全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 012025205
冷处理对中国水仙鳞茎及其不定芽分化
过程中生理生化代谢的影响
庄晓英1 　邹清成1 　卢　钢1 　江鸿飞2
(1. 浙江大学园艺系 ,浙江 杭州　310029 ;21 浙江舟山普陀区农业局 ,浙江 舟山　316100)
摘 　要 :以 2～3 年生中国水仙鳞茎为材料 ,研究了冷处理对水仙鳞茎生理状态的影响以及不定芽分化过
程生理生化代谢的变化。冷处理降低了中国水仙鳞茎的总糖、蔗糖以及淀粉含量 ,还原糖和可溶性蛋白
含量以及 POD、CAT等活性也显著升高 ,这些生理变化与冷处理后鳞茎盘分化所需时间缩短及分化能力
增强有关 ;处于不同分化时期鳞茎盘的抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量随培养时间的延长 ,均表现为先
升高后降低的变化趋势 ,在接种后 4～10d 达到峰值 ,可以初步确定抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的
规律性变化与鳞茎盘的分化相关。
关键词 :中国水仙 ;冷藏处理 ;碳水化合物 ;抗氧化酶 ;可溶性蛋白
PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL EFFECTS OF COLD TREATMENT ON Narcissus tazetta L.
var. chinensis ROEM AND SHOOTS OCCURRENCE DIFFERENTIATION
ZHUANG Xiao2ying 　ZOU Qing2cheng 　LU Gang 　J IANG Hong2fei
(11Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ; 21Agriculture Bureau of Putuo , Zhoushan , Zhejiang 　316100)
Abstract :Using 2～3 year , bulbs in Chinese narcissus (Narcissus tazetta var Chinensis) as material , the effect of cold-
treatment on the physiology state of bulbs and the changes in some physiological and chemical characters during the shoots
differentiation in vitro were studied. Pretreat ment of the bulbs under 4 ℃decreased total sugar , starch and sucrose , but
increased reducing sugar , soluble proteins , and the activities of POD and CAT , which can account for the high rate of
regeneration of basal plates when pretreated at 4 ℃ lasting 40 days. During the stage of differentiation , the activities of
antioxidases and the content of soluble proteins increased first and then decreased , after 6～10 days of inoculation all come to
the maximum , which was identical to the results by cytological observation , indicating that the development of shoot is
correlated with the change of antioxidases and soluble proteins.
