全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 052376205
耐辐射球菌清除活性氧自由基及
对 DNA 的保护作用
田　兵　徐步进　华跃进
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,农业部核农学重点实验室 ,浙江 杭州　310029)
摘 　要 :用化学发光法分析了耐辐射球菌 ( D . radiodurans) 的两个菌株 (R1、KD8301) 和大肠杆菌
对超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢的清除能力。通过羟基自由基诱导的 DNA 氧化
损伤化学发光模型考察了耐辐射球菌细胞提取物对自由基氧化导致 DNA 氧化损伤的保护作
用。结果表明 ,耐辐射球菌提取物能显著清除 O -2·、H2O2 和·OH ,清除能力明显高于大肠杆菌 ,
并能有效地防止自由基所致 DNA 氧化损伤 ,表现出超强的抗氧化和耐辐射能力 ,这归因于耐
辐射球菌中具有较高的抗氧化酶活性。
关键词 :耐辐射球菌 ;活性氧自由基 ;辐射 ;DNA 损伤 ;抗氧化酶
FREE RADICALS SCAVENGING EFFECTS OF Deinococcus radiodurans
PREVENTS OXIDATIVE DAMAGE TO DNA
TIAN Bing 　XU Bu2jin 　HUA Yue2jin
( Institute of Nuclear2Agricultural Sciences , Key Lab of Nuclear2Agricultural Sciences ,
Ministry of Agriculture of P. R . China , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310029)
Abstract :Scavenging effects of Deinococcus radiodurans R1 , KD8301 and Escherichia coli against O -2·, H2O2 and
·OH were investigated with chemiluminescence method. Hydroxyl radical mediated DNA damage chemiluminiscence
system was used to determined whether the extracts from Deinococcus radiodurans had protective effect on free
radical induced oxidative damage to DNA. The extract from Deinococcus radiodurans showed higher activities in all
experiments than extract from Escherichia coli , suggesting that it had stronger antioxidant activities and
radioresistance. It is indicated that the strong scavenging effects on free radical and protective effects on DNA of
Deinococcus radiodurans are resulted from its higher activities of antioxidant enzymes.
Key words : Deinococcus radiodurans ; oxygen free radicals ; irradiation ; DNA damage ; antioxidant enzyme
收稿日期 :2003211209
基金项目 :浙江省教育厅科研项目 (20040172)
作者简介 :田兵 (1970～) ,男 ,博士后 ,从事耐辐射球菌抗辐射、抗氧化机制研究。E2mail :tianbing @zju. edu. cn活性氧自由基是指生物体有氧代谢过程中产生的或者在有外界物理、化学因素 (辐射、化学物质)诱导下形成的化学性质极其活泼的物质 ,它们对核酸、蛋白质等生物大分子具有强烈的损伤作用 ,甚至引起基因突变而导致癌症。已发现活性氧自由基的氧化损伤与肿瘤、衰老、心脑血管等疾病的发生有密切关系。耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans)具有超强的耐辐射能力和DNA 修复能力 ,经 15kGy 辐照仍然能够生存 ,而且不发生任何变异 ,比大肠杆菌的抗辐射能力高出 200 多倍[1 ] 。辐射引起细胞内水辐解 ,形成活性氧自由基 ,攻击生物大分子 ,DNA 的辐射损伤主要是由水辐解自由基的间接作用所引起的[2 ] 。因此 ,活性氧自由基对生物大分子氧化损伤是导致辐射损伤的一个重要原因 ,耐辐射球菌的超强耐辐射
