全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 022099204
蝴蝶兰类圆球茎的化学诱变试验
陈　超　王桂兰　乔永旭　张莉敏
(唐山师范学院生物科学技术系 ,河北 唐山　063000)
摘 　要 :用不同浓度的甲基磺酸乙酯 ( EMS)和叠氮化钠 (NaN3 )对蝴蝶兰类圆球茎 (PLB)作不同时间处理。
结果显示 : EMS 和 NaN3 均可使部分 PLB 白化或褐化并逐渐致死。014 %EMS 接近 PLB 半致死剂量。
PLB 切片观察发现 :用 EMS 和 NaN3 处理均可使细胞体积增大 ,细胞形状改变 ,细胞质浓缩。较高浓度
NaN3 处理的 PLB 细胞中出现晶体物质、双核、畸形核和核仁丢失等现象。较高浓度 EMS 处理的 PLB 细
胞中出现微核、畸形核、多核、核破裂和核仁丢失等现象。同浓度的同种诱变剂随处理时间的增加材料
的变异程度有增大趋势 ,但不很显著。EMS 比 NaN3 的诱变处理效果好。015 %EMS 可作为创造蝴蝶兰
PLB 突变体的参考浓度。
关键词 :蝴蝶兰 ;类圆球茎 ;化学诱变
THE PLB CHEMICAL INDUCED MUTAGENESIS AND REGENERATION OF Phalaenopsis
CHEN Chao 　WANG Gui2lan 　QIAO Yong2xu 　ZHANGLin2min
( Department of Biological Science and Technology , Tangshan Teacher’s College , Tangshan , Hebei 　063000)
Abstract :The PLB of Phalaenopsis was treated by EMS and NaN3 with different concentration and different time . The results
showed that EMS and NaN3 could made parts of the PLB grow white and brown , and killed them gradually. 014 % EMS was
close to the LD50 of the PLB. Microspores studies showed that EMS or NaN3 treatment augmented cell volume , altered cell
shape and concentrated cytoplasm. In the treatment of higher concentration of NaN3 , some cells appeared crystalloid , two
nuclei , abnormal nucleus , nucleolus losing. Treated by higher concentration of EMS , some cells appeared micronuclei ,
abnormal nucleus , poly nuclei , broken nucleus , and nucleolus losing. The same mutagen in the same concentration could
increase the ratio of mutagen to PLB with the extended time. EMS was better than NaN3 in effect . 015 %EMS could be acted
as the reference concentration to create the mutants of Phalaenopsis .
Key words : Phalaenopsis ; protocorm2like2bodies (PLB) ; chemical induced mutagenesis
收稿日期 :2005207204
基金项目 :河北省科技厅生物工程项目 (04547008 D22)
作者简介 :陈　超 (1966 - ) ,男 ,天津人 ,教授 ,从事植物细胞工程方面的研究。Email :chchao410 @sina. com ;电话 :0315 3863160
　　蝴蝶兰 ( Phalaenopsis hybrid) 花朵形似蝴蝶 ,颜色
艳丽 ,姿态高雅 ,深受世界各国人民的喜爱 ,是家庭盆
栽高档观赏花卉品种 ,在热带兰中素有“兰花皇后”的
美誉。通过花卉育种专家的杂交育种培育 ,目前全世
界的蝴蝶兰栽培品种已有 530 个左右[1 ] 。对蝴蝶兰组
织培养的研究已经基本成熟[2～4 ] 。早期的诱变技术多
集中于辐射诱变 ,但其对染色体伤害较大 ,致死突变较
多。化学诱变具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤
小、突变率高等特点 ,近年来成为诱变的主流方法[5 ] 。
目前化学诱变主要应用于对农作物的处理 ,再通过多
世代对突变体进行选择和鉴定 ,直接或间接地培育成
生产上能利用的农作物品种[6 ] 。观赏植物上化学诱变
应用较多的例子是秋水仙素诱导多倍体[7 ,8 ] ,但其他诱
变剂的应用尚少见报道。本试验将组织培养与化学诱
变技术相结合 ,通过液体浸泡法用不同浓度的 EMS 和
NaN3 对类圆球茎作不同时间处理 ,获得类圆球茎的突
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变体并再生成苗。与传统杂交育种选育蝴蝶兰新品种
相比 ,大大减轻了工作量 ,加快了选育进程 ,拓宽了蝴
蝶兰新品种选育的思路。
1 　材料与方法
111 　材料
蝴蝶兰品种 PRD640 无性系的类圆球茎 ( The PLB
of Phelaeopsis) ,由唐山师范学院细胞工程室提供。
112 　诱变剂及培养基