Key words : Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem ;cold storage ;carbohydrate ;antioxidases ;soluble proteins
收稿日期 :2006204214
作者简介 :庄晓英 (19782) ,女 ,山东人 ,硕士 ,研究方向为植物细胞与分子生物学 ,Tel :0571286971722 ; E2mail :xyzhuang @1261com
通讯作者 :卢钢 (19682) ,男 ,浙江东阳人 ,副教授 ,博士 ,研究方向为植物细胞与分子生物学 ,Tel :0571286971722 ; E2mail :glu @zju. edu. cn　　中国水仙 ( Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem)隶属石蒜科水仙属 ,是中国十大传统名花之一。近年来有不少中国水仙组织培养方面的报道 ,对不同外植体的分化能力以及影响外植体再生效率的诸多因子进行了研究[1～5 ] 。但关于鳞茎盘组织培养过程中的生理生化变化还未见报道。本研究初步探讨了组培材料选择的生理基础 ,鳞茎盘上不定芽形态发生与生理生化变化之间的协调关系 ,为中国水仙高效遗传转化体系 的建立提供生理生化方面的依据。1 　材料与方法111 　水仙鳞茎采自浙江舟山地区 2～3 年生的中国水仙鳞茎作为供试材料 ,置于冰箱中 4 ℃下冷处理 40d ,以未经冷处理的水仙鳞茎为对照。
52　核 农 学 报　2007 ,21 (1) :25～29Journal of Nuclear Agricultural Sciences
112 　不定芽的获取
水仙鳞茎消毒处理以及离体培养的过程参见庄晓
英等[6 ]的方法进行 ,获得离体培养不定芽。
113 　分析测定
11311 　鳞茎不同部位碳水化合物含量的测定 　切取
冷处理水仙鳞茎的鳞茎盘外部和中部鳞片各 1cm ,准
确称量 15g ,装入信封 ,烘箱中 105 ℃杀青 2h ,70 ℃烘干
至恒重。然后将干样用粉碎机磨成细粉 ,用以测定碳
水化合物含量。糖和淀粉的测定参考薛应龙[7 ] 的方法
并略作改动。
11312 　抗氧化酶活力和可溶性蛋白含量测定 　材料 1
为冷处理鳞茎的鳞茎盘和鳞片。材料 2 是处于不同分
化时期的鳞茎盘 ,取样时 ,分别取消毒处理前、后以及
接种 0 (CK) 、1、2、3、4、6、8、10、15、25d 和转接后 6d (即
接种后 31d)的组织培养材料。
酶液提取参考朱祝军等[8 ] 的方法 ,超氧化物歧化
酶 (SOD)活性的测定参照氯化硝基四氮唑蓝 (NBT) 还
原法[9 ] ,过氧化物酶 ( CAT) 、愈创木酚过氧化物酶
(POD)活性的测定分别按 Cakmak[9 ] 和 Cakmak[10 ] 的方
法 ,抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 活性的测定用修改的
Nakano 等[11 ]的方法 ,多酚氧化酶 ( PPO) 活性的测定参
照 Oostendorp [12 ]的方法略有改动。可溶性蛋白含量测
定参照 Bradford[13 ]的方法。
11313 　可溶性蛋白的电泳分析 　取接种 0、1、2、3、4、
6、8、10、15 、25d 带鳞片的鳞茎盘为材料 ,用 Tris2HCl 抽
提缓冲液按常规方法提取可溶性蛋白并进行 SDS2
PAGE电泳分析。
2 　结果与分析
211 　离体不定芽发生过程的形态变化
外植体接种到诱导培养基上后 ,主要表现为外植
体膨大 ,接种 5d 时 ,鳞片叶展开 ,边缘出现白色愈伤组
织 ,15d 时 ,在少数叶腋处可观察到白色的突起。25d
时转接到分化培养基上 ,膨大趋于停止 ,逐渐进入丛生
芽旺盛发生阶段。转接 6d 后叶腋处产生大量的突起 ,
原来的突起形成芽。
212 　冷处理对鳞茎盘和鳞片中生理生化的影响
21211 　碳水化合物含量的变化 　冷处理作为打破水
仙鳞茎休眠 ,降低水仙组培过程中褐化率、污染率的一
种手段 ,也使鳞茎内部发生相应的生理生化变化。由
图 1 可以看出 ,冷处理使水仙鳞茎的蔗糖、可溶性总
