全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 062417204
太空环境诱导的草地早熟禾皱叶突变体
蛋白质组学研究
韩　蕾　孙振元　巨关升　钱永强　彭镇华
(中国林业科学研究院林业研究所Π国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘 　要 :“神舟 3 号”飞船搭载草地早熟禾 ( Poa pratensis L. )‘Nassau’干种子 ,地面种植后筛选出
皱叶突变株系 PM2 。利用蛋白质组学技术对 PM2 突变株系叶片中表达的蛋白质进行解析 (未
搭载植株为对照) ,发现基本保持不变的蛋白质点有 181 个 ,上调节表达蛋白质点有 15 个 ,下
调节表达蛋白质点有 15 个 ,失去表达蛋白质点有 116 个。选择 19 个蛋白质点进行肽质谱分
析 ,同源性查询后其中 10 个蛋白质点得到阳性结果 ,且 PM22058 为谷氨酸合成酶类似蛋白 ,
PM22175 为磷酸丙糖异构酶类似蛋白 ;CK2103 为 ATP 酶依赖型 26S 蛋白酶体类似蛋白 ;CK2330
为 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶Π加氧酶类似蛋白 ;CK2376 为硫氧还蛋白 M 前体类似蛋白 ;CK2391
为二磷酸核酮糖羧化酶类似蛋白。
关键词 :太空环境 ; 草地早熟禾 ; 皱叶突变株系 ; 蛋白质组学
PROTEOMIC ANALYSIS OF A WINNKLE2LEAF MUTANT IN Poa pratensis L.
INDUCED BY AEROSPACE ENVIRONMENT
HAN Lei 　SUN Zhen2yuan 　JU Guan2sheng 　QIAN Yong2qiang 　PENG Zhen2hua
( Research Institute of Forestry , Chinese Academy of ForestryΠKey Laboratory of Forest Cultivation , State Forestry Administration , Beijing ,100091)
Abstract :The dry seeds of Poa pratensis L. variety‘Nassau’were carried by spaceship SZ23 as treatments and the
seeds which on the earth as CK. A winnkle2leaf mutant which named PM2 was selected for the analysis. Proteins
expressed in leaf of CK and PM2 were compared and profiled with the techniques of proteomics. There are 181
proteins maintained no changes , 15 proteins were up2regulated and 15 proteins were down2regulated , and 116
proteins were lost . 19 proteins were chosen to make pdypeptide fingerprint and homelogy analysis. It indicated that
,10 of them were positive results and protein PM22058 was close to glutamine synthetase , PM22175 was close to
triosephosphate isomerase , CK2103 was close to 26S proteasome regulatory complex ATPase , CK2330 was close to
ribulose 1 ,5 biphosphate carboxylaseΠoxygenase , CK2376 was close to thioredoxin M precursor , CK2391 was close to
ribulose bisphosphate carboxylase.
Key words :aerospace condition ; Poa pratensis L. ; winnkle2leaf mutant ; protemics
收稿日期 :2005207211
基金项目 :国家“863”计划 :优质抗逆草坪草早熟禾等新品种选育 (2002AA241061)
作者简介 :韩　蕾 (1972 - ) ,女 ,黑龙江依兰人 ,助理研究员 ,博士 ,从事观赏植物遗传改良方面的研究。孙振元为通讯作者 , Email :
sunzy @caf . ac. cn。
利用太空的特殊环境 (空间宇宙射线、微重力、高真空、微磁场等) 对农作物种子的诱变作用来产生
变异 ,再返回地面选育新种质、新材料和培育新品种的技术是一种有效的新途径[1～3 ] 。但目前对观赏植
