
现能提高突变率 1～2 倍 ,而本实验没有得到同样的结果。52氮胞苷能引起水稻矮杆的遗传变
异[12 ] ,而本实验发现 52氮胞苷处理后的愈伤组织的耐盐细胞频率与对照相比没有显著变化。
耐盐性状是由多基因控制或者培养物中已存在很多无性系变异可解释诱变处理的愈伤组织的
耐盐细胞频率没有显著增加这一现象。
众所周知 ,植物基因组有很多碱基甲基化 ,而碱基甲基化影响基因的表达[3 ] 。52氮胞苷能
降低水稻[12 ] 、玉米[12 ] 、马铃薯[10 ]基因组的甲基化水平 ,而 EMS 能使老鼠垂体前叶肿瘤细胞
的某些序列甲基化[4 ] 。经 EMS 和 52氮胞苷处理的愈伤组织的耐盐细胞频率和对照相比没有
显著的变化 ,很可能说明细胞水平的耐盐变异与基因组的甲基化水平无关。但是 ,本实验没有
测定 52氮胞苷或 EMS 处理的愈伤组织甲基化水平的变化 ,因此愈伤组织的甲基化水平与耐
盐变异体发生的关系有待进一步的验证。
致谢 :实验使用的四倍体水稻由中国农业科学院作物所宋文昌教授提供 ,特此致谢。
041 核　农　学　报 13 卷
参 考 文 献
1 　田少华 ,等. 诱变与组织培养相结合诱发水稻耐盐突变的初步研究. 核农学报 ,1988 ,2 (2) :65～72
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3 　Doerfler W ,et al. Eukaryotic DNA methylation :facts and problems. FEBS ,1990 ,268 (2) :329～333
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5 　Hess S R ,et al. Sucrose optima for growth of salt2adaptted tobacco cells. Hort Science ,1985 ,20 :522
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INFL UENCE OF RICE ( Oryza sativa L. ) CALL US TREATED WITH
EMS OF 52AZACYTIDINE ON THE RATE OF SALT TOL ERANT CELL
Liu Piqing
( A gricult ural College , Guangxi U niverstity , Nanning 　530005)
ABSTRACT
Diploid callus [ ZDA( 2 N) ] and autotetraploid callus [ ZDY( 4 N) ] were initiated seperately
from the anther and panicle culture of the autotetraploid rice ( Oryza sativa L . ) . The pretreat2
ment of callus with EMS or 52azacytidine gave the following results :1. with the increasing con2
centration of EMS or 52azacytidine in the medium , ZDA( 2 N) and ZDY( 4 N) showed the same
pattern in the decrease of the relative growth rate , while different pattern was shown when
stressed by NaCl ;2. no signif icant change in the frequency of salt tolerant cell was found with
pretreatment of EMS or 52azacytidin to callus.
Key words :Rice ,EMS ,52azacytidine ,salt tolerant cell rate
141Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (3) :137～141