673 　核 农 学 报　2004 ,18 (5) :376～380Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
能力与其清除自由基的能力应该存在着密切联系。超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (CAT) 是生物
体中最重要的抗氧化酶 ,SOD 的生理作用是将超氧阴离子自由基通过歧化反应生成过氧化氢和氧分子 ,
而 CAT可以将过氧化氢转变成水和氧 ,从而防止活性氧自由基对机体中生物大分子 (DNA、蛋白质等)
的氧化损伤。迄今为止 ,还没有耐辐射球菌清除活性氧自由基能力和对生物大分子 (DNA) 的保护作用
之间关系的研究报道。本研究的目的是考察耐辐射球菌对清除超氧阴离子自由基 O-2·、过氧化氢 H2O2
和羟基自由基·OH的能力 ,研究它对由自由基氧化所致的 DNA 损伤的保护作用 ,分析耐辐射球菌抗氧
化酶 (SOD、CAT)在其清除自由基和保护 DNA 中的作用。
1 　材料与方法
111 　菌种及其培养
耐辐射球菌野生型菌株 ( D . radiodurans R1 , AS11633)来自中国科学院微生物资源中心和耐辐射球
菌野生型菌株 KD8301 (本实验室保藏) 。大肠杆菌 ( Escherichia coli , AS111017)由浙江大学生物工程与食
品学院发酵教研室提供。耐辐射球菌生长于 TGY培养基 [ 5gΠL 蛋白胨 (Difco) , 3gΠL 酵母提取物 ,1gΠL
葡萄糖 ]32 ℃培养 ;大肠杆菌生长于 LB 培养基 [ 10gΠL 蛋白胨 (Difco) , 5gΠL 酵母提取物 ,10gΠLNaCl ]30 ℃
培养。
112 　细胞提取物的制备
取菌液 50ml 离心 (5000rpm ,4 ℃) 10min ,收集菌体沉淀。用 50mM PBS (pH710) 洗涤两次 ,离心收集
菌体细胞。按每克湿菌体加入 3 倍体积缓冲液制成菌悬液 ,超声波破碎细胞 (耐辐射球菌在 600W 功率
下处理 8min ,大肠杆菌在 400W 功率下处理 4min) ,每处理 2s 间隔 4s。再在菌液中加入终浓度为
0101mgΠml 的核酸酶 RnaseA ,于 37 ℃下温浴处理 2h。4 ℃下离心 (12000 rpm) 20min ,收集上清液 ,保存于
冰上待用。
113 　测定方法
11311 　菌体干重 　用预先干燥称重的 115ml 离心管取 1ml 培养液在 5000rpm 下离心 10min 后得沉淀菌
体 ,用 50mM pH710 的磷酸缓冲液和双蒸水各洗涤菌体一次 ,然后真空干燥 ,称重并计算单位体积培养
液菌体干重 (mgΠml) 。
11312 　菌体清除活性氧自由基的作用 　采用 BPCL 型超微弱化学发光测量仪 (中国科学院生物物理所
出品)测试细胞提取物清除自由基的能力。以下为 3 种自由基产生体系和清除作用分析的方法。
(1)清除超氧阴离子自由基 (O -2·)的作用[3 ] :采用邻苯三酚自氧化作为超氧阴离子自由基产生体系 ,
以鲁米诺为发光剂 ,O -2·激发鲁米诺 ,鲁米诺由激发态返回到基态时产生化学发光 ,当有自由基清除剂存
在时 ,抑制了化学发光。0105molΠL pH1012 Na2 CO32NaHCO3缓冲液 (含 011mmolΠL EDTA) 用前现配 ,用于
配制邻苯三酚 - 鲁米诺体系时 ,与 1mmolΠL 鲁米诺以 2∶1 (VΠV) 混合。测量时 ,向发光池中注入 10μl 不
同浓度的样品 (以样品缓冲液为对照) ,然后注入 31125 ×10 - 4 molΠL 邻苯三酚 011ml ,最后加入鲁米诺和
碳酸缓冲液混合物 017ml 启动反应 (30 ℃) ,间隔 3s 记数光强度 ,测定 200s 的总发光积分强度 ,本底发光
强度为未加邻苯三酚时的发光值。每组实验重复 3 次得平均值。清除率 (Scavenging activity) 由公式 (1)
计算得出 :
清除率 ( %) = [ (CLcontrol - CL0 ) - (CLsample - CL0 ) ]Π(CLcontrol - CL0 ) (1)
　　式中 ,CLcontrol为对照发光值 ;CL0 为本底发光值 ;CLsample为样品发光值。
(2)清除过氧化氢 (H2O2 )的作用[4 ] :采用 H2O2 激发鲁米诺产生化学发光的反应体系。取样品或缓
冲液 (对照) 012ml、50mM 磷酸缓冲液 (pH810) 016ml 和 1 % H2O2 012ml ,混匀 ,37 ℃温育 20min ,取上述反
应液 016ml 加入到发光仪样品池中 ,加入 1mmolΠL 鲁米诺溶液 0115ml 启动发光反应 ,反应温度 37 ℃,间
隔 2s 记数 ,测定 200s 的总发光积分强度 ,本底发光强度为未加 H2O2 时的系统发光值。清除率的计算公
式同公式 (1) 。
773　5 期 耐辐射球菌清除活性氧自由基及对 DNA 的保护作用
(3)清除羟基自由基 (·OH)的作用[5 ] :羟基自由·OH由 Fenton 反应体系 (Fe2 + ΠH2O2 )产生。在样品池