糖、淀粉含量不同程度地降低 ,其中在鳞茎盘和鳞片中
蔗糖、淀粉含量均极显著降低 ,可溶性总糖在鳞茎盘中
变化不明显 ,在鳞片中显著降低 ;还原糖的含量冷处理
后在鳞茎盘和鳞片叶中均明显升高 ,与对照相比达到
显著水平。
图 1 　冷处理对鳞茎盘和鳞片中碳水化合物含量的影响
Fig. 1 　Effects of cold treatments on the content of carbohydrate in basal plates and scales
a ,b 表示 5 %水平上差异显著. 下图同
a , b represent significant differencesat α= 01051 The same as following figures
62 核　农　学　报 21 卷
　　将以上试验结果与水仙鳞片分化难 ,鳞茎盘分化
容易 ,冷处理后的鳞茎盘分化所需时间缩短和分化能
力增强相对应 ,可以初步认为还原糖含量的变化不仅
仅是生理年龄的一种表现和对冷处理作出的适应性反
应 ,而且可以作为衡量分化能力的一个重要指标。
21212 　POD、CAT活性的变化 　POD 和 CAT广泛存在
于植物中 ,其功能多种多样 ,在植物不同生长发育时期
和不同组织器官内 ,活性和酶谱带有很大变化。由图
2 可以看出 ,在鳞茎盘和鳞片中 ,POD 和 CAT活性变化
趋势大致相同 ,鳞茎盘高于鳞片。经冷处理后的鳞茎 ,
POD 活性在鳞茎盘中显著提高 ,鳞片叶中提高不显著 ;
CAT活性在鳞茎盘和鳞片中均显著提高 ,这可能是冷
处理使组织内部产生大量的 H2O2 ,生理调节的需要使
POD、CAT酶的合成加速 ,避免对植物体产生毒害作用
的结果。
图 2 　冷处理对鳞茎盘和鳞片中 POD、CAT活性的影响
Fig. 2 　Effects of cold treatment on the activities of POD and CAT in basal plates and scales
21213 　可溶性蛋白含量的变化 　冷处理后鳞茎盘和
鳞片中可溶性蛋白的含量均较对照显著提高 ,可溶性
蛋白的变化与分化能力表现一致 ,可以初步认为可溶
性蛋白含量的提高有利于水仙外植体不定芽的分化
(图 3) 。
图 3 　冷处理后鳞茎盘和鳞片中可溶性蛋白含量的变化
Fig. 3 　Contents of the soluble proteins in basal plates
and scales after cold treatment
213 　鳞茎盘不定芽分化过程中的生理生化变化
21311 　抗氧化酶活性的变化 　如图 4 所示 ,处于不同
分化时期的鳞茎盘抗氧化酶活性的变化大致相同 ,均
表现为先升高后降低。在培养过程中 ,鳞茎盘 SOD 活
性在分化准备期表现出平稳的强势表达 ,接种 1d 后活
性急剧增强 ,在 15d 前 (即在叶腋中可以肉眼观察到白
色芽点以前)都很高 ,但从 15～31d (转接后 6d) 活性又
逐渐降低。这可能是由于外植体切割损伤和培养基的
激素水平较高 ,导致外植体内活性氧增加 ,SOD 的增加
用以清除过剩的自由基 ,而当接种 15d 后芽开始分化
出来 ,外植体已经可以通过内部状态协调培养环境 ,
SOD 的活性又有所降低 ,甚至比接种前更低。
CAT、POD、APX的活性在接种 2d 后急剧升高 ,8～
10d 达到表达峰值 ,从第 10d 到转接前降低 ,转接后又
有所回升 ,但 CAT表现为转接后活性的持续降低 ;PPO
的活性在 4d 时就达到最高值 ,之后随着培养时间的延
长 ,一直到转接后 6d 都表现为比较低的活性水平。将
以上结果与鳞茎盘分化过程中的细胞学观察相结合 ,
初步认为 PPO 的活性变化更多与外植体切割损伤有
关 ,其他 4 种酶的活性变化可能是鳞茎盘分化过程中
内部生理变化的直接反应 (图 4) 。
21312 　可溶性蛋白含量的变化 　由图 5 可见 ,在鳞茎
盘的分化准备阶段 ,可溶性蛋白含量升高 ,在 4～15d
内都维持一个较高的水平 ,从 15～25d 又急剧下降 ,转
接到新鲜培养基后 ,含量又有所升高。
21313 　可溶性蛋白凝胶电泳分析 　处于不同分化时
期的鳞茎盘中可溶性蛋白的 SDS2PAGE 凝胶电泳谱带