诱变剂 : EMS(甲基磺酸乙酯 ,美国 SIGMA 产品) ;
NaN3 (叠氮化钠 ,上海化学试剂采购供应站采购 ,化学
纯) ,均用 0106molΠL 磷酸缓冲液配制 ,pH518。配好
后 ,111kg/ cm2 湿热灭菌 17min。
再生培养基 :花宝 1 号 (7 :6 :19) 3gΠL + 胰蛋白 2gΠ
L + 活性炭 1gΠL + 蔗糖 20gΠL + 琼脂 8gΠL + 香蕉汁
10 % ,pH514。
113 　PLB 诱变处理
选取生长旺盛 ,大小基本均匀的 PLB ,在超净工作
台上用镊子将其单个剥离 ,用以上 2 种诱变剂的不同
浓度进行处理。EMS 处理浓度为 :012 %、013 %、014 %
和 015 % ,处理时间为 :4、6 和 8h ,处理后用 0106molΠL
磷酸缓冲液冲洗 3～5 次 ;NaN3 处理浓度为 :2、3、4 和
5mmolΠL ,处理时间为 : 4、6 和 8h ,处理后用 0106molΠL
磷酸缓冲液冲洗 3～5 次 ;以 0106molΠL 磷酸缓冲液处
理 6h 作为对照。
处理后取出大小相同的 PLB 接种到再生培养基
上 ,每瓶接 5～10 个 PLB ,每个处理重复 4 次 ,放在
25 ℃( ±2 ℃) ,光照每天 10 - 12h ,光强 1500～2000lx 下
培养 ,使 PLB 萌发成苗。定期统计白化率、褐化率和
死亡率。
培养 1 个月后 ,取经 014 % EMS 和 4mmolΠL NaN3
处理 4、6 和 8h ,经 015 %EMS 和 5mmolΠL NaN3 处理 6h
的 PLB ,用卡诺固定液固定 24h ,爱氏苏木精整染 46h ,
1 % 氨 水 返 兰 1h , 采 用 常 规 石 蜡 切 片 法 制 片 ,
LEICA2015 型石蜡切片机切片 ,厚度 4μm ,脱蜡后 ,加
拿大树胶封片 ,MoticDMB52223I25 型数码显微镜 (配
MoticPro 310 软件) 观察照相。统计微核率 (微核数/
100 个形态完整、核明显的间期细胞) 。
2 　结果与分析
211 　不同处理对 PLB 致死率的影响
表 1 　EMS对 PLB 的诱变结果
Table 1 　The results of PLB induced mutagenesis by EMS
浓度
concentration
( %)
诱变时间
induced
mutagenesis
time (h)
诱变 PLB 数
No. of PLB
induced
mutagenesis
3 种诱变结果所占比例
proportion of three
results induced mutagenesis
白化率 ( %)
albino ratio
褐化率 ( %)
brown ratio
死亡率 ( %)
death ratio
4 37 0100 8111 10181
012 6 40 0100 12150 12150
8 37 2170 16122 16122
4 44 0100 22173 22173
013 6 38 0100 28168 28168
8 46 15122 19157 34179
4 37 36136 0100 36136
014 6 31 38171 9168 48139
8 41 27103 27103 54105
4 26 0100 15138 15138
015 6 38 18142 5126 23168
8 27 11111 14181 25193
CK Π 43 0100 2133 2133
表 2 　NaN3 对 PLB 的诱变结果
Table 2 　The results of PLB induced mutagenesis by NaN3
浓度
concentration
( %)
诱变时间
induced
mutagenesis
time (h)
诱变 PLB 数
(个)
No. of PLB
induced
mutagenesis
3 种诱变结果所占比例
proportion of three
results induced mutagenesis
白化率 ( %)
albino ratio
褐化率 ( %)
brown ratio
死亡率 ( %)
death ratio
4 41 0100 4188 4188
2 6 42 7114 4176 11190
8 42 11190 7114 19105
4 30 0100 20100 20100
3 6 27 14181 3170 18152
8 24 29117 4117 33133
4 36 7150 17150 25100
4 6 40 8133 25100 33133
8 39 23108 17195 41103
4 25 8100 16100 24100
5 6 36 11111 30156 41167
8 27 29163 14181 44144
CK Π 43 0100 2133 2133
　　经 EMS 和 NaN3 处理的 PLB 早期长势十分缓慢 ,1
周后部分开始出现白化现象 ,接着出现褐化现象 ,并逐
渐导致 PLB 死亡 (图 121) 。各处理的诱变结果见表 1
和表 2。从表中可以看出对照 PLB 并无白化现象 ,而
经 EMS 和 NaN3 诱变后的 PLB 部分出现了白化现象。
经 EMS 和 NaN3 诱变后的褐化率明显高于对照组 ,并
随 EMS 和 NaN3 浓度升高 PLB 的褐化率升高明显 ,说
明 EMS 和 NaN3 有导致 PLB 褐化增多的作用。
随着 EMS 和 NaN3 浓度升高 ,处理后的 PLB 的死
亡率也随之增大 ,014 %EMS 处理 6～8h ,接近或达到
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图 1 　不同处理对 PLB 细胞的影响
Fig. 1 　The effect of different treatments on PLB cell