中加入 014mmolΠL FeSO450μl , 115 % H2O2 50μl ,30 ℃下保温 2min ,加入 50μl 样品或样品缓冲液 (对照) ,最
后加入 011mmolΠL 鲁米诺液 016ml ,立即混匀 ,测定发光强度。反应温度 30 ℃,间隔 6s 记数 ,测定 200s 的
总发光积分强度 ,本底发光强度为未加 H2O2 时的系统发光值。按公式 (1)计算清除率。
11313 　菌体抗氧化酶活性测定 　SOD 酶活性采用黄嘌呤氧化酶法分析[6 ] 。CAT酶活性按 Beers & Sizers
法测定[7 ] 。
11314 　菌提物对自由基致 DNA 损伤的保护作用[8 ] 　Cu -2 + Vc 在 H2O2 作用下生成·OH ,·OH攻击损伤
DNA ,与化学发光剂邻菲罗林 (Phen) 产生化学发光现象 ,发光强度与损伤 DNA 的量成正比。在样品池
中加入菌提物样品 100μl (空白对照加双蒸水) ,再加入 2 ×10 - 3 molΠL 的 Phen 70μl , 2 ×10 - 3 molΠL 的 Vc
70μl , 2 ×10 - 4 molΠL CuSO4 100μl , 011molΠL 醋酸盐缓冲液 (pH5 ,5) 440μl , 50μgΠml 小牛胸腺 DNA 20μl ,测
定本底发光强度 10s 后 ,加入 018M H2O2 200μl 启动反应 ,反应总体积为 1ml。间隔 10s 记数 ,计算 800s
内的发光积分强度。抑制率 Ⅰ( %)的计算也由公式 (1)得出。
2 　结果与分析
211 　清除超氧阴离子自由基( O -2·)的作用
化学发光法分析结果 (图 1) 表明 ,菌体对超氧阴离子自由基清除作用与提取物浓度有关。在 0～
16mgΠml 范围内 ,耐辐射球菌的清除能力明显高于大肠杆菌 ,R1 和 KD8301 的清除率比较接近。菌株 R1
和 KD8301 浓度为 2mgΠml 时 ,清除率分别为 51141 %和 50140 % ,高于大肠杆菌 (11187 %) 。菌株 R1 和
KD8301 对超氧阴离子自由基清除作用的半清除剂量 (清除率达到 50 %时所需的提取物浓度) 为 1199
mgΠml ,大肠杆菌为 1118 mgΠml。
212 　清除过氧化氢 H2 O2 的作用
图 2 表明 ,耐辐射球菌提取物在低浓度 (0～015mgΠml)条件下 ,能够明显地清除 H2O2 ,而大肠杆菌只
有在较高浓度 ( > 2mgΠml) 下才表现出活性。耐辐射球菌 R1 和 KD8301 的半清除剂量 (0113mgΠml、
0119mgΠml)明显高于大肠杆菌 (3158mgΠml) 。
图 1 　耐辐射球菌 R1、KD8301 和大肠杆菌清除 O -2·的作用
Fig. 1 　O -2·scavenging activity of cellular
preparations of D . radiodurans and E. coli
图 2 　耐辐射球菌 R1、KD8301和大肠杆菌清除 H2O2 的作用
Fig. 2 　H2O2 scavenging activity of cellular
preparations of D . radiodurans and E. coli
213 　清除羟基自由基的作用
Fenton 反应形成的羟基自由基 (·OH)与鲁米诺的发光反应不同于 H2O22鲁米诺体系 ,在 12～18s 处
形成发光峰后发光强度缓慢下降。菌体对·OH 清除率和提取物浓度之间存在一定量效关系 ,如图 3。
在 0～0125mgΠml 范围内 ,清除率随着浓度增加而升高 ,之后清除率变化不大。R1 和 KD8301 对·OH 的
873 核　农　学　报 18 卷
半清除剂量率分别为 010597mgΠml、01101mgΠml ,而大肠杆菌的则超过了 1mgΠml ,表明耐辐射球菌的清除
羟基自由基的作用明显高于大肠杆菌。
214 　菌体超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性比较
对菌提取物中的 SOD 和 CAT酶活性进行了分析和比较 ,结果见图 4。
耐辐射球菌 R1 和 KD8301 的 CAT酶活性显著高于大肠杆菌 ,分别为大肠杆菌的 16101 倍和 14199
倍。耐辐射球菌 R1 和 KD8301 的 SOD 酶活性也高于大肠杆菌 ,分别为大肠杆菌酶活性的 5149 倍和
5135 倍。
图 3 　耐辐射球菌 R1、KD8301 和
大肠杆菌清除·OH的作用
Fig. 3 　·OH scavenging activity of cellular
preparations of D . radiodurans and E. coli
图 4 　耐辐射球菌 R1、KD8301 和大肠杆菌
SOD、CAT酶活性比较
Fig. 4 　Comparison of activities of SOD and CAT
in cellular preparations
图 5 　化学发光法分析耐辐射球菌对自由
基氧化损伤 DNA 的保护作用
Fig. 5 　 Inhibition of cellular preparations of D .