物的空间生物学研究较少 ,且未涉及机理研究[4 ] ,Wilkins & Williams[5 ] 提出了蛋白质组 (proteome) 的概念
714　核 农 学 报　2005 ,19 (6) :417～420Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
后 ,蛋白质组学研究飞速发展。但其研究在草坪植物上开展的较少 ,更未见到太空环境处理后获得的草
坪植物突变株系的蛋白质组学研究。
草地是六大自然资源之一[6 ] ,发展草业对改善生态环境维护生态平衡起着决定性的作用[7 ] 。草地
早熟禾是重要的冷季型草坪草 ,在我国北方地区广泛应用。目前我国草坪建植中所用的草地早熟禾种
子全部由国外引进 ,因此草地早熟禾育种工作在我国更为重要。
叶片泡状细胞是禾本科植物叶片上表皮所具有的一种特殊结构 ,是这类植物最大的旱生特性。当
水分供应不足时 ,泡状细胞首先失水收缩 ,使叶片卷曲成筒状以减少蒸腾作用 ;当有水分供应时 ,细胞充
水 ,使叶片展平 ,故泡状细胞又称为运动细胞。研究认为 ,泡状细胞参与叶片的内卷和折叠运动与叶片
展开角度密切相关[8 ,9 ] 。为探求空间环境对草坪植物诱变的遗传基础 ,本研究以“神舟 3 号”飞船搭载草
地早熟禾 ( Poa pratensis L. )品种‘Nassu’干种子经地面筛选后获得的一个运动细胞异常的皱叶突变株系
(PM2 ) [11 ,12 ]为材料 ,进行了蛋白质组学的研究。
1 　材料与方法
111 　材料
本研究以“神舟 3 号”飞船搭载草地早熟禾 ( Poa pratensis L. ) 品种‘Nassu’干种子经地面筛选后获得
的运动细胞异常的皱叶突变株系 ( PM2 ) [10 ,11 ] 为实验材料。该突变株系叶片皱缩扭曲 ,在主脉和细脉处
均有异常增大的表皮细胞 ,即泡状细胞存在 ;叶色浓绿 ,矮化 ,且分蘖数较多。以未搭载正常植株为对照
(CK) 。
112 　方法
11211 　总蛋白的提取　准确称取 CK和 PM2 植株第 1 片展开叶各 013g ,于液氮中冷藏备用。总蛋白提
取参考 Salekdeh 等[12 ]的方法。
11212 　蛋白质定量　蛋白质定量参见 Bradford[13 ]的方法。
11213 　二维( 2D)电泳及染色　第 1 维为固相化 pH梯度等电聚焦电泳 ,18cm 长固化相 pH 梯度 (4～7) ,
胶条由 Amersham 公司购得。胶条得膨胀液为 8molΠL 尿素 ,4 %CHAP (WΠV) 。点样量 600μg。等电聚焦
程序如下 :20 ℃溶胀 12h ,500v 聚焦 1h ,1000v 聚焦 1h ,8000v 聚焦 4h。等电聚焦电泳仪为 Ettan IPGphorTM
(Amersham Bioscience) 。第 2 维为 SDS2PAGE垂直平板电泳。分离胶浓度为 15 %。30mA 电泳 30min ,使
蛋白质电泳出胶条 ,然后以 60mA 电泳约 3h。电泳仪为 ETTAN Ⅱ (Amersham Bioscience) 。采用 Colloidal
考马斯亮兰方法对凝胶进行染色。染色时间为 3～4h ;脱色液含有 5 %甲醇、7 %冰醋酸和 88 %蒸馏水 ,
脱色时间 4～5h。
11214 　蛋白质的鉴定和分析　利用 Power look Ⅲ扫描仪 (Amersham Bioscience) 对脱色后的凝胶进行扫
描 ,ImageMaster4101 图像分析软件 (Amersham Bioscience) 对扫描图像进行处理。同一处理的二维电泳至
少重复 3 次 ,将获得的 3 个电泳图进行整合 ,制成标准电泳图 ,将标准电泳图的光学密度图像转化为数
字信号 ,进行比较和分析 ,以蛋白质的数字信号相差超过 2 倍确定上调节表达和下调节表达 ,相差低于
015 倍为基本保持不变。
蛋白质点的切取及胶内酶解的具体方法为 :将目的蛋白质点沿染色边缘切下 ,同时取非蛋白质区域
的胶块作为空白对照。经脱色、脱水 (50 %的乙腈) ,10mmolΠL 的 DTT于 56 ℃水浴还原 1h ,55mmolΠL 的碘
代乙酰胺于黑暗处室温烷基化 45min。分别用 25mmolΠL 的碳酸氢氨、50 %的乙腈漂洗、脱水 ,在真空离
心机中干燥。而后加入 25μl 修饰的胰蛋白质酶溶液 ,37 ℃酶解过夜。在振荡的条件下 ,释放的肽段用
含有 215 %三氟乙酸 (TFA)的 50 %的乙腈抽提。
质谱分析的具体方法为 : 二维电泳胶点的酶解肽段通过 Autoflex2MALDI2TOF2MS 系统 (Bruker
Corp . )进行分析 ,加速电压 20kV。质谱仪为 ABI公司 Voyager DE2PRO。
814 核　农　学　报 19 卷
图 1 　草地早熟禾突变体 PM2 叶片蛋白
质表达的双向电泳分析
Fig. 1 　2D2PAGE of proteins extracted from leaf
of Poa pratensis L. mutant PM2
　　对得到的肽谱图进行内部校对 ,去除胰蛋白
酶的自动降解峰、角蛋白的特征峰、以及背景杂质
峰 ,将校准后的谱图转化为单同位素峰 ,选取谱图
中信噪比较好 ,分辨率较高 ,离子峰相对较高且处
于 1000～3000Da 之间的肽段进行同源性查询。
同源性查询采用 ExPASy 查询工具 ( http :ΠΠau.