1 :诱变后的类圆球茎 (白化的 PLB ,褐化的 PLB , φ ) ;2 :晶体物质 ×55 ;3 : PLB 细胞中的小球体 ×44 ;4 :核劈裂 ×63 ;5 :核仁消失 ×80 ;6 :柱形核 ×
100 ;7 :四核细胞×70 ;8 :微核 ( φ ) ×100 ;9～10 :手形、帽形×84、×110 ;11 :微核 ( φ ) ×74 ;11 :核破裂×90
1 : PLB after induced mutagenesis (Albino PLB ,Brown PLB , φ ) ; 2 : Crystalloid ×55 ; 3 : Spherule in cell of PLB ×44 ; 4 : Karyon split ×63 ; 5 : Nucleolus
missing ×80 ; 6 : Spar karyon ×100 ; 7 : Four karyon cell ×70 ; 8 : Micronuclei ( φ ) ×100 ; 9～10 : Hand shape and hat shape karyon ×84 , ×110 ; 11 : Micronuclei
( φ ) ; 12 : Karyon rupture ×90
接种类圆球茎的半致死剂量 (LD50 ) ,而在本试验中 NaN3 各浓度均未达到半致死剂量。可见 ,对于蝴蝶兰
101　2 期 蝴蝶兰类圆球茎的化学诱变试验
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类原球茎 ,EMS 的诱变效果要好于 NaN3 。同一处理浓
度的同种诱变剂随处理时间 (4、6 和 8h) 的增加 ,死亡
率增加明显 ,经细胞学观察 ,材料的细胞核变异程度有
所增加 ,但不显著 ,可见诱变剂的剂量比处理时间对诱
变的影响大。
从表 1 看 ,015 %EMS 比 014 %EMS 诱变后的 PLB
死亡率还小 ,可能是所选材料大小不一致造成的。不
同大小的 PLB 对同种浓度的 EMS 或 NaN3 的敏感性也
不相同 ,较小的 PLB 对 EMS 和 NaN3 的敏感性较强 ,较
大的 PLB 对 EMS 和 NaN3 的敏感性较弱。因此 ,材料
大小是否均一 ,也会影响试验数据。
212 　不同处理对 PLB 细胞的影响
切片观察发现 : EMS 和 NaN3 均有使细胞增大 ,细
胞形状变得极不规则 ,原生质分布极不均匀并且有原
生质体浓缩等现象。但低浓度的处理 ( EMS : 012 %、
013 % ;NaN3 : 2mmolΠL、3mmolΠL) 现象不明显 , CK 无此
现象。
经 4mmolΠL 和 5mmolΠL NaN3 处理的 PLB 细胞中均
出现了晶体物质 ,有层状 ,放射状 ,竹状等 (图 122) 。多
数晶体物质分布在 PLB 的近边缘细胞中 ,可能因为近
边缘细胞较易直接接触诱变剂。类晶体物质的成分则
尚待研究。
014 %EMS 处理 4h 的 PLB 细胞中出现许多小球
体 ,这些小球体有的呈团状分布 ,有的沿细胞边缘分布
(图 123) 。
表 3 　不同处理对细胞核的诱变效应
Table 3 　Effect of induced mutagenesis to karyon by different treatments
诱变剂及浓度
chemical mutagen
and concentration
诱变效应
effect of induced mutagenesis
4mmolΠL NaN3 有少数畸形核 ,主要是裂核 (图 124) ,极少数细胞核产生破裂现象 ,细胞核变异不大
a few abnormal cell nuclei , mainly karyon split (Fig. 124) , very few nuclei had broken phenomenon , the variation rate of cell nucleus wasn’t high
5mmolΠL NaN3 有部分畸形核 ;少数细胞核仁丢失 (图 125)
parts of abnormal nuclei ; A few cell nuclei missed nucleolus (Fig. 125)
014 %EMS 有较多畸形核 ,如柱形 (图 126) 、裂核等奇特形状 ;有双核、三核、四核细胞 (图 127) ;出现核裂现象 ;有较少细胞出现微核 ,微核率
9 %(图 128)
more abnormal nuclei , such as the spar shape (Fig. 126) , karyon split etc ; There were double nuclei , three nuclei and four nuclei cells (Fig. 12
7) ; Appeared the karyon split phenomenon ; A few cells appeared micronuclei , the rate was 9 %(Fig. 128)
015 %EMS 有很多畸形核 ,如 :手形、帽形、蝶形、裂核等奇特形状 (图 129、1210) ;有些细胞出现双核、三核、四核 ;有较多细胞出现微核 ,微核率
34 %(图 1211) ;有核破裂现象 (图 1212)
a lot of abnormal nuclei , such as hand shape , hat shape and butterfly shape etc. unusual shape (Fig. 129 and 1210) ; some cells appeared double
nuclei , three nuclei and four nuclei ; a lot of nuclei appeared micronuclei , the rate was 34 %(Fig. 1211) ;There was karyon split phenomenon (Fig.