radiodurans and E. coli on the chemiluminescence of
DNA oxidative damage
215 　耐辐射球菌细胞提取物对 DNA 氧化损伤的保
护作用
利用化学发光法分析了耐辐射球菌对由羟基自
由基氧化导致的 DNA 损伤的影响 ,羟基自由基由
Fenton 体系产生 ,氧化 DNA 后形成核酸自由基 ,并与
发光剂反应在 450～500s 处形成发光峰 ,如图 5 中的
对照发光峰。菌提取物的加入使发光峰向前移动 ,
并使发光强度明显降低。R1 提取物 (2mgΠml) 对 DNA
氧化损伤的抑制率达到 82199 % ,略高于 KD8301 的
71172 % ,两者均明显高于大肠杆菌的抑制能力
(6198 %) 。
3 　讨论
H2O2 是一种危害性较大的活性氧 ,它还是形成
其他种类自由基的重要原因。生物体在长期进化中形成了较完善的适应机制和防御体系 ,包括抗氧化
酶和非酶抗氧化成分。超氧化物歧化酶 SOD 能够催化超氧阴离子自由基的歧化反应生成 H2O2 ,过氧化
氢酶和过氧化物酶的作用则是将 H2O2 转化为对机体无害的 H2O 和 O2 。本研究结果表明 ,与大肠杆菌
比较 ,耐辐射球菌具有较强的自由基清除能力 ,尤其是对过氧化氢和羟基自由基的清除作用显著。耐辐
射球菌对超氧阴离子自由基和羟基自由基的超强清除能力反应了它具有较高的 SOD 和 CAT活性 ,这与
两种酶活性的分析结果相一致。
973　5 期 耐辐射球菌清除活性氧自由基及对 DNA 的保护作用
·OH 通过 Fenton 型的 Haber2weiss 反应形成 :
Fe3+ + O2 · Fe2+ + O2
Fe2+ + H2O2 Fe3+ +·OH + OH-
H2O2 + O-2 · ·OH + OH- + O2
　　因此 ,在菌体中羟基自由基的清除作用主要是通过 SOD 和 CAT清除了超氧阴离子自由基和过氧化
氢 ,从而阻断羟基自由基产生的来源 ,抑制它的形成和对 DNA 的氧化损伤。从化学发光动力学曲线结
果得出 ,菌提取物对 Fenton 反应形成的·OH 发光信号的作用不同于其他两种自由基 ,菌提物对发光峰
处的抑制作用比较明显 ,可能是由于菌提取物能够络合部分 Fenton 反应中起催化作用的金属离子。耐
辐射球菌中的脂溶性类胡萝卜素也可以清除部分 H2O2 和·OH[9 ] ,但研究表明类胡萝卜素主要作用对象
是单线态氧[10 ] ,而且本研究中的所用的菌提物是水提取液 ,因此脂溶性的类胡萝卜素影响不大。有关
菌体类胡萝卜素和抗氧化酶之间的协同作用关系 ,还有待进一步研究。自由基对机体的主要损伤是破
坏生物大分子的结构和功能 ,羟基自由基对 DNA 的氧化损伤能够导致碱基突变和链的断裂 ,可以引发
碱基错配和基因变异。由于 DNA 的氧化损伤是由于 Fenton 反应形成的羟基自由基攻击产生的 ,菌提取
物的抑制作用主要是归因于分解 H2O2 并抑制羟基自由基形成的过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶
(SOD)的作用。
本研究用化学发光法考察了耐辐射球菌的清除 O -2·、H2O2 和·OH 的作用 ,证明耐辐射球菌对 DNA
氧化损伤的化学发光强度抑制作用明显 ,从自由基生物学的角度研究了耐辐射球菌的耐辐射能力、自由
基清除能力和抗氧化酶活性存在紧密的联系。自由基清除作用作为菌体的重要防御体系是耐辐射球菌
的耐辐射特性中的重要方面。
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