都很丰富 (图 6) ,但由于所用电泳槽太短 ,片断没有明
显分开 ,能够观察到的差异不多 ,只在接种 4d 时 ,有一
72　1 期 冷处理对中国水仙鳞茎及其不定芽分化过程中生理生化代谢的影响
条大于 60KD 的谱带出现 ,并且随着培养时间的延长 ,
表达增强。
图 4 　不同分化时期鳞茎盘中活性的变化
Fig. 4 　Dynamic changes in the activities of during the
differentiation of basal plates
A :SOD ;B :CAT;C:POD ;D :APX; E:PPO
图 5 　不同分化时期鳞茎盘中可溶性蛋白含量的变化
Fig. 5 　Contents of the soluble proteins in basal plates
during the different differentiation stages
图 6 　鳞茎盘不定芽分化过程中可溶性蛋白的
SDS - PAGE凝胶电泳
Fig. 6 　SDS2PAGE gel electrophoresis of the soluble
protein during different differentiation stages
M为分子量标记 ; CK为接种前水仙鳞茎盘 ;
数字表示水仙鳞茎盘接种后的天数
M is protein weight marker ; CK is untreated scales ;
the number represents the days after inoculation
3 　讨论
高效离体再生体系的建立 ,不仅依赖于合适的培
养基 ,外植体的选择也是关键。不同年龄的水仙鳞茎
盘与鳞片的分化能力都不相同。从以上试验结果不难
看出 ,外植体分化能力的高低有其生理生化基础 ,还原
糖、可溶性蛋白含量的提高 , POD、SOD 活性的升高有
利于外植体的分化。低温预处理作为打破中国水仙鳞
茎休眠的一种手段 ,在离体培养中也被证明是缩短再
生周期、提高再生频率的关键条件[14～16 ] 。本试验结果
表明 ,水仙冷处理过程伴随着碳水化合物形式的转变 ,
在蔗糖、可溶性总糖、淀粉含量降低的基础上 ,还原糖
的含量在鳞茎盘中极显著升高 ,鳞茎内生理活动变得
82 核　农　学　报 21 卷
活跃 ,POD、CAT 的活性均显著升高 ,作为植物细胞结
构中最重要成分的蛋白质含量也较对照显著升高。经
冷处理的鳞茎盘分化所需时间缩短 ,分化能力增强 ,说
明这些物质和酶活性的变化是作为信号或能量在起作
用 ,这些变化与水仙外植体分化的启动有关。有研究
表明百合在冷藏过程中 ,碳水化合物从淀粉转化为可
利用的可溶性糖 (蔗糖、还原糖) ,过氧化物酶活性和过
氧化物同工酶的数量多于休眠鳞茎 ,可溶性蛋白的含
量升高[15 ,17 ] 。
在植物组织离体培养过程中 ,自 Galston 等[18 ] 最早
研究烟草髓部愈伤组织的分化与过氧化物同工酶的关
系以来 ,人们在这一领域又进行了许多研究 ,发现外植
体的生长、脱分化、分化与可溶性蛋白含量、过氧化物
酶活性、同工酶等的变化有关[19～21 ] 。本试验以处于不
同分化时期的水仙鳞茎盘为材料 ,探讨了不定芽发生
过程中生理生化的变化。随着鳞茎盘培养时间的延
长 ,可溶性蛋白质含量、POD、SOD、APX、CAT、PPO 活性
均呈上升趋势 ,在 4～10d 达到峰值 ,以后随培养时间
的延长有所降低。说明在分化准备阶段细胞中代谢活
动逐渐旺盛 ,随着分化进程的推进 ,组织内部的细胞完
成从薄壁细胞到分生细胞的转变后 ,各种变化趋于回
落。作者曾对鳞茎盘不定芽分化进行了细胞学观察 ,
结果表明在第 7 天时在石蜡切片上可以观察到被叶原
基包被的芽 ,此时大部分薄壁细胞则完成了向分生细
胞转变[22 ] 。所以我们认为 CAT、POD、APX的活性以及
可溶性蛋白含量的变化与不定芽的发生存在一定的相
关性 ,其活性或含量的升高可能与鳞茎盘内部薄壁细
胞向分化细胞的转变有关。作者认为生理特性的变化
在一定程度上可作为形态分化的生理指标 ,但其内在
联系尚需进一步研究。
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