1212)
　　诱变剂对细胞核的诱变效果非常显著。从表 3 可
见 ,随诱变剂浓度的增加 ,细胞核变异程度增大 ,015 %
EMS 处理的 PLB 细胞中细胞核变异最大。从核的变
异效果来看 ,EMS 的诱变效果也比 NaN3 好。
在再生培养基上培养 2 个月后 ,经诱变处理的
PLB 可以扩增 ,部分再生成苗。对瓶中再生苗观察 ,经
EMS和 NaN3 处理的再生苗与对照相比未见明显的形
态变异。
3 　讨论
经诱变处理后的部分类圆球茎 ( PLB) 出现白化现
象可能因为诱变剂阻碍 PLB 叶绿素的生物合成 ,使其
不能再产生叶绿素 ,使 PLB 白化最后致死 ,其详细机
理有待进一步研究。
微核 (micronuclei)简称 MCN ,是真核类生物细胞中
的一种异常结构 ,往往是细胞经辐射或化学药物的作
用而产生的。已经证实微核的多少是和用药的剂量或
辐射积累效应呈正相关。所以 ,许多人认为可用简易
的微核测试来推测诱变物质对人类或其他高等生物的
遗传危害。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐
射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传
疾病及癌症前期诊断等各方面[9 ] 。本试验中经 014 %
～015 %EMS 处理后的 PLB 细胞微核可达 9 %～34 % ,
而其他处理则几乎不产生微核 ,可能是因为其他处理
的诱变剂浓度不够高或处理时间不够长。因此 ,可将
015 %EMS 作为创造蝴蝶兰 PLB 突变体的参考浓度。
此 EMS 浓度与其在小麦上的最佳诱变浓度相同[10 ] ,但
低于菊花花梗诱导的不定芽半致死浓度[11 ] 。
(下转第 98 页)
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顷含糖量比 CK2 增加糖 817 %。桂糖 95253 比 CK1 略
增糖 ,公顷含糖量与 CK2 持平。L75220、桂糖 94238、粤
糖 922373、桂糖 94263、桂糖 94277 均比 CK1 和 CK2 减
糖 ,减幅在 1718 %～219 %[4 ] 。
3 　小结与讨论
桂糖 22 号是利用60 Coγ辐射诱变育成的一个新
品种。甘蔗是用种茎芽进行无性繁殖的作物 ,通过辐
射诱变后获得的基因型变异在下一代一般能稳定遗
传 ,因此 ,辐射育种与常规育种比较 ,一是不用诱导双
亲开花进行杂交 ,获得后代杂种群体的周期短 ,能节约
空间和时间 ;二是田间的工作量大大减少 ;三是诱导体
细胞发生基因突变或染色体畸变 ,使某些不良形状得
到改良 ,而又不改变原品种所具有的优良性状[5 ] 。根
据我们多年的实践经验 ,尽量选择优良性状多 ,不良性
状少 ,通过理化诱变技术有改变不良性状可能性的品
(系)种、材料为处理对象 ,是选育新品种能否成功的关
键。所以 ,我们选择新台糖 1 号这个具有中大茎、早
熟、高糖、高产等优点和分蘖性差、宿根性差等缺点的
品种作为诱变处理材料能基本上符合预期要求。
桂糖 22 号是我国以糖能兼用定位申请通过省级
审定的第 1 个甘蔗品种。该品种不仅具有生长快 ,高
产、含糖量高、生物产量高、可发酵糖量高等特点 ,而且
有宿根性好 ,适应性广等优点 ,其区试生物产量新宿平
均为 15218t ,最高达 18811 t ,超过了 150 t 的标准指
标[1 ] 。可发酵糖新宿平均为 39173 t ,最高达 48192t ,也
超过 39 t 的标准指标[1 ] ,是一个既可做糖蔗又可做能
源蔗的甘蔗优良新品种。
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(上接第 102 页)
　　本文主要通过观察诱变后的类圆球茎 ( PLB) 及其
细胞与细胞核的畸变 ,分析了甲基磺酸乙酯 ( EMS) 和
叠氮化钠 (NaN3 )对蝴蝶兰类圆球茎的生理损伤和诱变
效应。以上 2 种诱变剂对蝴蝶兰的形态诱变效应 ,如
再生蝴蝶兰成苗的形态、花形和花色等其他表型特征
研究正在进行。
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