expasy. org) ,数据库为 Swiss2Port 和 TrEMBL。
2 　结果与分析
211 　蛋白质的分离和鉴定
二维凝胶电泳展示 ,在草地早熟禾对照和突
变株系 PM2 叶片中分别鉴定出 327 个和 211 个蛋
白质点 (图 1) 。与对照相比 ,突变株系叶片基本
保持不变的蛋白质点有 181 个 ,可能是与草地早
熟禾叶片基本代谢有关的蛋白质 ,即“管家蛋白
质”(house keeping proteins) ;另外 ,上调节表达蛋白
质点有 15 个 ,下调节表达蛋白质点有 15 个 ,不表
达蛋白质点有 116 个。
212 　蛋白质的分析和同源性鉴定
通 过 ImageMaster4101 图 像 分 析 软 件
(Amersham Bioscience)对扫描图像进行处理 ,并结
合经验分析 ,确定 对其中仅在对照中表达的 14
个蛋白质点 ,仅在突变株系中表达 3 个蛋白质点 ,
在突变株系中下调节表达的 2 个蛋白质点等 19
个蛋白质点进行肽质谱分析。经同源性查询后发
现有 10 个蛋白质点具有阳性结果 (见表 1) 。
其中 PM22058 为谷氨酸合成酶类似蛋白 ,
PM22175 为磷酸丙糖异构酶类似蛋白 ; CK2103 为
ATP 酶依赖型 26S 蛋白酶体类似蛋白 ;CK2330 为
1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶Π加氧酶类似蛋白 ; CK2
376 为硫氧还蛋白 M 前体类似蛋白 ;CK2391 为二
磷酸核酮糖羧化酶类似蛋白。其它 4 个蛋白质在已有的数据库中未能找到相近的蛋白质 ,认为是未知
功能蛋白或未知蛋白。
3 　讨论
本实验首次对太空环境诱变后的草坪植物进行了蛋白质组学的研究。我们在实验中得到的 19 个
蛋白质点仅有 6 个点与已知蛋白相匹配。其中 CK2330 和 CK2391 为 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶Π加氧酶
(Rubisco)类似蛋白。Rubisco 是处于光合碳还原和光合碳氧化二个方向相反但又相互关联的循环交叉
点上 ,它对净光合速率起着决定性的影响 ,是光合碳同化的关键酶[14 ] 。CK2376 为硫氧还蛋白 ( Trx) M 前
体类似蛋白。植物体中的 Trx 最初是在叶绿体中发现的 ,被认为是光合作用中一些关键酶的活化调节
蛋白[15 ] 。草地早熟禾 PM2 株系光合特性的测定结果显示其光合能力与 CK相比明显降低[16 ] ,这可能与
CK2330、CK2391 和 CK2376 三个蛋白质点的缺失有关。
914　6 期 太空环境诱导的草地早熟禾皱叶突变体蛋白质组学研究
表 1 　空间环境处理后草地早熟禾 PM2 突变株系叶片蛋白质的肽质谱指纹分析( NCBI数据库查询)
Table 1 　NCBI database search results of proteins in Poa pratensis L. PM2 after carried by SZ23
X分离的蛋
白质点
query
proteins
等电点a
pIa
分子量a
Mra (Da)
覆盖率
sequence
coverage rate
( %)
匹配的
多肽数
peptide
matches
注册号码b
accession
numberb
匹配的蛋白质名称
matched proteins
该蛋白质所属植物名称
name of the plants
PM22058 6142 46330 17 8 gi434334 Glutamine synthetase Zea mays
PM22175 5124 27138 26 7 gi407525 Triosephosphate isomerase Secale cereale
CK2027 6155 68639 10 8 gi51536102 Putative formate2tetrahydrofolate ligase Oryza sativa(japonica cultivar2group)
CK2103 5162 38976 29 8 gi42602319 26S proteasome regulatory
complex ATPase RPT3 Zea mays
CK2175 7123 29789 27 9 gi40743982 Hypothetical protein AN326312 Aspergillus nidulans FGSC A4
CK2330 6111 22016 26 10 gi57283420 Ribulose 1 ,5 biphosphate
carboxylaseΠoxygenase Lachnaea penicillata
CK2364 5158 11794 75 6 gi26451387 Unknown protein Arabidopsis thaliana
CK2376 8167 19690 34 11 gi56709480 Thioredoxin M precursor Triticum turgidum
subsp . Durum
CK2391 6129 49493 13 7 gi603087 Ribulose bisphosphate carboxylase Zamia floridanal
CK2394 5196 18831 43 6 gi53680922 Resistance protein2like protein Poncirus trifoliate
注 :a :理论推算出的 pI 和 Mr ;b :数据库中的注册号码
a : calculated value of pI and Mr ; b : accession number in database
　　太空环境是复合了诸多诱变因素的复杂体系 ,是地球表面无法模拟的特殊诱变源 ,它产生的生物学
效应也是多方面的 ,很难明确是太空环境的哪一个独立因素诱发了植物体或细胞的突变。上述实验结
果从分子水平上验证了太空环境作用的特殊性。研究分析突变体中这些特异表达蛋白调控生命过程的
关键蛋白质的氨基酸序列信息 ,揭示其基因组信息 ,希望最终能为转基因育种提供理论依据和物质基
础。
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024 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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